Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 9723:2013 (ISO 20481:2008) về Cà phê và sản phẩm cà phê- Xác định hàm lượng cafein bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) - Phương pháp chuẩn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9723:2013

ISO 20481:2008

CÀ PHÊ VÀ SẢN PHẨM CÀ PHÊ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Coffee and coffee products – Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography (HPLC) – Reference method

Lời nói đầu

TCVN 9723:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 20481:2008;

TCVN 9723:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F16 Cà phê và sản phẩm cà phê biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

CÀ PHÊ VÀ SẢN PHẨM CÀ PHÊ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Coffee and coffee products – Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography (HPLC) – Reference method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng cafein của: cà phê nhân; cà phê rang; cà phê hòa tan, loại thông thường và loại đã tách cafein; các sản phẩm cà phê hòa tan hỗn hợp (ví dụ: hỗn hợp cà phê/chicory (rễ rau diếp xoăn) hoặc đồ uống từ cà phê kiểu capuccino).

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 2230 (ISO 565), Sàng thử nghiệm – Lưới kim loại đan, tấm kim loại đột lỗ và lưới đột lỗ bằng điện – Kích thước lỗ danh nghĩa

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 5567 (ISO 3726), Cà phê hòa tan – Phương pháp xác định hao hụt khối lượng ở nhiệt độ 70 ^oC dưới áp suất thấp

TCVN 6928 (ISO 6673), Cà phê nhân – Xác định hao hụt khối lượng ở 105 ^oC

TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Pipet một mức

TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức

TCVN 9721 (ISO 11817), Cà phê rang xay – Xác định độ ẩm – Phương pháp Karl Fischer (Phương pháp chuẩn)

3. Nguyên tắc

Cafein được chiết ra khỏi mẫu bằng nước 90 ^oC với sự có mặt của magie oxit. Sau khi lọc, hàm lượng cafein của dịch chiết được xác định bằng HPLC trên cột RP-18, dùng phương pháp rửa giải đẳng dòng, sử dụng detecter UV ở bước sóng khoảng 272 nm.

Khi thích hợp, hàm lượng cafein có thể tính theo chất khô và độ ẩm được xác định bằng phương pháp chuẩn phù hợp.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với yêu cầu loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696) trừ khi có quy định khác.

4.1. Metanol, loại dùng cho HPLC.

4.2. Magie oxit (MgO), loại nặng, có chất lượng cao

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng MgO rất quan trọng đối với tuổi thọ của cột phân tích, đặc biệt trong phân tích cà phê nhân. Lượng MgO được sử dụng tùy thuộc vào thiết bị và dạng sản phẩm cà phê. Dữ liệu về độ chụm trong Phụ lục A thu được bằng quy trình mô tả trong tiêu chuẩn này.

Việc xuất hiện các pic gây nhiễu trong sắc đồ có thể do hấp thụ không đúng. Trong trường hợp này, cần kiểm tra MgO đã sử dụng.

4.3. Cafein (1,3,7-trimetylxantin; 1,3,7-trimetyl-1H-purin-2,6(3H,7H)-dion; metyltheobrom; C₈H₁₀N₄O₂), dạng khan tinh khiết.

4.4. Pha động, 24 % phần thể tích metanol trong nước.

CHÚ Ý AN TOÀN – Đeo găng tay, kính bảo vệ mắt và phân phối các thuốc thử trong buồng hút khói tốt.

Chuyển 240 ml metanol (4.1) vào bình định mức một vạch 1 lít (5.11). Thêm nước đến vạch, trộn và lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.2).

CHÚ THÍCH: Thời gian lưu của cafein có thể được chỉnh để tối ưu hóa việc tách HPLC trên cột được sử dụng bằng cách thay đổi tỷ lệ metanol với nước.

4.5. Dung dịch chuẩn cafein.

4.5.1. Dung dịch gốc, tương ứng với 200 mg/l

Cân (0,200 ± 0,100) g cafein dạng khan (4.3) vào bình định mức một vạch 1 lít (5.11). Thêm nước ấm đủ đến nửa bình. Xoay bình để hòa tan cafein, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến vạch và trộn.

Dung dịch có thể bền trong một tháng khi được bảo quản ở +4 ^oC. Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh.

4.5.1. Dung dịch chuẩn pha loãng đối với cà phê thông thường, tương ứng với khoảng 40 mg/l

Dùng pipet (5.12) lấy 50 ml dung dịch chuẩn gốc cafein (4.5.1) cho vào bình định mức một vạch 250 ml (5.11). Thêm nước đến vạch và trộn. Chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng mới trong ngày sử dụng.

4.5.3. Dung dịch chuẩn pha loãng đối với cà phê đã tách cafein, tương ứng với khoảng 4 mg/l

Dùng pipet (5.12) lấy 5 ml dung dịch chuẩn gốc cafein (4.5.1) cho vào bình định mức một vạch 250 ml (5.11). Thêm nước đến vạch và trộn. Chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng trong ngày sử dụng.

4.5.4. Đường chuẩn. Việc sử dụng từ ba đến năm điểm trên đường chuẩn là tùy chọn. Dải nồng độ được khuyến cáo là từ 5 mg/l đến 25 mg/l đối với các mẫu cà phê thông thường và từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l đối với các mẫu đã tách cafein.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1. Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến ± 0,1 mg.

5.2. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 µm, để lọc pha động và các dịch chiết mẫu pha loãng.

5.3. Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao, được trang bị để thực hiện rửa giải đẳng dòng, có detector UV được cài đặt ở 272 nm (270 nm đến 280 nm) hoặc detector có bộ lọc (254 nm) và có hệ thống thu nhận/tích phân dữ liệu. Việc sử dụng bộ khử khí là tùy chọn.

5.4. Cột sắc ký dùng cho HPLC, dài tối thiểu 125 mm, được nhồi bằng vật liệu C18, tốt nhất là hạt hình cầu có cỡ 5 µm, hiệu quả tách ít nhất 5 000 đĩa lý thuyết. Số đĩa lý thuyết của cột, N_th có thể tính được bằng cách xác định diện tích pic sau khi bơm dung dịch chuẩn cafein, bằng Công thức (1):

N_th =                                                         (1)

Trong đó:

t_r là thời gian lưu của pic, tính bằng giây (s);

blàchiều rộng pic, tại nửa chiều cao pic, tính bằng giây (s).

5.5. Máy khuất từ, có bộ phận gia nhiệt và nồi cách thủy.

5.6. Bể siêu âm.

5.7. Xiranh microlit.

5.8. Máy xay cà phê, phù hợp để xay nhân cà phê rang.

5.9. Máy xay với bánh xe có răng, có túi làm lạnh, hoặc máy nghiền phân tích, có lưỡi dao và túi làm lạnh hoặc dụng cụ phù hợp khác để xay nhân cà phê nhân.

5.10. Sàng, cỡ lỗ danh định 630 µm, phù hợp với các yêu cầu trong TCVN 2230 (ISO 565), dãy R 20.

5.11. Bình định mức một vạch, dung tích 1 lít và 250 ml, phù hợp với loại A của TCVN 7153 (ISO 1042).

5.12. Pipet, dung tích 50 ml và 5 ml, phù hợp với loại A của TCVN 7151 (ISO 648).

6. Lấy mẫu

Phòng thử nghiệm phải nhận được mẫu đại diện. Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Các bên có liên quan cần thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

Bảo quản mẫu thử sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và thay đổi thành phần.

Trong trường hợp bột uống hỗn hợp, cần tối thiểu 50 g sản phẩm (đối với các bao gói chia nhỏ: tối thiểu năm bao gói).

7. Chuẩn bị mẫu thử

7.1. Cà phê nhân

Dùng máy nghiền (5.9) nghiền nhân cà phê nhân sao cho 50 % phần khối lượng của mẫu lọt qua sàng (5.10). Sau đó lấy mẫu thử từ toàn bộ cà phê bột đã được trộn kỹ.

7.2. Cà phê rang

Dùng máy xay (5.8) xay nhân cà phê rang sao cho trên 50 % khối lượng lọt qua sàng (5.10).

Dùng luôn cà phê rang xay bao gói bán sẵn mà không cần xử lý thêm và đồng hóa mẫu.

7.3. Cà phê hòa tan

Đối với cà phê hòa tan thì không cần xay.

7.4. Đồ uống hỗn hợp

Dùng máy xay (5.8) đồng hóa bột uống cà phê hỗn hợp ngay trước khi chiết để tránh bị tách rời.

8. Cách tiến hành

8.1. Phép xác định tùy chọn chất khô của cà phê (xem 9.2)

Tính hàm lượng chất khô cà phê được sử dụng trong 9.2 từ độ ẩm xác định được trên phần mẫu thử (Điều 7) theo:

- TCVN 6928 (ISO 6673) đối với cà phê nhân,

- TCVN 9721 (ISO 11817) đối với cà phê rang,

- TCVN 5567 (ISO 3726) đối với cà phê hòa tan.

Đối với các dạng khác của cà phê và các sản phẩm có nguồn gốc từ cà phê, thì các bên có liên quan cần thỏa thuận phép xác định hàm lượng chất khô.

8.2. Phần mẫu thử

8.2.1. Cà phê rang và cà phê nhân

Dùng cân (5.1) cân khoảng 1 g mẫu thử (7.1, 7.2) chính xác đến miligam và chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11).

8.2.2. Cà phê hòa tan

Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,5 g mẫu thử (7.3) chính xác đến miligam và chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11).

8.2.3. Đồ uống hỗn hợp

Dùng cân (5.1) cân khoảng 1 g mẫu thử (7.4) chính xác đến miligam và chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11).

8.3. Chiết cafein

Thêm 5 g magie oxit (4.2) và khoảng 200 ml nước vào phần mẫu thử (8.2.1, 8.2.2 hoặc 8.2.3) đựng trong bình định mức. Đặt bình vào nồi cách thủy được duy trì ở điểm sôi và chờ cho đến khi dung dịch đạt đến ít nhất 90 ^oC. Tiếp tục gia nhiệt bình trong nồi cách thủy trong 20 min, thỉnh thoảng trộn lượng chứa trong bình bằng cách khuấy hoặc lắc bình. Lấy bình ra khỏi nồi cách thủy, làm nguội đến nhiệt độ phòng dưới vòi nước và thêm nước đến vạch. Chờ cho đến khi chất rắn lắng xuống.

Lấy phần dịch lỏng nổi phía trên và lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.2), loại bỏ vài mililit đầu tiên. Dịch lọc này được dùng để tách bằng HPLC.

8.4. Xác định

8.4.1. Chỉnh thiết bị

ĐIỀU QUAN TRỌNG – Pha động phải được khử khí 20 min trong bể siêu âm (5.6) hoặc thanh lọc bằng heli trước khi sử dụng. Nếu thiết bị HPLC có bộ khử khí, thì 10 min là đủ.

Cài đặt máy sắc ký (5.3) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và chỉnh như sau:

a) tốc độ dòng của pha động (4.4): 1,0 ml/min;

b) detector UV cài đặt ở 272 nm (hoặc 254 nm trong trường hợp detector có bộ lọc). Đảm bảo rằng phạm vi nhạy của detector phù hợp với pic của dung dịch chuẩn (trong trường hợp nhiều hơn một chất chuẩn, thì theo pic cao nhất).

8.4.2. Phân tích HPLC

Khi tốc độ dòng của pha động và áp suất tương ứng ổn định, để cho hệ thống cân bằng trong ít nhất 10 min. Sau đó bơm 10 µl dung dịch chuẩn lên cột, dùng xyranh microlit (5.7), trong lần chạy sau đó, bơm tiếp một thể tích tương tự của dịch chiết mẫu (8.3). Khi sử dụng dung dịch chuẩn đơn lẻ, thì bơm với các khoảng cách đều đặn (thông thường cứ sau sáu lần bơm dịch chiết mẫu thì bơm một lần). Sau mỗi mẻ phân tích, rửa kỹ hệ thống sắc ký cùng với cột bằng metanol 50 % thể tích (4.1) và nước, đậy nút cột để bảo quản nếu không tiếp tục dùng.

9. Tính kết quả

9.1. Hàm lượng cafein trong mẫu

Tính hàm lượng cafein, w_x, được biểu thị phần trăm khối lượng, tương đương với gam trên 100 g cà phê, theo Công thức (2):

w_x =             (2)

Trong đó:

A_c là diện tích pic cafein của dung dịch chuẩn cafein xác định bằng HPLC, tính bằng đơn vị diện tích;

A_x là diện tích pic cafein của dung dịch mẫu xác định bằng HPLC, tính bằng đơn vị diện tích;

m_s là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích dung dịch mẫu chiết được, xác định được trong 8.2 (V = 0,25 l), tính bằng lít (l);

ρ_c là nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn cafein, tính bằng gam trên lít (g/l).

CHÚ THÍCH: Chiều cao pic có thể được sử dụng để thay cho diện tích pic.

Nếu sử dụng nhiều hơn một chuẩn hiệu chuẩn thì dựng đường chuẩn tuyến tính đối với các nồng độ chuẩn cafein, để thu được độ dốc và giá trị chắn. Sử dụng đường chuẩn này để tính nồng độ cafein trong mẫu.

Lấy kết quả là giá trị trung bình của hai lần xác định tiến hành dưới các điều kiện lặp lại (10.2).

9.2. Phép xác định tùy chọn hàm lượng cafein trong mẫu theo chất khô (xem 8.1).

Tính hàm lượng cafein, w’_x, theo phần trăm khối lượng, tương ứng với số gam trên 100 g chất khô, bằng Công thức (3):

w’_x =                       (3)

trong đó w_d là hàm lượng chất khô của mẫu (gam trên 100 g), như xác định được trong 8.1.

Lấy kết quả là giá trị trung bình của hai lần xác định tiến hành dưới các điều kiện lặp lại (10.2).

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các kết quả chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm để xác định độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các kết quả về cafein được đưa ra theo loại cà phê.

Các giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập như định nghĩa trong 3.16 và 3.20 của TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) ^[2], tương ứng, được tính theo 4.14 của TCVN 6910-6:2002 (ISO 5725-6:1994) ^[4].

Để ước tính giới hạn tái lập Horwitz, sử dụng hàm Horwitz như trong Tài liệu viện dẫn [6].

Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các giá trị đã nêu.

Dữ liệu về độ chụm được đánh giá theo TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Giá trị trung bình, giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử nghiệm độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, trên cùng vật liệu thử, trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % (nghĩa là độ lặp lại ở xác suất 95 %) các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn lặp lại, r, nêu trong Bảng 1.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % (nghĩa là độ tái lập ở xác suất 95 %) các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn tái lập, R, nêu trong Bảng 1.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;

b) phương pháp sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) kết quả thử nghiệm thu được;

d) nếu kiểm tra về độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được;

e) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm của nghiên cứu đánh giá xác nhận phương pháp xác định cafein trong cà phê và sản phẩm cà phê

Bảng A.1 – Dữ liệu về độ chụm của phép thử liên phòng thử nghiệm trên phép xác định cafein trong cà phê và sản phẩm cà phê

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO Guide 30:1992, Term and definition used in connection with reference material

[2] TCVN 6910-1:2010 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2:2010 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] TCVN 6910-6:2010 (ISO 5725-6:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 6: Sử dụng các giá trị độ chính xác trong thực tế.

[5] TCVN 9722 (ISO 20938), Cà phê hòa tan – Xác định độ ẩm – Phương pháp Karl Fischer (Phương pháp chuẩn).

[6] Thompson, M. Ellison, S.R.L., Wood, R., for the international working party for harmonization of quality assuarance schemes. The international harmonized protocol for the proficiency testing of analitycal chemistry laboratories. IUPAC technical report. Pure appl.Chem. 2006, 78, pp. 145-196. Available (2007-12-06) at: http://www.iupac.org/pulications/pac/2006/pdf/7801x0145.pdf