Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8748:2011 về thịt và sản phẩm thịt - Phương pháp xác định dư lượng tetracyclin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8748:2011

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT -

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Meat and meat products -

Method for determination of tetracyclines residues by high performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 8748:2011 được chuyển đổi từ các tiêu chuẩn ngành 10 TCN 698:2006, 10 TCN 700:2006, 10 TCN 701:2006 và 10 TCN 702:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;

TCVN 8748:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

TCVN 8748:2011

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT -

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRACYCLIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Meat and meat products -

Method for determination of tetracyclines residues by high performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin) trong thịt và sản phẩm thịt.

Giới hạn định lượng của phương pháp là 50 μg/kg.

2. Nguyên tắc

Mẫu được đồng hóa và tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin) được chiết từ mẫu bằng dung dịch đệm Mc Ilvaine/EDTA. Loại bỏ protein trong mẫu bằng dung dịch axit trichloroaxetic và lọc qua giấy lọc. Làm sạch mẫu bằng cột chiết pha rắn C18. Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), cột sắc ký C18, detector quang phổ khả kiến (UV-Vis) để xác định dư lượng tetracyclin có trong mẫu.

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có qui định khác.

3.1 Axetonitril.

3.2 Metanol.

3.3 Dung dịch axit tricloaxetic, 1 g/ml

Hoà tan 50 g axit tricloaxetic trong 50 ml nước.

3.4 Dung dịch axit oxalic trong nước, 0,01 M

Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm hai phân tử nước trong 1 lít nước, lọc qua bộ lọc dung môi với giấy lọc cỡ lỗ 0,45 μm bằng bơm chân không (4.9).

3.5 Dung dịch axit oxalic trong metanol, 0,01 M

Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm hai phân tử nước trong 1 lít metanol.

3.6 Dung dịch axit xitric, 0,1 M

Hoà tan 21 g axit xitric ngậm một phân tử nước trong 1 lít nước.

3.7 Dung dịch dinatri phosphat, 0,2 M

Hoà tan 28,4 g dinatri phosphat trong 1 lít nước.

3.8 Dung dịch đệm Mc Ilvaine

Trộn đều 1 lít dung dịch axit xitric (3.6) với 625 ml dung dịch dinatri phosphat (3.7), chỉnh pH = 4,0  0,05.

3.9 Dung dịch đệm Mc Ilvaine/EDTA

Hoà tan 60,5 g dinatri etylen diamin tetraaxetat (EDTA) ngậm hai phân tử nước (3.8) trong 1,625 lít dung dịch đệm Mc Ilvaine (3.8).

3.10 Chuẩn oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin

3.10.1 Dung dịch chuẩn gốc, 1 000 μg/ml

Cân 50 mg mỗi chất chuẩn vào 4 bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (lượng cân được điều chỉnh theo độ tinh khiết của chất chuẩn). Hoà tan và thêm metanol đến vạch để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 000 μg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20 oC trong 1 tháng.

3.10.2 Hỗn hợp dung dịch chuẩn trung gian, 50 μg/ml

Lấy 2,5 ml mỗi loại dung dịch chuẩn gốc 1 000 μg/ml (3.10.1) vào bình định mức 50 ml, hoà tan và thêm metanol đến vạch để được dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 50 μg/ml. Bảo quản và sử dụng ở 4 oC trong 2 tuần.

3.10.3 Dung dịch chuẩn làm việc, 0,125; 0,25; 0,75 và 1,0 μg/ml

Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn trung gian 50 μg/ml (3.10.2) với dung dịch axit oxalic 0,01 M trong metanol (3.5) và nước (tỷ lệ 30:70) để thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ tương ứng 0,125; 0,25; 0,75 và 1,0 μg/ml.

Các dung dịch chuẩn làm việc được chuẩn bị hàng ngày.

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Hệ thống máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), được trang bị:

- Bơm 2 kênh dung môi gradient;

- Detector quang phổ khả kiến (UV-Vis);

- Máy tính và phần mềm phân tích;

- Cột phân tích RP C18, kích thước 25 cm x 4,6 mm, 5 μm.

4.2 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.3 Máy xay thịt.

4.4 Máy ly tâm tốc độ cao, tối đa 20 000 r/min.

4.5 Máy ly tâm lạnh, tối đa 6 000 r/min, ở 4 ^oC.

4.6 Máy lắc vortex, tối đa 700 r/min.

4.7 Máy lắc quay tròn.

4.8 Máy khuấy từ.

4.9 Bơm chân không, 0,4 bar, 12 W.

4.10 Pipet tự động, dung tích từ 100 μl đến 1 000 μl.

4.11 Pipet thuỷ tinh, dung tích 25 ml.

4.12 Ống ly tâm polypropylen, dung tích 50 ml, có nắp.

4.13 Ống thuỷ tinh, dung tích 30 ml có nắp và 10 ml.

4.14 Cốc thuỷ tinh, dung tích 50 ml.

4.15 Cột chiết pha rắn, ví dụ Bond-Elut C18, 3 cc, 500 mg hoặc tương đương.

4.16 Bộ chiết pha rắn, ví dụ Manifold (supelco), adaptor, kim hoặc tương đương.

4.17 Lọ đựng mẫu, dung tích 2 ml, đã được xylan hoá.

4.18 Đầu lọc, cỡ lỗ 0,45 µm x 22 mm.

5. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6. Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu thử

Xay nhỏ và đồng hóa mẫu thịt bằng máy xay thịt (4.3) để đồng nhất mẫu. Cân 5 g mẫu thịt cho vào ống ly tâm(4.12).

Cho vào đó 25 ml dung dịch đệm Mc Ilvaine/EDTA (3.9). Lắc 30 s bằng máy lắc vortex (4.6) sau đó lắc khoảng 15 min bằng máy lắc quay tròn (4.7) với tốc độ 100 r/min. Ly tâm với tốc độ 4 000 r/min trong 10 min ở nhiệt độ 4 ^oC bằng máy ly tâm lạnh (4.5).

Chuyển toàn bộ dung dịch vào ống thuỷ tinh 30 ml (4.13). Đặt ống vào cốc thuỷ tinh (4.14) và đưa lên máy khuấy từ (4.8). Cho từ từ 2,5 ml dung dịch axit tricloaxetic 1 g/ml (3.3) vào và khuấy đều. Sau đó khuấy nhanh hơn trong 1 min. Nhấc ống ra khỏi máy quấy từ và bỏ thanh khuấy từ ra khỏi ống. Ly tâm trong 5 min với tốc độ 3 000 r/min, dùng máy ly tâm.

Nối cột chiết pha rắn (4.15) với bộ chiết pha rắn (4.16) và bơm chân không (4.9). Hoạt hoá cột chiết pha rắn (4.15) bằng 1 ml metanol (3.2), 1 ml nước và 1 ml dung dịch đệm Mc Ilvaine (3.8).

Chuyển hết dung dịch chiết thu được sau khi ly tâm lên cột chiết pha rắn (4.15), dùng bơm hút chân không (4.9) và điều chỉnh tốc độ chảy không quá 2 giọt/s. Tráng cốc bằng 2 ml dung dịch đệm Mc Ilvaine/EDTA (3.9), không để cột bị khô trong bước này.

Rửa cột bằng 1 ml nước.

Làm khô cột trong 5 min bằng bơm chân không.

Rửa giải cột bằng 1 ml dung dịch axit oxalic 0,01 M trong metanol (3.5), tiếp theo là 1 ml nước. Hứng phần dịchrửa giải vào ống polypropylen (4.12). Ly tâm trong 3 min với tốc độ 20 000 r/min ở nhiệt độ 4 ^oC bằng máy ly tâm tốc độ cao (4.4). Lọc mẫu qua đầu lọc (4.18) vào lọ đựng mẫu 2 ml (4.17) trước khi bơm mẫu lên hệ thống máy HPLC (4.1).

6.2 Chuẩn bị mẫu trắng và mẫu trắng thêm chất chuẩn

Chuẩn bị mẫu trắng đồng thời và giống như các bước chuẩn bị mẫu thử (6.1).

Mẫu trắng là mẫu không nhiễm tetracyclin. Mẫu này dùng để kiểm soát sự ô nhiễm chéo trong quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích sắc ký.

Mẫu trắng thêm chất chuẩn là mẫu trắng thêm chất chuẩn tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin). Mẫu này dùng để xác định độ thu hồi.

Sau khi xay nhỏ và đồng hóa mẫu, thêm chất chuẩn tetracyclin vào mẫu. Lượng kháng sinh cho vào mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính.

VÍ DỤ: Chuẩn bị mẫu trắng thêm chất chuẩn có nồng độ oxytetracyclin 100 μg/kg như sau: dùng pipet hút 10 μl dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 50 μg/ml (3.10.2) cho vào 5 g mẫu trắng. Sau đó chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn đồng thời và các bước tiếp theo giống như khi chuẩn bị mẫu thử.

CHÚ THÍCH: Nếu có nội chuẩn thì cho chất nội chuẩn vào tất cả các mẫu, không cần phải chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn.

6.3 Phân tích sắc ký

Điều kiện chạy máy:

- Bước sóng:                                   360 nm;

- Tốc độ dòng:                                 0,6 ml/min;

- Pha động như sau:

Thời gian, min	Pha động
	Axetonitril (3.1), %	Dung dịch axit oxalic 0,01 M (3.4), %
0	13	87
20	36	64

CHÚ THÍCH: Thời gian ổn định là 5 min. Có thể đặt ở bước sóng 355 nm.

Thời gian lưu của oxytetracyclin là 10,8 min; tetracyclin là 11,6 min; clotetracyclin là 13,8 min; doxycylin là 14,4 min.

6.4 Dựng đường chuẩn

Trước khi bơm dung dịch chuẩn cần ổn định cột sắc ký trong 30 min bằng pha động, sau đó bơm chính xác 100 μl các dung dịch chuẩn làm việc (3.10.3) theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao vào máy sắc ký HPLC (4.1) ở điều kiện phân tích để xây dựng đường chuẩn và xác định giới hạn phát hiện của máy. Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (μg/ml) từng loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính:

y = ax + b

Trong đó:

y là diện tích pic (chiều cao pic của chất chuẩn);

x là nồng độ tương ứng chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml); a và b là hệ số trong phương trình tuyến tính.

7. Tính và biểu thị kết quả

7.1 Tính độ thu hồi

Nồng độ cuối cùng của từng kháng sinh nhóm tetracyclin trong mẫu trắng thêm chuẩn, C_f, tính từ phương trình đường chuẩn (6.4) theo công thức:

Trong đó:

Yt là diện tích pic của mẫu trắng thêm chuẩn;

a là hệ số góc của đường chuẩn;

b là hằng số của đường chuẩn.

Độ thu hồi, R, được xác định theo công thức:

Trong đó:

C_f là nồng độ cuối cùng của từng kháng sinh nhóm tetracyclin trong mẫu trắng thêm chuẩn, được xác định như trên;

C_t là nồng độ thực (nồng độ chuẩn cho vào mẫu trắng);

f là hệ số pha loãng của mẫu trắng thêm chuẩn.

Kết quả xác định độ thu hồi được chấp nhận nếu độ thu hồi đạt được giới hạn sau:

R_m - 3.SD ≤ R ≤ R_m + 3.SD

Trong đó:

Rm là độ thu hồi trung bình;

SD là độ lệch chuẩn của độ thu hồi trung bình.

7.2 Tính kết quả

Dư lượng của từng kháng sinh nhóm tetracyclin (oxytetracyclin, tetracyclin, clotetracyclin, doxycylin) trong mẫu thử, X, tính bằng microgam trên kilogam (μg/kg), được tính theo công thức:

Trong đó:

Cflànồng độ cuối cùng của từng kháng sinh nhóm tetracyclin trong mẫu trắng thêm chuẩn;

R là độ thu hồi, được xác định từ mẫu trắng thêm chuẩn theo 7.1;

F là hệ số pha loãng mẫu.

7.3 Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị đến một số thập phân.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào  khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

- kết quả thử nghiệm thu được.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] AFSSA - Fougères (Pháp). Determination of Tetracyclines residues in kidney and muscle by

HPLC.

[2] AOAC Official Method 995.09. Tetracycline, Oxytetracycline and Chlortetracycline in Edible

Animal Tissues.

[3] Veterynary Sciences Division Belfast BT4 :SOP BT4 3SD.