Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8684:2011 về vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y – Phép thử độ thuần khiết

TCVN 8684:2011

VẮC XIN VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THÚ Y –

PHÉP THỬ ĐỘ THUẦN KHIẾT

Veterinary vaccines and biological products – Purity test

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp thử độ thuần khiết của vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y.

2. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy

2.1 Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

2.1.1 Metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua.

2.1.2 Dung dịch sắt(II) clorua trong axit sulfamic.

2.1.3 Formaldehyt chuẩn.

2.2 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường nuôi cấy đã pha chế sẵn hoặc chuẩn bị môi trường nuôi cấy ngay trước khi sử dụng.

2.2.1 Môi trường thioglycollat.

2.2.2 Môi trường trypticaza đậu tương.

2.2.3 Thạch máu.

2.2.4 Canh thang thịt. 

2.2.5 Thạch Sabouraud.

2.2.6 Sản phẩm thủy phân casein đậu tương.

2.2.7 Canh thang PPLO, có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men.

2.2.8 Thạch PPLO (tên đầy đủ pleuropneumonia-like organism agar, có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men

2.2.9 Dung dịch DPN-cystein, có bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua và huyết thanh ngựa.

2.2.10 Canh thang tim, có bổ sung proteoza pepton và chất chiết nấm men.

2.2.11 Thạch MacConkey.

2.2.12 Thạch Salmonella-Shigella.

2.2.13 Thạch brilliant green.

2.2.14 Thạch desoxycholat xitrat.

2.2.15 Thạch xyloza lysin deoxycholat (thạch XLD).

2.2.16 Canh thang selenit.

2.2.17 Canh thang tetrathionat.

3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm sinh học thông thường và cụ thể như sau:

3.1 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 ⁰C.

3.2 Tủ ấm CO₂.

3.3 Tủ sấy.

3.5 Máy lắc.

3.7 Máy đo quang phổ, sử dụng cuvet 1 cm, có thể đo được ở bước sóng 628 nm.

4. Cách tiến hành

4.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn

4.1.1 Tiến hành

4.1.1.1 Cấy vắc xin trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat (2.2.1), môi trường trypticaza đậu tương (2.2.2), 2 đĩa môi trường thạch máu (2.2.3), lượng vắc xin cấy từ 1 % đến 2 % (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra. Nếu vắc xin ở dạng đông khô thì phải được hoà tan trở lại dung tích ban đầu.

Ủ môi trường đã cấy vắc xin trong tủ ở 37 ^oC, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.

4.1.1.2 Nếu vắc xin có chất diệt trùng thì giữ mẫu ở nhiệt độ từ 25 ⁰C đến 30 ⁰C trong thời gian từ 24 h đến 48 h trước khi tiến hành kiểm tra. Kiểm tra vắc xin có chất diệt trùng như sau:

– Cấy mẫu vào ống 10 ml canh thang thịt (2.2.4), theo dõi ở 37 ⁰C trong 3 ngày.

– Cấy chuyển từ ống canh thang thịt trên sang 2 ống canh thang thịt mới chuẩn bị, theo dõi ở 37 ⁰C trong thời gian từ 7 ngày đến 10 ngày.

4.1.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

4.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc

4.2.1 Tiến hành

Mẫu vắc xin được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud (2.2.5) hoặc sản phẩm thủy phân casein đậu tương (2.2.6). Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20 ⁰C đến 25 ⁰C).

4.2.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

4.3 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma

4.3.1 Tiến hành

Mẫu vắc xin được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO (2.2.7) với nồng độ từ 1 % đến 2 % vắc xin trong 100 ml môi trường và trên đĩa thạch PPLO (2.2.8) có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin trên 1 đĩa. Có thể sử dụng dung dịch DPN-cystein (2.2.9), được bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua và huyết thanh ngựa hoặc sử dụng môi trường canh thang tim (2.2.10) được bổ sung proteoza pepton và chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra.

Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33⁰C đến 37⁰C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm CO₂ (3.2) ở 37⁰C có 5 % khí CO₂, theo dõi trong 28 ngày.

Trường hợp dùng Dung dịch DPN-cystein hoặc Môi trường canh thang tim thì ria cấy vào đâu???

4.3.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.

4.4 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella

4.4.1 Tiến hành nuôi cấy

Mẫu vắc xin được cấy trên môi trường kiểm tra, dùng một trong các loại môi trường sau: thạch MacConkey (2.2.11), thạch Salmonella-Shigella (2.2.12), thạch Brilliant Green (2.2.13), thạch desoxycholat xitrat (2.2.14) hoặc thạch XLD (2.2.15), với nồng độ từ 1 % đến 2 % dung tích môi trường kiểm tra.

Ủ môi trường đã cấy vắc xin trong tủ ở 37 ^oC, theo dõi từ 18 h đến 24 h sau đó cấy chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng một trong các loại môi trường sau: canh thang selenit (2.2.16) hoặc canh thang tetrathionat (2.2.17). Ủ trong tủ ở 37 ^oC, theo dõi từ 48 h đến 72 h.

4.4.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt khi không có vi khuẩn Salmonella mọc trên các loại môi trường kiểm tra.

4.5 Kiểm tra sự có mặt của formaldehyt trong vắc xin: phương pháp sắt(II) clorua

4.5.1 Tiến hành

Pha loãng vắc xin ở nồng độ 1 : 200 (phần thể tích) (nếu là vắc xin dạng nhũ dầu thì pha loãng ở nồng độ 1/20). Lấy 0,5 ml vắc xin đã pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml formaldehyt chuẩn (2.1.3) đã pha loãng theo tỉ lệ 1/200 và 0,5 ml metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua (2.1.1). Đậy nắp ống nghiệm, lắc nhẹ bằng máy lắc (3.5) và để đứng ống nghiệm trong 60 min ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 1,0 ml sắt(II) clorua trong axit sulfamic (2.1.2) và để đứng ống nghiệm trong 15 min ở nhiệt độ phòng.

Đo độ hấp phụ của vắc xin và chất chuẩn bằng máy đo quang phổ (3.7) tại bước sóng 628 nm.

4.5.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt nếu độ hấp thụ đo được nhỏ hơn 0,74.

5. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tuỳ ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

- kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ASEAN standards for animal vaccines. Appendix 2 – Guidelines for sterility testing of veterinary vaccines

[2] 9 CFR 113.28: Dectection of Mycoplasma contamination

[3] 9 CFR 113.28: Dectection of Salmonella contamination