Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5449:1991 (ST SEV 3833 – 82) về đồ hộp - chuẩn bị dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, chỉ thị và môi trường dinh dưỡng dùng cho phân tích vi sinh
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
Canned foods
Preparation of solution of reageuts, dyes indicators and nutrient medium for microbiological analysis
Tiêu chuẩn này phù hợp với ST SEV 3833 - 82.
1.1. Để pha chế các dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, chỉ thị và môi trường dinh dưỡng, nếu không có những quy định riêng nào khác, cần sử dụng: nước cất.
Thuốc thử loại tinh khiết hoá học và tinh khiết phân tích tương ứng với các thông số về dạng bên ngoài, mùi, độ hoà tan, khối lượng, thể tích, nhiệt độ và độ chính xác phép đo được quy định trong các quy định hiện hành.
Thuốc thử và dung dịch phụ chuẩn bị theo các quy định hiện hành;
Dung dịch chỉ thị chuẩn bị theo quy định hiện hành;
Các môi trường dinh dưỡng khô, các hợp phần khô hoặc tươi dùng để chuẩn bị môi trường dinh dưỡng như thịt, cá, sữa, rau, quả, nấm men, trứng gà, phải tương ứng với các yêu cầu trong tiêu chuẩn hiện hành.
1.2. Khi chuẩn bị các dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, chỉ thị và môi trường dinh dưỡng, cần ghi rõ tỉ lệ giữa các chất theo các đơn vị đại lượng vật lý đã quy định.
1.3. Khi pha chế các dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, chỉ thị, cần sử dụng các dụng cụ đo dung tích cấp A, khi pha chế môi trường dinh dưỡng (nếu không có những quy định riêng nào khác) có thể sử dụng dụng cụ đo dung tích cấp B.
1.4. Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng trong các dụng cụ chứa bằng thủy tinh hoặc tráng men. Đối với dụng cụ thủy tinh mới (gồm: bình, ống nghiệm, pipet, đĩa pêtri), trước khi sử dụng, cần ngâm trong dung dịch axit clohydric 1 - 2% trong vòng 12 - 24 giờ, rửa bằng nước máy sau đó bằng nước cất rồi thanh trùng trong nồi hấp ở 121 ± 10C trong 1 giờ. Đối với những dụng cụ thủy tinh đã sử dụng, cần thanh trùng ở 121 ± 10C trong nồi hấp trong một giờ đổ hết lượng chứa và rửa sạch cặn bẩn bằng các dung dịch rửa, tráng sạch bằng nước máy và sau đó bằng nước cất.
1.5. Nếu trong tiêu chuẩn hiện hành có mô tả các môi trường dinh dưỡng khác biệt nhau do trong thành phần có hoặc không chứa dịch chiết nấm men, thì khi phân tích đồ hộp xuất hoặc nhập khẩu chỉ sử dụng môi trường có chiết men hoặc dịch chiết nấm men. Đối với đồ hộp không dùng với mục đích trên, cho phép sử dụng các môi trường dinh dưỡng tương tự chuẩn bị theo tiêu chuẩn hiện hành.
1.6. Nếu trong cách chuẩn bị các môi trường dinh dưỡng không ghi rõ các điều kiện để hoà tan các môi trường dinh dưỡng hay các hợp phần khô thì khuấy tan chúng trong nước có nhiệt độ phòng ít nhất 15 phút sau đó, nếu cần, đun nóng.
1.7. Điều chỉnh pH của môi trường
Điều chỉnh pH ở nhiệt độ phòng đến mức cần thiết bằng cách cho thêm dung dịch natri hydroxit 10% hoặc dung dịch axit clohydric 25% hay dung dịch axit xitric 20% vào từng giọt và khuấy, đồng thời xác định độ pH của mẫu được lấy định kỳ bằng điện thế kế hoặc chỉ thị mầu. Giá trị pH của môi trường dinh dưỡng khi thanh trùng có thể bị thay đổi. Khi kiềm hoá môi trường bằng dung dịch kiềm, pH sau khi sôi và thanh trùng sẽ giảm đi 0,2, còn khi chuẩn bị các môi trường có nước chiết gan, hỗn hợp vitamin B, pH sẽ giảm 0,3 - 0,4. Do đó khi chuẩn bị môi trường, cần điều chỉnh cho pH cao hơn giá trị đã định khoảng 0,2 - 0,4, đun sôi cho đến khi pH giảm đi 0,2 - 0,3, tiếp tục kiểm tra pH, điều chỉnh nếu cần và thanh trùng nồi hấp. Nhất thiết phải kiểm tra pH sau khi thanh trùng.
1.8. Thanh trùng môi trường dinh dưỡng theo TCVN 4886 - 89 (ST SEV 3013-81) nếu trong tiêu chuẩn hiện hành không có các quy định riêng nào khác.
1.9. Bảo quản môi trường dinh dưỡng đã chuẩn bị ở nhiệt độ phòng không quá 3 ngày hoặc ở 4 ± 10C không quá 1 tháng, nếu trong tiêu chuẩn hiện hành không có các quy định riêng nào khác.
Để chuẩn bị các môi trường dinh dưỡng, dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, chỉ thị, cần sử dụng:
1) Nồi hấp để thanh trùng môi trường dinh dưỡng;
2) Thiết bị thanh trùng bằng luồng hơi;
3) Bản thanh trùng làm từ amiăng;
4) Bếp cách thủy điều chỉnh được nhiệt độ;
5) Cân phân tích;
6) Cân thí nghiệm;
7) Cân bán kỹ thuật;
8) Phễu lọc nóng;
9) Phễu thủy tinh;
10) Máy đồng hoá hay máy trộn dùng cho phòng thí nghiệm;
11) Đèn cồn hoặc đèn khí;
12) Bộ chưng cất;
13) Tấm sấy dụng cụ thủy tinh;
14) Cái rửa dụng cụ;
15) Ống nhỏ giọt;
16) Nồi các cỡ;
17) Bình cầu hay tam giác đáy bằng, có dung tích khác nhau;
18) Giỏ bằng dây thép tráng thiếc dùng để thanh trùng;
19) Cuvet các cỡ;
20) Vải băng;
21) Cối xay thịt có đường kính lỗ không lớn hơn 4mm;
22) Dao;
23) Kéo;
24) Đũa thủy tinh (tròn đường kính 3,5mm; dài 270mm; uốn cong 30mm, đầu tày);
25) Cái cặp;
26) Pipet More;
27) Pipet dung tích khác nhau;
28) Bếp điện ;
29) pH kế;
30) Ống nghiệm dung tích khác nhau;
31) Bệ rửa;
32) Khúc xạ kế;
33) Đường kế;
34) Lưới amiăng;
35) Mặt kính đồng hồ;
36) Cối sứ;
37) Nhiệt kế hoá học loại đo được từ 0 đến 500C, từ 0 đến 2500C và từ 50 đến 1000C;
38) Nồi điều nhiệt với khoảng nhiệt độ 50 - 620C, 30 - 370C;
39) Giá 3 chân;
40) Màng lọc bằng amiăng;
41) Phin lọc kiểu Seits;
42) Màng lọc;
43) Bình cổ hẹp dung tích 100 - 200cm3;
44) Hộp kim loại dùng để thanh trùng pipet và đĩa petrô;
45) Tủ lạnh;
46) Máy ly tâm;
47) Ống đong dung tích khác nhau;
48) Đồng hồ cát;
49) Đồng hồ tín hiệu;
50) Đĩa petri loại dùng cho phân tích vi sinh (đáy phẳng đường kính ngoài không quá 102mm, đường kính trong 90 ± 2mm, chiều cao không nhỏ hơn 18mm);
51) Tủ sấy để thanh trùng dụng cụ bằng không khí nóng;
52) Que khuấy kim loại;
53) Que khuấy thủy tinh;
54) Giá để pipet;
55) Giá để ống nghiệm;
56) Giá bằng kim loại có bộ cặp và vòng.
3. Thuốc thử, dung dịch và vật liệu
Để chuẩn bị dung dịch, thuốc thử, thuốc nhuộm, chất chỉ thị và môi trường dinh dưỡng cần sử dụng:
1) Thạch (aga);
2) Amoni oxalat;
3) Amoni xitrat;
4) Axeton;
5) Brom;
6) Bromcrezola đỏ;
7) Bromtimola xanh;
8) Giấy lọc;
9) Nước cất;
10) Glucoza;
11) Nấm men ép;
12) Gelatin;
13) Phèn sắt amoni Fe (NH4) (SO4)2.12H2O;
14) Sắt sunfat Fe2(SO4)3;
15) Sắt clorua FeCl3;
16) Iốt tinh thể I2;
17) Kali nitrat KNO3;
18) Kali bicromat K2Cr2O7;
18a) Kali sunfat K2SO4;
19) Kali Iodua KI;
20) Kali dihydrophotphat KH2PO4 hoặc Kali hydrophotphat K2HPO4;
21) Canxi Cacbonat CaCO3;
22) Khoai tây;
23) Axit ascorbic;
24) Axit xitric;
25) Axit lactic;
26) Axit sunphuric, (TK.HH), H2SO4;
27) Axit clohydric đậm đặc, HCl;
28) Axit axetic;
29) Tinh bột tan;
30) Tím tinh thể;
31) Tiết trâu bò, cừu và ngựa;
32) Quỳ tím;
33) Liti clorua, hexahidrat LiCl.6H2O;
34) Lactoza;
35) Dầu vaselin;
36) Đồng sunfat CuSO4;
37) Sữa bò;
38) Thịt bò, bê, cừu, ngựa;
39) Natri hydroxit NaOH;
40) Xitrat natri, dehidrat;
41) Natri pirunat;
42) Natri sunphit Na2SO3;
43) Natri cacbonat Na2CO3;
44) Natri hidrophotphat và Natri dihidrophotphat Na2HPO4.12H2O và NaH2PO4.H2O;
45) Natri axetat, dung dịch;
46) Natri clorua NaCl;
47) Paradimetylamiabenzaldehyt;
48) Parafin;
49) Pirogalon;
50) Pepton dùng cho vi sinh vật;
51) Gan bò, bê, thỏ không có các chất ức chế sự phát triển của vi sinh vật;
52) Saccaroza;
53) Xaphranin Q hoặc T;
54) Muối Mor FeSO4 (NH4)2SO4.6H2O;
55) Etanola;
56) Nước cà chua;
57) Triptophon;
58) Sản phẩm thủy ngân Tripton của cazein;
59) Triptophan;
60) 2, 3, 5 - Triphenyltetrazol clorua;
61) Fushin (bazơ và axit);
62) Sixtein hidroclorua;
63) Cao nấm men khô;
64) Cao thịt khô;
65) Nước chiết thịt;
66) Trứng gà.
4.1. Nước thạch nghèo, dung dịch 2,0%
Hoà tan 2,0g thạch vào 98ml nước cất. Thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Sử dụng để tạo màng trên mặt môi trường tránh không cho môi trường tiếp xúc với oxy của không khí.
4.2. Huyền phù (nhũ tương) lòng đỏ trong dung dịch sinh lý.
Dùng pipet tách lấy lòng đỏ từ trứng đã lau sạch vỏ bằng cồn 70%, sau đó đem trộn với 100ml dung dịch sinh lý. Nhũ tương lòng đỏ cũng chuẩn bị tương tự nhưng lấy 2 lòng đỏ đem trộn với 10ml dung dịch sinh lý.
Cho vào môi trường dinh dưỡng để xác định hoạt tính lexitinaza của vi sinh vật.
4.3. Nước brom - dung dịch brom bão hoà
Hoà tan 3 - 3,5g brom vào 100ml nước cất. Chuẩn bị nước brom trong tủ hút. Bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu có nắp đậy kín và tránh ánh sáng.
Sử dụng như chất chỉ thị để xác định hàm lượng tripxephan trong môi trường dinh dưỡng. Sau khi cho 3 - 4 giọt nước brom vào chất lỏng có chứa Triptophan sẽ có màu tím phớt hồng.
4.4. Glucoza, dung dịch nước 0,5; 1; 10; 20%
Cho 0,5; 1; 10; 20g glucoza vào bình định mức dung tích 100ml đã rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó thêm nước đến vạch. Chuyển nước glucoza thu được vào các ống nghiệm vô trùng và thanh trùng ở 112 ± 10C trong 15 phút hoặc ở 100 ± 10C trong 3 ngày mỗi ngày 30 phút hoặc lọc qua màng lọc.
Sử dụng như nguồn cacbonhidro trong môi trường dinh dưỡng và chất khử trong môi trường nuôi cấy đối với vi sinh vật kỵ khí.
4.5. Chỉ thị bromcresola tím - dung dịch kiềm chuẩn bị theo quy định hiện hành.
Sử dụng để xác định khả năng tạo axit của vi sinh vật.
4.6. Chỉ thị bromtimola xanh - dung dịch kiềm chuẩn bị theo quy định hiện hành.
Sử dụng để kiểm tra pH của môi trường dinh dưỡng.
4.7. Canxi cacbonat vô trùng
Cho từ 2 đến 100g Cacbonat canxi vào ống nghiệm, bình hay lọ cổ hẹp và thanh trùng bằng không khí theo TCVN 4886 - 89 (ST SEV 3013 - 81).
Dùng để thêm vào các môi trường dinh dưỡng loại dùng để kiểm tra các sản phẩm chua.
4.8. Axit ascorbic - dung dịch 5%
Chuẩn bị theo quy định hiện hành và thanh trùng bằng cách lọc.
Sử dụng như một chất khử liên kết với oxy trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí.
4.9. Axit xitric - dung dịch 20%.
Cho 20g axit xitric vào bình định mức và thêm nước đến 100ml, hoà tan và chuyển vào ống nghiệm hay bình rồi thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Sử dụng để axit hoá môi trường dinh dưỡng.
4.10. Thịt miếng, thịt băm, nước thịt, nước hầm thịt.
Thịt bò hoặc thịt ngựa đã lược xương, mỡ, gân, đem cắt thành miếng để chuẩn bị nước hãm thịt hoặc xay nhỏ bằng cối xay thịt để chuẩn bị nước thịt. Cho nước vào theo tỉ lệ 1 lít nước ứng với 500g thịt và để qua đêm trong tủ lạnh. Hôm sau lấy ra, đun nhỏ lửa hỗn hợp thịt với nước đến sôi và cho sôi đến mức cần thiết. Trong khi để sôi, cần khuấy định kỳ hỗn hợp và thêm nước đến thể tích ban đầu. Với một lượng không lớn (dưới 5%) có thể đun sôi nhỏ lửa đồng thời khuấy thường xuyên để thịt khỏi cháy. Với lượng lớn, nên nấu sôi trong nồi hai vỏ. Việc đun sôi kết thúc khi lọc thử một ít hỗn hợp bằng giấy lọc vào ống nghiệm, chất lỏng thu được là trong suốt.
Tiếp tục để hỗn hợp trong tủ lạnh 1 ngày. Điều chỉnh pH của hỗn hợp đến 7,0 - 7,2, lọc qua vải lọc và ép hết nước từ thịt miếng hay thịt băm. Thanh trùng nước thịt hay nước hầm và thịt miếng hay thịt băm ở 121 ± 10C trong 20 phút. 1 lít nước thịt hay nước hầm tương ứng với 3 - 5g cao thịt.
Sử dụng làm hợp phần của môi trường dinh dưỡng.
4.11. Gan miếng, nước gan, nước hầm gan và canh thang gan
Gan tươi của bò, bê và thỏ đem loại bỏ màng và mỡ. Sau đó cắt thành miếng nhỏ 30 - 40g để chuẩn bị nước gan hoặc xay nhỏ bằng cối xay thịt để chuẩn bị nước gan. Cho nước vào gan theo tỉ lệ 1 lít nước ứng với 500g, giữ nhiệt độ từ 4 - 80C trong 2 giờ và cho sôi trong 20 phút.
Điều chỉnh pH đến 7,1 ± 0,1 và lại cho sôi trong 10 phút.
Chắt lọc hỗn hợp qua vải, chất lỏng dùng để chuẩn bị nước hay canh thang. Điều chỉnh pH của chất lỏng đến 7,1 ± 0,1 và thêm nước đến thể tích ban đầu. Thanh trùng nước gan hay nước hầm gan ở 121± 10C trong 20 phút.
Để chuẩn bị canh thang gan, trước khi thanh trùng cần thêm 1% pepton, 0,5% muối ăn (duy trì pH 7,1± 0,1) vào chất lỏng trên, sau đó chuyển hỗn hợp vào bình hoặc ống nghiệm đậy kín và thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Cắt nhỏ các miếng gan đến 1,5 - 3g, rót natri cacbonat dung dịch 5% vào và cho sôi trong vòng 10 - 15 phút, không để sôi mạnh, sau đó phun nước rửa sạch các miếng gan trên rá lọc và rửa qua vài lần bằng nước cất. pH của các miếng gan phải là 7,1 ± 0,1. Kiểm tra pH của gan bằng cách nhúng ngập trong chất chỉ thị bromtimola xanh phải có màu xanh lá cây. Cho các miếng gan vào trong ống nghiệm hay bình, đậy kín và thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Sử dụng làm hợp phần của môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật kỵ khí.
4.12. Rượu quỳ
Chuẩn bị theo quy định hiện hành.
Cho vào môi trường dinh dưỡng để xác định khả năng khử quỳ của vi sinh vật.
4.13. Dầu vaselin
Rót 20 - 50ml dầu vào ống nghiệm hay bình, đậy kín và thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Sử dụng để tạo lớp trên các môi trường dinh dưỡng lỏng dùng cho vi sinh vật kỵ khí.
4.14. Sữa tách chất béo
Đun sôi sữa, sau đó để vào tủ lạnh 1 ngày đêm, gạn hết váng sữa, lại đun sôi và để nguội trong tủ lạnh 1 ngày, gạn bỏ một lần nữa lớp trên cùng. Sữa tách chất béo có thể được chuẩn bị bằng cách phân ly. Cho sữa thu được vào bình vô trùng, đậy kín và thanh trùng ở 1000C trong 3 ngày mỗi ngày 30 phút hoặc thanh trùng một lần ở 116 ± 10C trong 20 phút. Sau khi thanh trùng sữa không được có màu nâu.
Sữa tách chất béo được dùng làm hợp phần của môi trường dinh dưỡng.
4.15. Natri hydroxit dung dịch 10%
Chuẩn bị theo quy định hiện hành.
Sử dụng để kiềm hoá môi trường dinh dưỡng.
4.16. Pyrogalon, dung dịch kiềm
Chuẩn bị theo quy định hiện hành.
Dùng để hấp thụ oxy trong bình nuôi vi sinh vật kỵ khí.
4.17. Dung dịch để xác định khả năng khử sunfit của Clostridium: Natri sunfit 1%, sắt sunfat 0,4%.
Thanh trùng 2 dung dịch trên ở 115 ± 10C trong 30 phút.
Ngay trước khi cấy, cho thêm 5ml mỗi dung dịch trên vào 100ml môi trường dinh dưỡng dùng cho clostridium đã hoạt hoá và để nguội.
4.18. Dung dịch và thuốc thử dùng để nhuộm Gram.
4.18.1. Dung dịch màu cơ bản Khuker. Hoà tan 2g tím tinh thể có hàm lượng chất khô từ 85 - 90% vào 20ml cồn; hoà tan 0,8g amoni oxalat vào 80ml nước; pha lẫn các dung dịch trên và giữ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trước khi sử dụng.
4.18.2. Dung dịch Lugol
Hoà tan 2g KI vào 5 - 10ml nước, cho thêm 1g Iôt tinh thể, để vài giờ đến khi Iốt tan hoàn toàn và sau đó thêm nước đến thể tích 300ml.
4.18.3. Dung dịch Iốt (theo công thức) Burke
Hoà tan 2g Kali Iodua KI với 5 - 10ml nước trong bình định mức dung tích 100ml, thêm 1g Iốt tinh thể vào, để vài giờ đến khi Iốt tan hoàn toàn sau đó thêm nước đến vạch.
4.18.4. Dung dịch màu tương phản
Hoà tan 0,25g Xaphranin trong 10ml cồn, sau đó pha trộn dung dịch thu được với 100ml nước.
4.18.5. Cho phép sử dụng dung dịch tím tinh thể 10% để làm dung dịch màu cơ bản. Và dung dịch Xaphranin T - 0,5% hoặc dung dịch cồn 0,5% làm dung dịch màu tương phản.
4.18.6. Để tẩy màu, vết của dung dịch màu cơ bản, sử dụng etanola đối với dung dịch màu Khuker hoặc axeton đối với dung dịch tím tinh thể - nước.
4.19. Dung dịch và thuốc thử để nhuộm màu bào tử vi khuẩn.
Hoà tan 5g malachit xanh trong 100ml nước.
Hoà tan 5g Xaphronin vào 100ml nước ở bình khác.
4.20. Dung dịch sinh lý
Hoà tan 0,85g natri clorua vào 100ml nước cất và thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Dùng để chuẩn bị huyền phù và nhũ tương lòng đỏ trứng.
4.21. Hỗn hợp thuốc thử để tạo điều kiện yếm khí
Trộn 1g pirogalon với 1g Kali cacbonat khan và 5g đất tảo cát, gói vào bao giấy.
Dùng để tạo điều kiện yếm khí.
4.22. Hỗn hợp parafin
Lấy một lượng parafin và dầu vaselin bằng nhau, cho nóng chảy rồi trộn kỹ, sau đó thanh trùng bằng không khí nóng ở 140±10C trong 60 phút.
Dùng để tạo lớp trên các môi trường dinh dưỡng lỏng cho vi sinh vật kỵ khí.
4.23. Nước chiết nấm men - dung dịch 20% nấm men tự phân
Cắt 100g nấm men bánh mỳ ép thành từng miếng nhỏ và rót 500ml nước vào. Để chuẩn bị nước chiết, cần cho bình có dung tích thích hợp sao cho thể tích hỗn hợp chiếm 1/5 dung tích bình.
Để hỗn hợp vào tủ sấy ở nhiệt độ từ 58 đến 600C trong 2 ngày và khuấy 1 - 2 lần trong một ngày đêm. Quá trình tự phân kết thúc khi nấm men chảy lỏng hoàn toàn. Dịch chiết có màu nâu và mùi thơm. 5ml dung dịch chiết 20% có giá trị bằng 1g nấm men.
Sử dụng như nguồn chất kích thích sinh trưởng cho vi sinh vật.
5. Chuẩn bị và sử dụng các môi trường dinh dưỡng
5.1. Môi trường thạch - lòng đỏ trứng TTC
Chuẩn bị 500ml thạch thịt - pepton có pH 7,1 ± 0,1, nấu chảy và để nguội đến 450C, sau đó cho thêm 20ml nhũ tương lòng đỏ và 25mg 2, 3, 5 - Triphenyltetrazal clorua. Trộn kỹ hỗn hợp và rót vào đĩa petri, bảo quản trong tủ lạnh không quá 10 ngày.
Dùng để nuôi cấy.
5.2. Môi trường thạch gan
Thêm 500ml nước máy vào 500ml nước gan, thêm tiếp 10g pepton, 5g natri clorua và 20 - 30g thạch. Đun sôi nhỏ lửa môi trường đến khi thạch tan hết, điều chỉnh pH đến 6,8 - 7,0, sau đó rót vào các ống nghiệm hoặc bình cổ hẹp và thanh trùng ở 121 ± 10C trong 2 phút.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí ưa ấm.
5.3. Môi trường thạch - đường - tiết Seyssler
Chuẩn bị 100ml thạch thịt - pepton, nấu chảy và để nguội đến 500C, sau đó thêm vào trong điều kiện vô trùng 10ml dung dịch Glucoza vô trùng và 10 - 20ml tiết tươi vô trùng đã khử fibrin của trâu, bò, ngựa hoặc cừu. Lắc cẩn thận hỗn hợp, tránh tạo váng và bọt, rồi rót vào đĩa petri sau đó sấy môi trường theo TCVN… (ST SEV 3015 - 81) và giữ không quá 2 ngày ở nhiệt độ 4 ± 10C.
Môi trường có pH 7,2 - 7,4.
Dùng để xác định hoạt tính tan máu của vi sinh vật.
5.4. Canh thang (thạch) glucoza - tripton
Thêm vào 1000ml nước cất một lượng gồm 5g Tripton; 2,5g cao nấm men hoặc 12,5ml nước chiết nấm men 20% (và 12 - 15g thạch khi chuẩn bị môi trường đặc). Đun sôi đến tan hoàn toàn, để nguội đến 50 - 600C, điều chỉnh pH đến 7,0, cho thêm 1g glucoza và riêng môi trường dùng cho vi khuẩn ưa nhiệt cần cho thêm 0,04g bromcrezala đỏ. Chuyển môi trường vào trong bình (nếu là môi trường đặc) hoặc ống nghiệm (nếu là môi trường lỏng) và thanh trùng trong nồi hấp ở 121 ± 10C trong 15 phút.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật ưa ấm, vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt có khả năng tạo axit và vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện.
5.5. Canh thang (thạch) khoai tây - pepton
Cho 1 lít nước máy vào 200g khoai tây đã rửa sạch và cắt nhỏ rồi đun sôi 15 - 20 phút, tránh nhừ quá, sau đó lọc qua phin bông vải màn và thêm nước vào dung dịch lọc đến thể tích ban đầu. Hoà tan 5g pepton, 5g natri clorua, 15 - 20g thạch trong dịch lọc và đun cho nóng chảy. Điều chỉnh pH 7,1 ± 0,1. Rót vào bình hoặc ống nghiệm rồi thanh trùng ở 125 ± 10C trong 30 phút. Nên duy trì tính vô trùng của môi trường bằng cách giữ ổn nhiệt ở 55 - 620C trong 48 giờ.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt và vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện.
5.6. Canh thang (thạch) thịt - pepton
Cho 10g pepton, 5g natri clorua vào 1000ml nước thịt. Điều chỉnh pH 7,1±0,1, đun sôi và lọc qua giấy lọc. Thanh trùng ở 121±10C trong 20 phút. Khi có sự lắng cặn trong canh thang thịt - pepton thì cần lọc lại lần nữa, sau đó thanh trùng.
Để chuẩn bị thạch thịt - pepton trong 1000ml canh thang thịt - pepton, trước khi thanh trùng cần cho thêm 15 - 20g thạch và đun nhỏ lửa đồng thời khuấy đều cho thạch tan hết. Điều chỉnh pH 7,1±0,1 rồi rót vào các ống nghiệm hoặc bình cổ hẹp và thanh trùng ở 121±10C trong 20 phút.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí ưa ấm và vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện.
5.7. Canh thang (thạch) thịt - pepton - glucoza
Chuẩn bị 1000ml canh thang (thạch) thịt - pepton và trước khi thanh trùng cho thêm 1g glucoza sau đó điều chỉnh pH 7 ± 0,1 rồi thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí ưa ấm và vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện và xác định tổng số vi sinh vật bằng cách đếm trên đĩa petri.
5.8. Canh thang (thạch) thịt - pepton với Glucoza và nước chiết nấm men
Thêm trong điều kiện vô trùng 2g cao nấm men hoặc 10ml dung dịch 20% của dịch chiết nấm men vào 1000ml canh thang (thạch) thịt - pepton - glucoza.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ tiện.
5.9. Canh thang thịt - pepton với tinh bột hoà tan
Thêm 10g tinh bột vào một ít nước rồi chuyển vào nước đang sôi và khuấy đều thu được 100ml dung dịch tinh bột. Pha dung dịch thu được với 900ml canh thang thịt - pepton có chứa Triptophan (phản ứng dương tính với Triptophan), sau đó thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút. Môi trường có pH 7,1± 0,1.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí, ưa nhiệt, tạo axit và vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện.
5.10. Canh thang thịt - pepton với canxi cacbonat
Rót vào các ống nghiệm mỗi ống 5 - 6ml canh thang thịt - pepton với 1% glucoza và thêm 0,1g canxi cacbonat vô trùng. Cho vào bình cổ hẹp với 100ml môi trường 2g canxi cacbonat vô trùng và thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí ưa ấm và kỵ khí tuỳ tiện khi phân tích các sản phẩm đồ hộp chua.
5.11. Canh thang Hottinger và các môi trường, thành phần canh thang.
5.11.1. Để chuẩn bị dung dịch Hottinger gốc, ngâm 1kg thịt đã cắt nhỏ thành miếng vào 1000ml nước đang sôi, trong 20 phút, rồi vớt ra, nghiền nhỏ bằng cối xay thịt và lại cho tiếp vào chính nước hầm trên. Cho thêm 30 - 40g tuyến tuỵ nghiền nhỏ (có thể thay tuyến tuỵ bằng 3 - 5g Pancreatin) và 20ml Cloroform. Dùng nút đậy kín chai lại và lắc mạnh, (giữ chặt nút). Giữ ở nhiệt độ 370C trong vòng 3 - 4 giờ.
Thịt ở dạng miếng nhỏ mịn lắng xuống đáy chai, phần chất lỏng phía trên phải trong suốt. Rót chất lỏng ra và lọc sau đó thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút. Dung dịch thu được phải cho phản ứng dương tính đối với triptophan (có màu hồng khi thêm 2 giọt nước brom vào ống nghiệm có nút).
5.11.2. Để chuẩn bị canh thang, cần pha trộn 200ml dung dịch ở Hottinger gốc với 400ml nước hầm thịt và 400ml nước, thêm tiếp 5g natri clorua, 0,2g natri dihydophotphat hoặc kali dihydrophotphat, đun sôi 10 phút, điều chỉnh đến pH 7,6. Rót mạnh canh thang Hottinger vào các ống nghiệm hoặc bình cổ hẹp có chứa sẵn thịt chín hoặc thịt băm ở đáy. Đổ lớp dầu vaselin vô trùng dày 2 cm lên trên và thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút.
5.11.3. Để chuẩn bị môi trường Hottinger đặc với tripton, glucoza và cao nấm men, cần thêm vào 1000ml canh thang Hottinger một lượng gồm 0,5g cao nấm men hoặc 2,5ml dịch chiết nấm men 20%; 5g glucoza, 5g tripton, 15 - 20g thạch, sau đó điều chỉnh pH môi trường đến 7 ± 0,10C trong 20 phút. Trước khi sử dụng, cần thêm một cách vô trùng 0,6g axit ascorbic vào môi trường vô trùng đang nóng chảy.
5.11.4. Môi trường Hottinger đặc với glucoza và nước chiết nấm men chuẩn bị theo điều 5.11.3 của tiêu chuẩn này nhưng không có Tripton và axit ascorbic.
5.11.5. Canh thang Hottinger và môi trường Hottinger đặc với tripton, glucoza và nước chiết nấm men được dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí ưa ấm. Môi trường Hottinger đặc với glucoza và nước chiết nấm men dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí ưa ấm và vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện.
5.12. Canh thang (thạch) VF với gan
Chuẩn bị 2kg thịt đã lược mỡ, gân và màng, xay nhỏ bằng cối xay thịt rồi đem trộn với 500g gan băm nhỏ, không chứa chất ức chế sự phát triển của vi sinh vật và 9 lít nước trong bình tráng men. Đun nóng đến 500C và thêm 100ml dung dịch axit clohydric 10%. Trộn kỹ hỗn hợp và cho thêm một lượng pepxin đã xác định trước.
Lượng pepxin cho thêm vào hỗn hợp thịt, gan và nước xác định theo độ chuẩn của pepxin, nhưng thêm nhiều hơn so với ước tính 50%. Ví dụ với độ chuẩn 1:10 cần 0,25g pepxin để phân cắt 2,5kg protein. Như vậy, thực tế cần thêm 0,375g pepxin. Để pepxin tác dụng lên hỗn hợp trong 20 giờ ở 500C trên bếp cách thủy. Sau 20 giờ dưới tác dụng của pepxin, hỗn hợp phải cho phản ứng Biure dương tính và phản ứng với triptophan.
Để kiểm tra phản ứng Biure, cần dùng 5ml lớp trên của hỗn hợp được phân cắt cho 1 - 2 giọt dung dịch hydroxit natri nồng độ 20mol/1 lít để kiềm hoá và thêm vài giọt dung dịch sunphit đồng 1%. Chấm dứt quá trình phân cắt bằng việc đun nóng đến 85%. Tách thịt băm khỏi hỗn hợp bằng cách lọc qua vải thêm natri hydroxit điều chỉnh đến pH 5,6. Đun sôi hỗn hợp 5 phút, để nguội và lọc qua giấy lọc thêm natri hydroxit và điều chỉnh pH = 7,4. Đo thể tích nước hầm và thêm 1,5% pepton vào và nếu cần, 1,5 - 2% thạch.
Sau khi hoà tan pepton và thạch (đun nóng) lại điều chỉnh pH 7,4. Rót canh thang hay thạch vào bình và thanh trùng ở 127 ± 10C trong 20 phút.
Để chuẩn bị nước hầm với gan, cần cho khoảng 1 - 1,5g các mẩu gan chính vào các ống nghiệm và rót canh thang vào đến độ cao 10 - 15cm. Thanh trùng ở 127 ± 10C trong 20 phút.
Dùng cho vi sinh vật kỵ khí ưa ấm, kể cả tác nhân gây ngộ độc thịt.
5.13. Môi trường do clostridium chọn lọc D.R.CM (lỏng sệt hay đặc)
Cho vào 800ml nước cất 10g cao thịt (cho phép thay nước cất và cao thịt bằng 800ml nước thịt). 10g pepton 1,5g cao nấm men 20% hay 7,5ml dịch chiết men 5g natri axetat. Chuẩn bị riêng hồ tinh bột bằng cách cho 1g tinh bột tan trong một ít nước rồi chuyển vào nước đang sôi, đồng thời khuấy liên tục và thêm thể tích đến 200ml.
Pha trộn hồ thu được với 800ml hỗn hợp trên và đun sôi trên bếp cách thủy trong 30 phút. Sau khi sôi, thêm vào dung dịch 1g glucoza và 0,5 Sixtein hidroclorua L rồi điều chỉnh pH dung dịch đến 7,0±1. Lọc dung dịch nóng qua giấy lọc. Để chuẩn bị môi trường sệt, cần cho thêm vào dung dịch 0,2% thạch, môi trường đặc thêm 1,5 - 2% thạch.
Thanh trùng các môi trường trong nồi hấp ở 121 ± 10C trong 15 phút.
Các dung dịch sunphit natri (Na2SO3.7H2O) 4% và dung dịch sắt xitrat (FeC6H5O7.5H2O) 7% (khi chuẩn bị dung dịch sắt xitrat, cần đun nóng dung dịch trong 5 phút) được thanh trùng bằng cách lọc qua màng lọc và bảo quản riêng rẽ ở 3 - 50C trong bình cổ hẹp đậy kín trong thời gian không quá 14 ngày.
Trước khi sử dụng, cần hoạt hoá và để nguội sôi trường gốc. Pha trộn các dung dịch Natri Sunfit và Sắt xitrat với nhau theo cùng thể tích và cho thêm một cách vô trùng vào môi trường đã để nguội theo tỷ lệ 0,5ml hỗn hợp ứng với 25ml môi trường gốc.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí ưa ấm và xác định khả năng khử Sunfit của vi sinh vật.
5.14. Sữa quỳ tím
Cho rượu quỳ vào sữa vô trùng cho đến khi thu được màu tím nhạt (với 100ml sữa cần khoảng 1ml rượu quỳ). Rót mạnh sữa quỳ tím vào các ống nghiệm vô trùng, sau đó đun sôi trên bếp cách thủy, trong 15 - 20 phút và để nguội đến 450C để nuôi cấy.
Dùng cho clostridium ủ ấm khi phân tích đồ hộp sữa.
5.15. Môi trường Bliephend đặc
Hoà tan vào 800ml nước cất 10g lactoza, 10g glucoza, 5g pepton. Đun sôi và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 4g cao nấm men hoặc 20ml dịch chiết nấm men 20%, 5g canxi cacbonat nghiền nhỏ ngay trước khi sử dụng, đưa pH đến 7,3 ± 0,1 và thêm 15 - 20g thạch; hoà tan các hợp phần rồi rót môi trường vào các bình vô trùng và thanh trùng ở 117 ± 10C trong 20 phút, không lâu hơn.
Dùng để nuôi cấy vi khuẩn lactic.
5.16. Môi trường Bliephend lỏng
Hoà tan vào 800ml nước cất 10g lactoza, 5g pepton, 10g glucoza rồi đun sôi và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 4g cao nấm men hoặc 20ml dịch chiết nấm men 20% và 10ml dung dịch bromcrezola đỏ, điều chỉnh pH 7,3 ± 0,1, rót vào bình vô trùng và thanh trùng ở 117 ± 10C trong 20 phút, nhưng không lâu hơn.
Dùng để nuôi cấy vi khuẩn lactic.
5.17. Môi trường Winson - Blar dùng cho vi khuẩn kỵ khí
Chuẩn bị dung dịch phèn sắt amoni 5% và dung dịch Natri sunfit 20% trong nước cất vô trùng extempore. Thanh trùng dung dịch natri sunfit bằng luồng hơi nóng trong 1 giờ. Thêm 10ml dung dịch natri sunfit và 1ml dung dịch phèn sắt amoni vào 100ml thạch thịt - pepton với 1% glucoza đã nấu chảy và để nguội đến 800C. Điều chỉnh pH 7,5 - 7,8, rót môi trường vào các đĩa Petri và sấy đĩa trong máy ổn nhiệt.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí ưa ấm và xác định khả năng khử sunfit của chúng.
5.18. Môi trường thịt luộc
Cho 500g thịt đã lọc xương, mỡ, gân hoặc tim của trâu bò vào 500ml nước cất đang sôi có chứa 1,5ml dung dịch natri hydroxit 1mg/1 lít và đun sôi trong 20 phút.
Gần kết thúc sôi, cho thêm một lượng cần thiết axit lactic để đưa pH hỗn hợp đến 7,0. Lọc chất lỏng nóng qua phin lọc bông vải màu. Cho vào dịch lọc một lượng pepton cần thiết để có nồng độ 0,5% và một lượng Natri clorua đủ để đạt nồng độ 0,25%. Tiếp tục đun sôi chất lỏng thu được trong 20 phút, thêm tiếp vào 1ml axit clohydric và lọc. Đưa pH của dịch lọc đến 8,2 và đun sôi trong 3 phút. Sau đó, điều chỉnh pH 7,7 - 7,8. Cho vào mỗi ống nghiệm 2,5g thịt và rót tiếp 10ml chất lỏng chuẩn bị ở trên vào. Thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút. Sau khi thanh trùng pH của môi trường phải là 7,4 - 7,5. Để tách vi sinh vật kỵ khí tiêu thụ đường, cần thêm 6,5 - 1% glucoza vào môi trường.
Dùng thạch nghèo, dầu vazelin hoặc hỗn hợp parafin để tạo lớp phủ bề mặt môi trường.
Dùng để nuôi cấy vi khuẩn lactic.
5.19. Môi trường nước cà chua
Cho vào 700 ml nước 300 ml nước cà chua, 2g cao nấm men hoặc 10ml dịch chiết nấm men 20%, 10g glucoza, điều chỉnh pH 5,5 - 5,6 và lọc. Rót vào mỗi bình vô trùng 100 ml và thanh trùng trong nồi hấp (117 ± 10C) trong 20 phút. Chuẩn bị riêng 20g thạch trong 500 ml nước cất bằng cách đun nóng rồi rót vào các bình định mức, mỗi bình 100 ml và thanh trùng trong nồi hấp ở 121 ± 10C trong 20 phút. Trước khi cấy, trộn lẫn 100ml môi trường lỏng với 100ml thạch nóng chảy, trong điều kiện vô trùng. Chuyển môi trường thạch thu được vào các đĩa chứa 0,25g canxi cacbonat vô trùng.
Dùng để nuôi cấy vi khuẩn lactic.
5.20. Môi trường Kitt - Taroxi
Cho vào các ống nghiệm vô trùng vài miếng thịt hoặc gan. Rót vào mỗi ống nghiệm 10 - 12ml canh thang thịt pepton 0,3% glucoza có hoà tan trước 0,15% thạch hoặc 0,1% tinh bột. Thanh trùng trong nồi hấp ở 121 ± 10C trong 20 phút, pH môi trường sau khi thanh trùng phải đạt 7,1 ± 0,1.
Khi chuẩn bị môi trường dự trữ cần thay việc thêm thạch hoặc tinh bột bằng việc tạo lớp dầu vaselin dày 1,5 - 2cm trên bề mặt môi trường trong ống nghiệm trước khi thanh trùng. Khi dùng môi trường Kitt - Taroxi mà không thêm 0,15% thạch hoặc dầu Vaselin thì cần phủ một lớp thạch nghèo hoặc hỗn hợp parafin dày 1 - 1,5cm lên bề mặt môi trường sau khi cấy xong.
Dùng để nuôi cấy và vi sinh vật kỵ khí ưa nhiệt và ưa ấm.
5.21. Môi trường Kitt - Taroxi có Canxi cacbonat
Cho một ít canxi cacbonat vào đáy các ống nghiệm hoặc bình cổ hẹp chuyên dùng cho môi trường Taroxi rồi thanh trùng bằng khí nóng theo TCVN 4886 - 89 (ST SEV 3013 - 81) cho thêm vài miếng thịt hoặc gan và rót canh thang thịt - pepton có glucoza vào khi chuẩn bị môi trường Taroxi theo trình tự như trên.
Dùng cho vi sinh vật kỵ khí để kiểm tra các sản phẩm đồ hộp chua.
5.22. Môi trường Kitt - Taroxi chứa canxi cacbonat, nước chiết nấm men và axit ascorbic
Chuẩn bị như môi trường Kitt - Taroxi có canxi cacbonat nhưng cần thêm 2g cao nấm men hoặc 10ml dịch chiết nấm men 20% vào canh thang thịt - pepton trước khi rót canh thang thịt pepton vào các ống nghiệm. Trước khi phân tích cần thêm một cách vô trùng vào môi trường Kitt - Taroxi đã hoạt hoá có chứa canxi cacbonat và cao nấm men một lượng axit ascorbic theo tỷ lệ 100g trong 1 lít môi trường.
Dùng cho VSV kỵ khí ưa nhiệt và ưa ấm.
5.23. Môi trường Robert
Cho vào 1000ml nước cất một lượng gồm 2g nitrat kali, 2g kali dihydrophotphat, 1g thạch, 30g gelatin. Để cho gelatin nở ra và đun nóng trên bếp cách thủy đến khi gelatin và thạch tan hết, cho thêm 25ml canh thang thịt - pepton vô trùng và 10ml dung dịch 2,3,5 - Triphenyl - tetrazola clorua, sau đó điều chỉnh pH 7,1 ± 0,1 rồi thanh trùng 3 ngày liên tiếp ở 100 ± 10C mỗi lần 20 phút hoặc một lần ở 110 ±10C trong 15 phút. Môi trường phải không màu.
Dùng để nuôi cấy C.perfringens.
5.24. Môi trường Smit - Lorenx
Hoà tan bằng cách đun nóng 5g glucoza, 10g pepton hoặc tripton hay triptoza (dipco), 20g thạch trong 950ml nước. Chuẩn bị riêng dung dịch tinh bột bằng cách hoà tan 5g tinh bột tan trong 50ml nước, sau đó chuyển vào môi trường điều chỉnh pH 7,1 ± 0,1 thanh trùng ở 117 ± 10C trong 20 phút.
Sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí và vi sinh vật ưa nhiệt, có khả năng tạo axit, kỵ khí tuỳ tiện.
5.25. Môi trường tinh bột - pepton được làm giàu bằng triptophan
Hoà tan 10g pepton vào một ít nước rồi cho thêm 5g tinh bột đã hoà tan sẵn trong 50ml nước, thêm nước đến thể tích 1000ml và điều chỉnh pH 6,2 ± 0,1, lọc qua giấy lọc, sau đó thêm tiếp 500mg Triptophan, 5g glucoza, 20g thạch, đun nóng cho thạch tan hết. Thêm 10ml dung dịch bromcrezola đỏ 0,04%, rót vào bình vô trùng và thanh trùng ở 116±10C trong 20 phút.
Dùng để nuôi cấy VSV hiếu khí, tạo axit và VSV ưa nhiệt, kỵ khí tuỳ tiện.
5.26. Môi trường sunfat lactat (đặc, sệt)
Hoà tan 5g pepton trong 1 lít nước, cho thêm 4g cao nấm men hoặc 20ml dịch chiết nấm men 20%, 1,5g Natri sunfat; 1,5g magiê sunfat, 3,5g natri lactat rồi điều chỉnh pH 7,2 - 7,4, sau đó để chuẩn bị môi trường đặc cần thêm tiếp 20g thạch và môi trường sệt 1,5g thạch. Đun nóng cho tan hết và rót vào bình rồi thanh trùng ở 121 ± 10C trong 20 phút trước khi dùng, cần cho vào môi trường đã nóng chảy một lượng dung dịch muối Mor (muối sunphat kép của sắt và amoni ôxit) theo tỷ lệ 4mg/ml. Trước khi sử dụng, cần thanh trùng dung dịch muối Mor 10% bằng cách lọc qua màng lọc, sau đó cho một cách vô trùng vào mỗi ống nghiệm 4 - 5 giọt.
Có thể thay thế natri lactat bằng axit lactic đã trung hoà bởi natri hydroxit.
Dùng để nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí, ưa nhiệt D. nigrificans.
5.27. Môi trường cho Clotridium giàu dinh dưỡng (RCM)
Cho vào 1000ml nước một lượng gồm 3g cao nấm men hay 15ml dung dịch chiết nấm men 20%, 10g cao thịt, 10g pepton, 1g tinh bột tan, 5g glucoza, 0,5g xistein hydro clorua, 5g natri clorua, 3g natri axetat hoặc 5g nước natri axetat, 0,5g thạch đối với môi trường sệt hoặc 1,5g thạch đối với môi trường đặc. Đun nóng và lắc liên tục môi trường đến khi sôi, cho sôi đến khi các thành phần tan hết, làm nguội dung dịch đến 50 - 600C và đưa pH đến 7,0. Rót mạnh môi trường sệt vào các ống nghiệm, còn môi trường đặc thì rót vào các bình, sau đó thanh trùng ở 115 ± 10C trong 20 phút.
Môi trường sệt cần được hoạt hoá ngay trước khi sử dụng, còn môi trường đặc sau khi được rót vào đĩa petri, cần đem sấy.
Cho phép sử dụng 1000ml nước thịt thay cho cao thịt và nước.
Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí ưa ấm.
PHỤ LỤC THAM KHẢO
1. ST SEV 435 - 77. Thuốc thử. Phương pháp chuẩn bị thuốc thử và dung dịch phụ.
2. ST SEV 804 - 77. Thuốc thử. Hướng dẫn chung việc tiến hành thử.
3. ST SEV 809 - 77. Thuốc thử và chất tinh khiết đặc biệt, chỉ thị hoá học. Chuẩn bị dung dịch chỉ thị.
4. ST SEV 1052 - 78. Đơn vị đo lường các đại lượng vật lý.
Ý kiến bạn đọc
