Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5306:1991 (ST SEV 5625-86) về thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định độc tố nấm Fuzariotoxin do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5306:1991

(ST SEV 5625-86)

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ NẤM FUZARIOTOXIN

Animal feeding stuffs

Method for determination of Fuzariotoxin

TCVN 5306-1991 phù hợp với ST SEV 5625 - 86.

TCVN 5306-1991 do Trung tâm Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng khu vực 1 biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị và được ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành theo quyết định số 49/QĐ ngày 21 tháng 1 năm 1991.

Tiêu chuẩn này áp dụng cho thức ăn chăn nuôi và quy định phương pháp xác định Zaralenon (độc tố F-2) và độc tố T-2 trong hạt.

Tiêu chuẩn này phù hợp với ST SEV 5625-86.

1. Nguyên tắc của phương pháp

Dùng hỗn hợp dung môi Clorofooc - metanol chiết xuất độc tố F-2 và T-2 từ mẫu thức ăn chăn nuôi, làm sạch chất chiết xuất thu được và xác định tiếp theo từng loại độc tố trên máy sắc ký lớp mỏng trên cơ sở phát hiện bằng mắt sự phát quang của các dẫn xuất của chúng.

2. Quy đinh chung

2.1. Khi tiến hành thử cần tuân thủ yêu cầu của các qui định hiện hành.

2.2. Khi tiến hành thử nếu không có các chỉ dẫn khác thì sử dụng thuốc thử loại “tinh khiết phân tích” và nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

2.3. Mức phát hiện tối thiểu khi xác định bằng phương pháp này là không nhỏ hơn 100mg/kg đối với độc tố F-2 và không nhỏ hơn 500mg/kg đối với độc tố T-2.

3. Thiết bị.

3.1. Thiết bị để làm sắc ký lớp mỏng gồm: Máy trải lớp mỏng, buồng sắc ký, bình triển khai dung tích 5; 10; 50 mm³, các tấm kính 20 x 20 cm.

3.2. Nguồn phát tia cực tím với bước sóng 254 và 365 mm.

3.3. Thiết bị rung lắc

3.4. Tủ sấy, đảm bảo điều chỉnh nhiệt độ đến 150°C.

3.5. Bếp chưng cách thủy

3.6. Máy nghiền thí nghiệm, đảm bảo độ mịn không lớn hơn 1mm.

3.7. Cân kỹ thuật có sai số ± 0,1g

3.8. Cân phân tích có sai số ± 0,00001g

3.9. Bơm phun nước

3.10. Máy bốc hơi chân không loại quay

3.11. ống đong hình trụ dung tích 5; 10 và 100 cm³

3.12. Bình đong dung tích 10 cm³

3.13. Pipet dung tích 1, 2 và 5 cm³

3.14. Bình cầu đáy tròn dung tích 100; 250 và 500 cm³ với độ mỏng bình thường.

3.15. Bình cầu đáy nhọn dung tích 5; 10 và 500 cm³ với độ mỏng bình thường.

3.16. ống nghiệm chia độ với độ mỏng bình thường.

3.17. ống nghiệm nhám với độ mỏng bình thường.

3.18. Phễu Bucne đường kính 10 cm

3.19. Phễu chia có dung tích 100 cm³

3.20. Sàng có đường kính lỗ 1 mm

3.21. Máy phun mù có dùng chất lỏng

3.22. Bình Bunden dung tích 500 cm³

3.23. Bình hút ẩm để bảo quản các tấm lớp mỏng

4. Thuốc thử, dung tích và vật liệu

4.1. Clorofooc

4.2. Metanol

4.3. N-hecxan

4.4. Natri nitrit, dung dịch nước 5%

4.5. Natri hydroxyt, dung dịch nước 10%

4.6. Natri sunfat khan

4.7. Benzidin

4.8. Hỗn hợp Clorofooc và metanol theo tỷ lệ thể tích 95+5;

4.9. Natri Clorua, dung dịch nước 0,85%

4.10. Natri cacbonat, dung dịch nước 10%

4.11. Axit clohydric, dung dịch nước 2,5%

4.12. Axit sunfuric, dung dịch 20% trong etanol

4.13. Benzidin - dung dịch 0,5% trong hỗn hợp etanol - nước theo tỷ lệ thể tích 1+1, độ pH 1;

4.14. Dung dịch benzidin

Dung dịch này được chuẩn bị như sau: ở nhiệt độ 0°C, trộn các thể tích bằng nhau của dung tích nước 5% Natri nitrit và dung dịch benzidin 0,5% trong hỗn hợp etanol - nước. Sau đó dùng dung dịch nước 10% natri hydroxyt tạo độ pH của dung dịch bằng 5.

4.15. F-2 và T-2 dung dịch

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ban đầu: Cho 1mg zearalenon hay độc tố T-2 vào bình đong dung dịch 10cm³, hoà tan nó trong clorofooc và thêm đến vạch. Nồng độ dung dịch phải đạt 0,1mg/cm³.

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc:

Đổ 1 cm³ dung dịch chuẩn ban đầu vào bình đong dung tích 10cm³ và pha thêm clorofooc đến vạch. Nồng độ dung dịch phải đạt 10mg/cm³.

4.16. Các tấm chuẩn để sắc ký màng mỏng (loại của Tiệp Khắc).

Ví dụ: Dùng 20 tấm silyphon 20 x 20 cm dày 0,2 mm hoặc chuẩn bị như sau : đem 7g silicagen tạo huyền phù cẩn thận trong 10 cm³ nước và dùng máy trải lớp mỏng phết chất huyền phù đều lên tấm kính đã khử dầu một lớp có độ dày từ 0,2 đến 0,3 mm. Sau khi phơi khô ngoài không khí, đem sấy trong tủ sấy với nhiệt độ tăng dần đều đến 105°C và giữ ở nhiệt độ này trong vòng 2h. Sau đó tắt tủ sấy và để nguội tấm kính đến nhiệt độ phòng làm việc và cho vào bình hút ẩm. Các tấm này được bảo quản trong bình hút ẩm không quá 4 tuần.

4.17. Silicagen cho sắc ký lớp mỏng.

4.18. Giấy lọc lọc nhanh

4.19. Khí trơ, ví dụ nitơ

5. Chuẩn bị thử

5.1. Chuẩn bị chất chiết suất của mẫu thử thức ăn chăn nuôi. Trộn đều, cẩn thận mẫu thử và lấy ra 30gam đem nghiền, sàng và trộn kỹ. Cân 25g mẫu thử với sai số không lớn hơn ± 1,0g và đổ vào bình dung tích 500 cm³. Rót vào bình này 15cm³ dung dịch nước 0,85% natriclorua và khuấy đều.

Sau 2h trương nở, đổ thêm 5cm³ metanol, khuấy đều và đổ 45 cm³ clorofooc. Sau đó đậy nắp bình, đưa lên máy rung và rung trong vòng 2h. Lọc hỗn hợp trong chân không qua giấy lọc và cặn còn lại trên giấy lọc rửa 2 lần bằng 20cm³ clorofooc. Các chất chiết thu được cho bốc hơi chân không.

5.2. Tinh chế chất chiết

Thêm 15cm³ dung dịch nước natriclorua 0,85% và 30cm³ N-hecxan vào cặn khô của chất chiết, lắc dung dịch và chuyển sang phễu tách. Đổ bỏ pha ở trên (bay hơi), còn pha nước đem rửa 2 lần 20cm³ N-hecxan, loại bỏ tiếp N-hecxan, sau đó pha nước đem chiết 3 lần theo từng phần một trong 20cm³ clorofooc.

Lọc toàn bộ pha chứa clorofooc qua lớp natri sunfat khan đặt trên giấy lọc trong phễu thủy tinh. Sau đó cho phần lọc bay hơi trong bình đáy nhọn dung tích 100cm³ đến thể tích còn lại gần 1cm³. Đổ chất chiết đậm đặc vào ống chia độ, rửa bình đáy nhọn 2 lần bằng 0,5cm³ clorofooc. Nước rửa đổ vào cùng ống chia độ và thêm clorofooc để có thể tích 2,5cm³, bảo quản dung dịch thử trong bình kín và đặt trong tủ lạnh cho đến khi phân tích.

5.3. Phết dung dịch chuẩn làm việc và dung dịch thử lên các tấm để sắc ký lớp mỏng.

5.3.1. Độc tố T-2.

Lấy 2 tấm và nhỏ 10 mm³ dung dịch thử vào góc dưới phía bên trái cách 1cm về phía trong tấm, nhỏ tiếp cách giọt 5cm³ dung dịch chuẩn làm việc, cách mép dưới và mép trái tấm chuẩn 14cm vạch một dấu.

5.3.2. Zearalenon

Nhỏ 2 giọt, mỗi giọt 10mm³ mẫu chất chiết thử lên tấm chuẩn vào góc dưới phía trái cách các mép và cách nhau 2cm.

Chất chiết được chuẩn bị như sau: Lấy 0,5cm³ dung dịch thử có được theo điều 5.2. Cho bốc hơi ở nhiệt độ 40°C trong dòng khí trơ và cặn thì chuyển vào 100mm³ clorofooc.

Nhỏ thêm lên một trong hai vết 5mm³ chuẩn làm việc (chuẩn nội bộ). Cũng trên tấm này, nhỏ các mẫu của dung dịch chuẩn làm việc zearalenon với các thể tích 5; 10; 25 và 50mm³.

5.4. Chuẩn bị buồng sắc ký.

Trước khi tiến hành sắc ký 30 phút; với 2 buồng có vách bên trong lót giấy lọc, đổ vào 1 buồng 100 cm³ hỗn hợp clorofooc metanol theo tỷ lệ thể tích 9535 và 100cm³ N-hecxan vào buồng kia, sau đó đậy nắp các buồng lại.

6. Tiến hành thử

6.1. Sắc ký

6.1.1. Thử sự có mặt của độc tố T-2.

6.1.1.1.Nhúng theo cạnh dưới tấm đã được chuẩn bị sẵn vào buồng có chứa hỗn hợp clorofooc - metanol (95+5). Sau khi bề mặt của hỗn hợp dung môi ngập đến mức 14cm cách đường xuất phát thì lấy chuẩn ra khỏi buồng và sấy trong tủ hút.

6.1.1.2. Nhúng lại tấm chuẩn này vào cùng buồng thử theo cạnh đứng bên trái và lặp lại việc sắc ký theo điều 6.1.1.1.

6.1.2. Thử sự có mặt của Zearalenon.

Nhúng theo cạnh dưới tấm chuẩn đã được chuẩn bị sẵn vào buồng thử có chứa N-hecxan. Sau khi bề mặt của dung môi ngập đến 14cm cách đường xuất phát thì lấy tấm chuẩn ra khỏi buồng và sấy trong tủ hút. Sau đó lại nhúng tấm chuẩn này vào cùng buồng thử đó và lặp lại việc sắc ký. Sau khi sấy, nhúng tấm chuẩn theo cạnh dưới vào buồng thử chứa hỗn hợp clorofooc - metanol (95+5). Sau khi bề mặt của hỗn hợp dung môi ngập đến mức 14cm cách đường xuất phát thì lấy tấm chuẩn ra và sấy trong tủ hút.

6.2. Đánh giá sắc phổ

6.2.1. Phát hiện độc tố T-2.

Vẩy dung dịch 20% axit sunfuric trong cồn lên tấm chuẩn đã phơi khô ngoài không khí và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105°C trong 20 phút, soi tấm chuẩn đã để nguội trong buồng tối bằng tia cực tím có độ dài bước sóng 365mm, cách nguồn phát sáng 20cm. Sau đó, xác định các vết phát sáng của độc tố T-2 của dung dịch chuẩn ở cả hai hướng phân chia và giao điểm của các đường quy ước chạy song song với bề mặt của hệ phân chia qua các vết độc tố T-2 của hướng phân chia thứ nhất và thứ hai.

Trong trường hợp có độc tố T-2 trong chất chiết thử thì phải phát hiện được vết phát quang của loại vi độc tố này tại giao điểm của các đường.

6.2.1.1. Khẳng định độc tố T-2.

Việc khẳng định sự tồn tại của độc tố T-2 phải được thực hiện nhờ chất benzidin đã được diazôt hoá. Để thực hiện việc này cần chuẩn bị thêm một tấm hiện sắc ký lớp mỏng với dung dịch chất chiết cần thử, dung dịch chuẩn độc tố T-2 và cả với chuẩn nội bộ. Tiến hành kiểm hoá sơ bộ bằng cách vẩy lên tấm chuẩn dung dịch nước 10% Natri cacbonat. Sấy tấm chuẩn ở nhiệt độ 105°C trong 20 phút. Sau đó vẩy tiếp lên tấm chuẩn dung dịch benzidin đã điazôt hoá mới pha. Sau khi sấy, vẩy tiếp dung dịch nước 2,5% axit clohydric. Khi có độc tố T-2 thì thuốc thử nhạy nitơ bị nhuộm sang màu da cam, chứng tỏ sự có mặt của độc tố T-2 trong mẫu thử với nồng độ không nhỏ hơn 500mg/kg. Khi xử lý tấm chuẩn phải giới hạn vùng Rc của độc tố T-2.

6.2.2. Phát hiện Zearalenon.

Soi tấm chuẩn đã phơi khô ngoài không khí với các chuẩn và chuẩn nội bộ của zearalenon trong phòng tối bằng tia cực tím có độ dài bước sóng 254 nm và cách nguồn phát sáng 20 cm. Nếu tại khu vực Rc của chuẩn trong chất chiết xuất cần thử có vết phát sáng màu vàng - xanh thì kết luận sơ bộ về sự có mặt của zearalenon.

6.2.2.1 Khẳng định sự có mặt của Zearalenon.

Việc khẳng định sự có mặt của Zearalenon được thực hiện nhờ chất benzidin điazot hoá. Vùng Rj của chuẩn cần được vảy đều. Sau vài phút có thể quan sát thấy sự hình thành các vết màu da cam chứng tỏ sự có mặt của zearalenon trong mẫu thử với nồng độ không nhỏ hơn 100mg/kg.

7. Biên bản thử

Biên bản thử phải có các số liệu sau:

1. Tên thức ăn chăn nuôi và nguồn gốc của nó;

2. Khối lượng mẫu;

3. Điều kiện thử;

4. Kết quả thử;

5. Ngày tiến hành thử;

6. Ký hiệu tiêu chuẩn này.

 

PHỤ LỤC 1

SƠ ĐỒ SẮC KÝ LỚP MỎNG

Độc tố T-2.

1 : 10 mm³ dung dịch cần thử

2 và 3 : 5 mm³ dung dịch cần thử và 5mm³dung dịch chuẩn (50mg độc tố T-2).

4 và 5 : 5 mm³ dung dịch làm việc.

 

PHỤ LỤC 2

SƠ ĐỒ SẮC KÝ LỚP MỎNG

Zearalennon (độc tố F-2).

1 : 10 mm³ dung dịch cần thử (đậm đặc)

và 5 mm³ dung dịch tiêu chuẩn (50mg độc tố).

2 : 10 mm³ dung dịch cần thử (đậm đặc)

4 , 5 : .... lượng dung dịch làm việc khác nhau 5, 10; 25; 50....mm³.