Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5157:1990 về thịt và sản phẩm của thịt - phương pháp phát hiện virut dịch tả lợn do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5157-90

THỊT VÀ SẢN PHẨM CỦA THỊT

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI RÚT DỊCH TẢ LỢN

Cơ quan biên soạn: Trung tâm kiểm dịch động vật xuất nhập khẩu Hà Nội

Cơ quan đề nghị ban hành:

Bộ Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm

Cơ quan trình duyệt: Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng

Cơ quan xét duyệt ban hành:

Uỷ ban Khoa học Nhà nước

Quyết định ban hành số: 736/QĐ ngày 31 tháng 12 năm 1990

 

TCVN 5157-90

THỊT VÀ SẢN PHẨM CỦA THỊT

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI RÚT DỊCH TẢ LỢN

Meatandmeatproducts

DetectionofSwinefevervirus

Tiêuchuẩnnàyquyđịnhphươngpháppháthiệnvi-rútdịchtảlợnbằngkhángthể globulin dịch tả lợn gắn huỳnh quang iso - thyocyanat (Conjugat kháng thể huỳnh quang).

1. Đặc tính chung

Virútdịchtảlợngâybệnhcholợnởcáclứatuổi.Bệnhtiếntriểnnhanhdướithểbại huyết,cóthânnhiệtcao,triệuchứngvàbệnhtíchchínhlàxuấthuyết,hoạitửvàliệtthần kinh.Virútsinhtrưởngđượctrêntếbàothậnlợn,nhưngthườngkhônggâyđượcnhững biếnđổitrêntếbào.

2. Nguyên tắc

Khi kháng nguyên dịch tả lợn gặp conjuget kháng thể huỳnh quang thì kết hợp thànhphúchợpkhángnguyên-khángthểhuỳnhquang.Phúchợpnàyquakínhhiểnvi huỳnh quang phát ra những đốm sáng màu sắc riêng biệt.

3. Lấy mẫu

3.1 Tiêu chuẩn này dùng để xác định bệnh dịch tả lợn cho một lô lợn.

3.2Lôlợnlàsốlượnglợncócùngnơixuấtphát(trại,phường,xã)đượcvậnchuyểntrong mộtthờigian,khinhậpvềđượcnuôiởmộtkhuriêng(cáchlytânđáo)khôngtiếpxúcvới các môi giới truyền bệnh khác.

3.3Mẫuthửlàamydan,lách,hạchlàmbavừachếthoặcvừagiếtmổ.Bằngthaotácvô khuẩnlấyvàđựngmẫuvàohộp(bình,lọ)thuỷtinhhoặcchấtdẻo,cónắpđậykínđểtrong phíchlạnh,cóchứađávụntrộnlẫnvớimuốiăn(NaCl)vàchuyểnnhanhvềcơquankiểm dịch trong vòng 24-48 giờ.

3.4.Mộtnửamẫuđểkiểmnghiệm,phầncònlạiđểlưu.Mẫulưuđượcbảoquảnởnhiệtđộ tối thiểu 15^oC không quá 1 tháng.

Chú thích:

a/Cơquankiểmdịchchỉnhậnmẫuthửtheođúngquyđịnhtrên(3.3), kèmtheobảnkhaibáovềlôlợnnghibệnh(nguồngốc,sốlượng,trọnglượng,ngàynhận, ngàyphátbệnh,sốlợnốm,chết,triệuchứng,bệnhtích…).

b/ Đểđịnhbệnhđượcchínhxácthìsaukhinhận đượcmẫuvàbáocáo, cơquankiểmdịchphảicửngaybácsĩthúyđếnnơiđểxácminhtìnhhìnhdịch,kếthợp tìnhhìnhtạichỗvớikếtquảphòngxétnghiệmvànếucầnđượcphépmờinhữngcơquan chuyêntrách(trongvàngoàinước) để cùng định bệnh.

4.Thiếtbịvàdụngcụ

4.1Thiếtbị.

4.1.1.Phòngcấyvôkhuẩn,trongcótủcấytay(thanhtrùngphòngcấyvàtủcấybằngđèn cựctím1,5-2,5oát/m³ trong3giờ,sauphunphenol5%hoặcxôngformonrồiphunphenol 5%.

4.1.2. Tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ ổn định 35-37-43 ±1^oC.

4.1.3Tủsấykhô.

4.1.4Tủhấp ướt.

4.1.5.Nồicấtnước 2 lần bằng thuỷ tinh.

4.1.6.Tủlạnh0-4^oC.

4.1.7.Tủlạnh-35^oC.

4.1.8.Bìnhchứanitơlỏng.

4.1.9.MáycắtlạnhcóbìnhkhíCO₂.

4.1.10. Nồi đun cách thuỷ có điều chỉnh nhiệt độ ổn định từ 35-56^oC.

4.1.11.Lytâmthôngthường,5.000vòng/phútvàốnglytâmđáynhọn.

4.1.12.Máyxaythịt.

4.1.13.Máykhuấytừ.

4.1.14. Cân phân tích có độ chính xác không lớn hơn 0,01g.

4.1.15.Cânthiênbìnhroberval)cỡnhỏ(50-100g).

4.1.16.Buồngđếmbạchhuyếtcầu.

4.1.17.Kínhhiểnvicóthịkínhx10,x15.

4.1.18. Kính hiển vi huỳnh quang và các linh kiện.

4.1.19. Máy đo pH có độ chính xác hiệu chỉnh là 0,1 đơn vị pH ở 25^oC.

4.1.20.Phễuthuỷtinhđường kính 3cm.

4.1.21.Phễulọcvikhuẩn:Seitz,EKS2,SephadexG25,50.

4.1.22.Daobistouri,kéo,pincecácloại.

4.1.23.Đèncồn,bông,gạc,vảilọc.

4.2Dụngcụ.

4.2.1. Bình tam giác và bình cầu đáy bằng có dung tích 50, 150, 250ml.

4.2.2.Cốcđongcóchâncáccỡ.

4.2.3.Bìnhđonghìnhtrụcáccỡ.

4.2.4.PipetPasteurvàpipetcókhắcđộ1,5-10ml.

4.2.5.ĐĩaPetriđườngkính150mm,chiềucao15mm.

4.2.6.ống Leighton nuôi cấy tế bào có kèm lá kính.

4.2.7. ốngnghiệm18x150mm.

5.Hoáchất,thuốcnhuộm,môitrườngtếbàothậnlợn.

5.1.Nguyênliệucơbản:Hoáchấtdùngtrongmôitrườngphachếdungdịchphảisửdụng loạitinhkhiếtA.R.;nướccất2lầntrungtínhđãquakiểmnghiệmkhôngcótạpchấtảnh hưởngđếntếbàovàvirútsinhtrưởng.Nênsửdụngnhữngthànhphầncơbảnhoặcthành phần đã chế sẵn, nhưng khi dùng phải tuân theo chỉ dẫn của nơi sản xuất.

5.2.Hoáchất,thuốcnhuộm,môitrườngtếbào(phụlục).

5.2.1.Rửatayvànhuộmtiêubản.

5.2.1.1.Khánghuyếtthanhdịchtảlợn(đểnhuộmtrựctiếpvàgiántiếp).

5.2.1.2.Conjugatkhángthể huỳnh quang (nhuộm gián tiếp).

5.2.1.3.Conjugatkhángthể huỳnh quang (nhuộm gián tiếp).

5.2.1.4.Virútdịchtảlợncường độc tiêu chuẩn.

5.2.1.5.Dungdịchđệm muốiphosphatepH7,0.

5.2.1.6.Dungdịchxanhevans.

5.2.1.7.DungdịchđệmTrispH8,6.

5.2.1.8.Axêton.

5.2.2.Chếmôitrườngvàxửlýmẫuthửtrướckhicấy.

5.2.2.1.Clorofooc.

5.2.2.2.Natrihydrocacbonat,dungdịch1,4%và7%(NaHCO3).

5.2.2.3.Dungdịchđỏphenol(phenolred).

5.2.2.4.Dungdịchkhángkhuẩntố PenicillinvàStreptomycin.

5.2.2.5. Dung dịch muốn điện giải Hanks.

5.2.2.6.Dungdịchtrypsin.

5.2.2.7.Dungdịchhydro-lysat-lactabunin.

5.2.2.8.DungdịchHanksđểxửlýmẫuthửvàrửatếbào.

5.2.2.9.DungdịchVersen.

5.2.2.10.Huyếtthanhbêsơsinh.

5.2.3.Môitrườngtếbào.

5.2.3.1. Môi trường Eagle cần thiết cho tế bào sinh trưởng (minimum essential medium

Eagle-growth;MEM-G).

5.2.3.2.MôitrườngEaglecầnthiếtđểbảoquảntếbào(miniumessentialmediumEagle- mainterance;MEM-M).

5.2.4.Kỹthuậtsảnxuấttếbàothậnlợn.

6.Cáchtiếnhành.

6.1.Tuỳtheotìnhhìnhvàđiềukiệncủatừngcơsởmàtiếnhànhtrướcsauhoặccùngmột lúc cả hai phươngpháp:Nhuộmtrựctiếpvàgiántiếp.

6.2.Phươngphápnhuộmtrựctiếpmẫuthửcắtlạnhhoặcépin.

6.2.1.Chuẩnbịmẫuthử-Dùngmáycắtlạnh,cắtmẫuthửthànhnhữnglátcắtcóđộdày từ5-6micromét.Đặtnhẹvàdànđềulátcắtlên2phiếnkínhAvàBbằngmũipinceđầu nhọn(mỗiphiếnkínhđặttừ2-3lát)hoặcépinmẫuthửthànhcácvếtmỏng(thaycholát cắt). Hong khô tiêu bản và cố định bằng axêton ở -25^oCtrong60phút.

6.2.2.Nhuộm.

6.2.2.1.PhiếnkínhA(đểxácđịnhvirútdịchtảlợn)đặttrênlớpbôngthấmnướctrongđĩa petri,nhỏ0,2-0,3mlconjugatkhángthểhuỳnhquang(thuốcnhuộmtrựctiếp)lêntiêubản, ủ37^oCtrong30phút.Lấyrangâmrửa3lần,mỗilần10phútbằngdungdịchđiệnmuối photphatpH7,0;trángnướccất,hongkhôđọckếtquả.

6.2.2.2.PhiếnkínhB(đốichứngứcchếđặchiệu)đặttrênlớpbôngthấmnướctrongđĩa Petri,nhỏ0,2-0,3mlkhánghuyếtthanhdịchtảlợnlêntiêubản,ủ37^oCtrong15phút.Lấy rarửanướccấtrồinhỏtiếplêntiêubản0,2-0,3mlconjugatkhángthểhuỳnhquang(thuốc nhuộmtrựctiếp)vàlàmtiếptheo5.3.2.1.

6.3.1.Chuẩnbịmẫuthử:Cân10gmẫuthử(lálách),dùngkéocắtnhỏ,nghiềntrướctrong cối sứ, nghiền tiếp trong máy nghiền, vừa nghiền vừa hoà loãng dung dịch Hanksoc PenicillinvàStreptomycinthànhhuyễndịch1:5.Lytâm2000vòng/phúttrong15phút.Lấy lượngnướctrongphaloãngtiếpbằngdungdịchHanksthànhhuyễndịch10-1 đồngthời làmthêmmẫuthửcường độ dịch tả lợn đối chứng.

6.3.2.Cấymẫuthửvàomôitrường tế bào thận lợn.

6.3.2.1.TếbàothậnlợnnuôicấyvàđãphủkíntrênmặtlákínhtrongốngLeightonchứa

2mlmôitrườngMEM-Gsau48-72giờ.

Môi trường mẫu thử phải nuôi cấy ít nhất trong 2 ống môi trường, kèm theo 3 ống đối chứngchomỗiđợtkiểmnghiệm.

Các ống môi trường đượckýhiệuriêng:

A.Đểxácđịnhvirútdịchtảlợntrongmẫuthử.

B. Đối chứng ức chế đặc hiệu.

C. Đối chứng dương tính.

D.Đốichứngâmtính(kiểmtratếbàothậnlợn).

6.3.2.2.GạnbỏlượngmôitrườngcũđivàrửalớptếbàobằngmôitrườngMEM-Mtừ2-3 lần,cấyvàoốngA,Bmỗiống0,2-0,3mlhuyễndịchmẫuthử10^-1 vàoốngC0,2-0,3ml huyễndịchvirútdịchtảlợn10^-1vàoốngD0,2-0,3mlmôitrườngMEM-M,ủtấtcả37^oCtừ

1-2giờ.GạnbỏlượngnướcvừacấyvàrửalớptếbàobằngmôitrườngMEM-Mủ37^oCtừ 24-48 giờ.

6.3.3.Nhuộm:Dùngpincelấylákính,cốđịnhbằngaxêtonở-25^oCtrong10phút,hong khô.

-NhuộmcáclákínhA,C,Dtheo6.2.2.1.

-NhuộmlákínhBtheo6.2.2.2.

6.4.Phương pháp nhuộm gián tiếp mẫu thử (chung cho cả 2 loại tiêu bản).

6.4.1.Chuẩnbịmẫuthử:Theo6.2.1.(mẫuthửcắtlạnhhoặcápin);6.3.1.và6.3.2(mẫu thửcấytrongmôitrườngtếbào).

6.4.2.Nhuộmchungchocảhailoạitiêubản)cốđịnhtiêubảnbằngaxêtonở-25^oCtrong 10phút,hongkhô,nhỏlêntiêubản0,2-0,3mlkhánghuyếtthanhdịchtảlợn,ủ37^oCtrong 30phút.Lấyrangâmrửa2lần,mỗilần5phútbằngdungdịchđiệnmuốiphotphatpH7,0. Nhỏtiếp0,2-0,3mlconjugatkhángthểhuỳnhquang(loạithuốcnhuộmgiántiếpđểpha loãngtheochỉdẫncủanơisảnxuất);ủ37^oCtrong30phút,saungâmrửa2lầnmỗilần3 phútbằngdungdịchđiệnmuốiphotphatpH7,0.Gắnlamkínhlêntrêntiêubản,đọckết quả.

6.5. Nhận định một số chỉ tiêu giữa 2 phương pháp nhuộm.

Chỉ tiêu	Nhuộm trực tiếp		Nhuộm gián tiếp
	Cắt lạnh in áp	Môi trường tế bào	Cắt lạnh in áp	Môi trường tế bào
Thời gian (giờ)	2-3	50-75	2-3	50-75
Tỷ lệ phát hiện dươngtính(%)	80	85	90	95

7.Tínhtoánkếtquả

7.1.Dùngkínhhiểnvihuỳnhquangđặttrongbuồngtối,đọckếtquảcácmẫuđốichứng trước,mẫukiểmnghiệmsau.

Chung cho cả 2 phương pháp:

-TrênmẫuD(kiểmtratếbào)khôngcóhoặccórấtítnhữngđiểmphátquanggiảmàu xanh nâu.

-TrênmẫuC(đốichứngdươngtính):Cónhiềutếbàohoặcđámtếbàophátquangmàu vàng xanh, trải đều trong nguyên chất, chung quanh tế bào có màu sáng, lượng phát quangtỉlệthuậnvớisốlượngvirút,riêngphươngphápnhuộmgiántiếpchokếtquảrõhơn (sángtrênnềnxanhEvans).

-TrênmẫuB(đốichứngứcchếđặchiệu)nhưmẫuD.

-TrênmẫuA:Nếukếtquảđọcđượcnhưmẫu C là dương tính và ngượclạilàâmtính.

7.2. Kết luận chung cho cả hai phương pháp.

Mẫu thử A	Mẫu thử B	Mẫu thử C	Mẫu thử D	Kết luận
+	-	+	-	Cóvirútdịchtảlợn
+	+	+	-	Saisótkỹthuật(làmlại)
-	-	+	-	Khôngcóvirútdịchtảlợn

 

PHỤ LỤC

Hoáchất,thuốcnhuộm,môitrường tế bào thận lợn.

A. Dùng rửa tiêu bản và pha loãng conjugatkháng thể huỳnh quang (nhuộm gián tiếp).

A1.DungdịchđệmmuốiphotphatpH7,0.
A1.1. Dung dịch 1
-Natridihydrophotphat(NaH2PO4)	14g
-Nước cất 2 lần (trung tính)	1.000ml
A1.2.Dungdịch2.
-Natridihydrophotphat(NaH2PO4.12H2O)	35,85g
-Nước cất hai lần (trung tính)	1.000ml
A1.3 Dung dịch hoàn chỉnh
-Dungdịch1	39ml
-Dungdịch2	61ml
- Natri clorua (NaCl)	8,77g
-Nước cất 2 lần (trung tính)	900ml
Hấp 121oC trong 30 phút. Bảo quản 4oC.
A2. Dung dịch xanh evans.
- Xanh evans	0,25g
-Nước cất 2 lần (trung tính)	100ml
Hấp 113oC trong 10 - 15 phút. Bảo quản 4oC.
A3.DungdịchđệmTrispH8,6.
-Tris,dungdịch2,42%trongnước	25ml
-Axitclohydric,dungdịch0,2N(HCl)	6,1ml
-Nước cất 2 lần (trung tính) vừa đủ	100ml
Lọc vô khuẩn. Bảo quản ở 4oC.
Ghichú:Axitclohydric,dungdịch0,2N(HCl).
-Axitclohydricđậmđặc	2ml
-Nước cất 2 lần (trung tính)	98ml

Hấp 121^oCtrng15phút.

B.Dùngchếmôitrườngvàxửlýmẫuthửtrướckhicấy.

B1.Natrihydrocacbonat,dungdịch1,4%hoặc7%(NaHCO3).

- Natri hydro cacbonat                                                                    1,4g hoặc 7g

-Nước cất 2 lần (trung tính)                                                             100ml.

Lọc Seitz. Bảo quản 4^oC.

B2.Dungdịchđỏphenol(Phenolred).

- Đỏ phenol                                                                                   0,4g

- Natri hydroxit, dung dịch 0,1N trong nước(khoảng)                       10-12ml

-Nước cất 2 lần (trung tính) vừa đủ                                                 100ml

Nghiền đỏ phenol trong cối sứ, nhỏ dần dung dịch Natri hydroxit vào cho đến khi đỏ phenoltanhoàntoàn,sauđóbổsungnướccấthailầnvừađủ100ml.Hấp121^oCtrong30 phút (nếu cần thì chỉnh pH 7,0 bằng Natri hydroxit dung dịch 0,05N trước khi hấp.

Ghichú:Natrihydroxitdungdịch0,1Nhoặc0,05N.

- Natri hydroxit                                                                               2g hoặc 1g

-Nước cất 2 lần (trung tính)                                                             100ml

B3. Kháng khuẩn tố, dung dịch có 20.000 đơn vị Penicillin và Streptomycin trong 1ml nước.

-Penicillin(bột để tiêm)                                                                  2.000.000 đơn vị.

-Streptomycin(bộtđểtiêm)                                                           2.000.000đơnvị.

-Nươc cất 2 lần (trung tính)                                                             100ml

Bảo quản -20^oC.

B4. Dung dịch muối điện giải Henks

B4.1. Dung dịch 1

- Natri clorua (NaCl)                                                                         160g

- Kali clorua (KCl)                                                                            8g

-Magiêsulphat(MgSO4.7H2O)                                                        4g

- Canxi clorua (CaCl2)                                                                      2,8g

-Nước cất 2 lần (trung tính)                                                              1.000ml

Chothêmclorofooc2ml.Bảoquản4^oC.

B4.2.Dungdịch2.

-Natrihydrophotphat(NaH2PO4.12H2O)                                           3,04g

-Katridihydrophotphat(KH2PO4)                                                     1,00g

-Clucose                                                                                          20g

-Dungdịchđỏphenol(B2)                                                               100ml

-Nước cất 2 lần (trung tính)                                                                1.000ml

Chothêmclorofooc2ml.Bảoquản4^oC. B4.3. Dung dịch hoàn chỉnh.

-Dungdịch1                                                                                     50ml

-Dungdịch2                                                                                     50ml

-Nước cất 2 lần (trung tính)                                                                 900ml

Hấp 115^oC trong 10 phút. Bảo quản 4^oC.

Khi dùng cho thêm Natri hydro cacbonat,dungdịch1,4%(B1):2,5ml.

B5.DungdịchTrypsin.

- Trypsin                                                                                            1g

- Dung dịch Hanks (B4,3)                                                                    100ml

Lắcnhẹchotanđều.Đểở4^oCtừ12-18giờ,đểtiếptrongnồichưngcáchthuỷở37^oC trong3phútchotrypsintanhoàntoàn.Lọcvôkhuẩnbằngphễuthuỷtinhxốp.Chothêm dungdịchkhángkhuẩntố(B3)1ml.Chiavàocáclọnhỏ.Bảoquản-20^oC.Khidùngpha loãngtiếpthànhđậmđộ0,25%.

B6. Dung dịch hydrolysat lactabumin.

- Hydrolysat lactabumin                                                                      5g

-DungdịchHanks(B4.3)                                                                    1.000ml

Hấp 121^oC trong 10 phút. Bảo quản 4^oC.

B7. Dung dịch Hanks để xử lý, pha loãng mẫu thử và rửa tế bào.

-DungdịchHanks(B4.3)                                                                     100ml

-Dungdịchkhángkhuẩntố(B3)

+ Để xử lý mẫu thử:                                                                             2ml

+ Để pha loãng mẫu thử (10^-1) và rửa tế bào                                         1ml

B8.DungdịchđậmVersen;

- Natri clorua                                                                                        8g

-Kaliclorua                                                                                         0,2g

- Natri hydro photphat (NaHPO4.2H2O)                                                 0,41g

-Versen                                                                                              0,2g

-Đỏphenol                                                                                         0,01g

-Nước cất 2 lần (trung tính)                                                                   1.000ml

Hoàtan.Lọcvôkhuẩn.Bảoquản4^oC.

C.Môitrườngnuôitêbào.

C1.Môitrường Eagle cần thiết cho các tế bào sinh trưởng(MEM-G).

-Dungdịchhydrolysat lactabumin(B6)                                                 90ml.

- Dung dịch kháng khuẩn tố PenicillinvàStreptomycin(B3)                   1ml.

Điều chỉnh pH 7,2 bằng Natri hydro cacbonat, dung dịch 7% (B1).

-Huyếtthànhbêsơsinh10ml.

Bằngthaotácvôkhuẩntrộnđều,chiavàocácbìnhtamgiác50ml.Dùngđểnuôicấytế bào thận lợn.

02.MôitrườngBaglecầnthiếtđểbảoquảntếbào(MEM-M).

ThànhphầnnhưC1,chỉkháclàdùng1ml huyết thanh bê sơ sinh thay cho 10ml. Dùng cấy mẫuthử(phânlậpvirútdịchtảlợn).

D.Kỹthuậtsảnxuấttếbàothậnlợn.

D1.Chọntếbào:Dùngtếbàothậnlợnsơsinh,khoẻmạnh,khôngcóbệnh.

D2.TáchtếbàobằngdungdịchTrypsin(B5)dướitácđộngcủamáykhuấytừ.

D3.LoạibỏTrypsinvàthugomtếbàobằngmáylytâm.

D4.PhamẫubằngMEM-G.Đếmsốtếbàobằngbuồngđếmbạchhuyếtcầudướikính hiểnvithôngthường.

D5.Tínhsốlượng tếbàocầnthiếtđểđịnhtỷlệphaloãngbằngMEM-G(yêucầu50.000 tếbào/1mlmôitrường).

D6.Chiavàocácốngleightoncóghéplákính,mỗiống2ml,ủ37^oCtừ24-72giờ.Khitế bào đã sinh trưởngvàphủkíntrênbềmặtlákínhthìcấymẫuthử(theo6.3.2).

Ghichú:Nếusửdụngtếbàodòngthìphachếtheochỉdẫncủanơisảnxuất,nếuchuyển tiếptếbàodòngthìdùngdungdịchversen(B8)đểlàmbonglớptếbàorồidùngdùngdịch trypsin(B5)táchtếbàovàlàmtiếptheophụlụcD2đếnD6.