Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9667:2013 (ISO 4134:1999) về Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng axit L-(+)-glutamic - Phương pháp chuẩn
THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT-(+)-GLUTAMIC - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN
Meat and meat products - Determination of L-(+)-glutamic acid content - Reference method
Lời nói đầu
TCVN 9667:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 4134:1999.
TCVN 9667:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8
Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT-(+)-GLUTAMIC - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN
Meat and meat products - Determination of L-(+)-glutamic acid content - Reference method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng axit L-(+)-glutamic trong tất cả các loại thịt và sản phẩm thịt, kể cả thịt gia cầm.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 7150-2 (ISO 835-2) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet chia độ - Phần 2: Pipet không quy định thời gian chờ.
TCVN 7151 (ISO 648) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet một mức.
TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức.
TCVN 8135 (ISO 1442), Thịt và sản phẩm thịt - Xác định độ ẩm (Phương pháp chuẩn).
Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:
3.1. Hàm lượng axit L-(+)-glutamic của thịt và sản phẩm thịt [L-(+)-glutamic acid content of meat and meat products].
Phần khối lượng của axit L-(+)-glutamic xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.
CHÚ THÍCH: Hàm lượng axit L-(+)-glutamic được biểu thị bằng phần trăm.
Axit L-(+)-glutamic có trong phần mẫu thử được chiết bằng dung dịch axit perchloric ở nhiệt độ 0oC. Đem ly tâm dịch chiết, gạn và lọc rồi chỉnh pH đến 10,0. Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD) bị khử bằng axit L-(+)-glutamic khi có mặt glutamat dehydrogenase [phương trình (1)]. Nicotinamide adenin dinucleotide (NADH) được cho phản ứng với iodonitrotetrazolium clorua với sự có mặt của diaphorase [phương trình (2)]. Đo phổ của formazane tạo thành ở bước sóng 492 và tính hàm lượng axit L-(+)-glutamic.
Tất cả các thuốc thử được sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.
Bảo quản tất cả các dung dịch trong chai thủy tinh màu nâu có nắp đậy đã được làm sạch kỹ, hấp hoặc khử trùng, trừ dung dịch của các hợp chất vô cơ (5.2 và 5.3).
5.1. Nước, được cất hai lần, hoặc nước đã khử khoáng và được cất bằng dụng cụ thủy tinh.
CHÚ THÍCH: Nước cất một lần có thể chứa các vết ion kim loại, nước đã khử khoáng có thể chứa vi sinh vật. Các ion kim loại có thể làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi đó các vi sinh vật có thể làm tăng hoạt tính nền enzym không đặc trưng dẫn đến sai lệch kết quả phân tích.
5.2. Axit percloric loãng, c(HClO4) = 1,0 mol/l.
CẢNH BÁO - Việc tiếp xúc tới các vật liệu dễ oxy hóa hoặc dễ cháy hoặc các chất làm khô hoặc các chất khử có thể dẫn đến cháy hoặc nổ. Người sử dụng axit này cần hiểu rõ các rủi ro của các chất này. Xem các biện pháp thực hành an toàn nêu trong phụ lục A.
Pha loãng 8,6 axit perchloric, 70 % (khối lượng), r20 = 1,67 g/ml, đến 100 ml bằng nước (5.1). Cho axit perchloric vào nước trước khi thêm nước đến thể tích cuối cùng và trộn.
5.3. Dung dịch kali hydroxit, c(KOH) = 2 mol/l.
Hòa tan 56,1 g kali hydroxit trong nước (5.1). Khi đã nguội, thêm nước đến 500 ml và trộn.
5.4. Dung dịch đệm triethanolamin phosphat, pH = 8,6.
Hòa tan 1,86 g triethanolamin hydroclorua trong nước (5.1) và chỉnh pH đến 8,6 bằng dung dịch kali hydroxit (5.3), dùng máy đo pH. Bổ sung 0,68 g octyphenol decaethyleneglycol ete (ví dụ: Triton X-100).
Thêm nước đến 100 ml và trộn (dung dịch A).
Hòa tan 0,86 dikali hydro phosphat (K2HPO4) và 7 mg kali dihydro phosphat (KH2PO4) trong nước (5.1). Thêm nước đến 100 ml và trộn (dung dịch B).
Trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B.
Khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 oC đến 6 oC thì dung dịch này có thể bền được 2 tháng.
5.5. Dung dịch nicotinamide adenin dinucleotide (NAD)
Cân 25 mg NAD trong bình nhỏ có nắp đậy. Thêm 5,0 ml nước (5.1) và trộn.
Khi được bảo quản ở nơi tối, nhiệt độ từ 0 oC đến 6 oC thì dung dịch này có thể bền được 2 tháng.
5.6. Dung dịch iodonitritrotetrazolium clorua (INT), 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltatrazolium clorua.
Cân 30 mg dung dịch INT vào bình nhỏ, màu nâu, có nắp đậy. Thêm 50 ml nước (5.1) và trộn.
Khi được bảo quản ở nơi tối, nhiệt độ từ 0 oC đến 6 oC thì dung dịch này có thể bền được 4 tuần.
5.7. Dung dịch diaphorase (lipoamide dehydrogenase, EC1) 1.8.1.4).
Hòa tan 3 mg diaphorase đông khô trong 1 ml nước (5.1) và trộn.
Khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 oC đến 6 oC thì dung dịch này có thể bền được 4 tuần.
5.8. Dung dịch glutamat dehydrogenase (GLDH) (EC1) 1.4.1.3), 10 mg/ml, không chứa amoni sulfat, axit ethylen-dinitrilotetraacetic (EDTA) và glutaminase.
Dung dịch này được chuẩn bị sẵn (ví dụ: với các lượng 1,0 ml) và khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 oC đến 6 oC thì có thể bền được 12 tháng.
5.9. Dung dịch chuẩn axit L-(+)-glutamic
Hòa tan 50,0 mg axit L-(+)-glutamic (C5H9O4N) trong 25 ml nước (5.1). Chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch kali hydroxit (5.3). Thêm nước đến 50 ml và trộn.
Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ từ 0 oC đến 6 oC và pha loãng với tỷ lệ 1 : 49 ngay trước khi dùng.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
6.1. Thiết bị đồng hóa bằng cơ hoặc bằng điện, có khả năng đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm.
Thiết bị này có máy cắt quay tốc độ cao hoặc máy nghiền được gắn với tấm đục lỗ với đường kính lỗ nhỏ hơn 4,0 mm.
6.2. Bộ trộn phòng thử nghiệm.
6.3. Máy ly tâm phòng thử nghiệm, có các ống ly tâm dung tích 50 ml hoặc 100 ml, hoạt động ở gia tốc hướng tâm khoảng 2000 gn.
6.4. Máy đo pH.
6.5. Giấy lọc gấp nếp, đường kính khoảng 15 cm, tốc độ lọc vừa hoặc phanh.
6.6. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml và 250 ml, phù hợp với các yêu cầu của loại B trong TCVN 7153 (ISO 648).
6.7. Pipet một vạch, dung tích 100 ml, 50 ml, và 25 ml, phù hợp với các yêu cầu của loại B trong TCVN 7151 (ISO 648).
6.8. Pipet chia độ (tự động), có thể phân phối được các lượng 2,50 ml, 0,50 ml, 0,20 ml và 0,05 ml, phù hợp với các yêu cầu của loại A trong TCVN 7150-2 (ISO 835-2).
6.9. Dao trộn nhỏ bằng chất dẻo, được uốn 90o để trộn lượng chứa trong cuvet.
6.10. Máy đo màu quang điện, được trang bị bộ lọc có hệ số truyền tối đa ở bước sóng 492 nm hoặc máy đo phổ.
6.11. Cuvet, có chiều dài đường quang 10 mm.
6.12. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4833-1 (ISO 3100-1)[*].
Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Phần mẫu đại diện ít nhất là 200 g. Bảo quản mẫu theo cách sao cho mẫu không bị suy giảm chất lượng và thay đổi thành phần.
Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm bằng thiết bị thích hợp (6.1). Chú ý không để nhiệt độ của mẫu tăng quá 25 oC. Nếu sử dụng máy nghiền thì nghiền mẫu ít nhất hai lần.
Cho mẫu đã chuẩn bị vào đầy hộp đựng kín khí thích hợp. Đậy nắp hộp và bảo quản sao cho mẫu không bị suy giảm chất lượng và thay đổi thành phần. Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, nhưng trong vòng 24 h sau khi mẫu đã được đồng hóa.
CHÚ THÍCH: Nếu cần kiểm tra yêu cầu về độ lặp lại thì tiến hành hai phép xác định đơn lẻ theo 9.1 đến 9.3.
9.1. Phần mẫu thử
Cân khoảng 50 mg mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 8), chính xác đến 0,01 mg, chuyển vào bộ trộn phòng thử nghiệm (6.2).
9.2. Chuẩn bị dịch chiết
9.2.1. Cho 100 ml axit perchloric loãng (5.2) ở nhiệt độ 0 oC vào phần mẫu thử và đồng hóa hỗn hợp.
9.2.2. Chuyển phần mẫu thử đã đồng nhất sang ống ly tâm (6.3). Đem ly tâm 10 min ở gia tốc hướng tâm khoảng 2000 gn. Cẩn thận gạt phần chất béo sang một bên và gạn phần dịch nổi qua giấy lọc gấp nếp (6.5) vào bình nón 200 ml. Loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu tiên.
9.2.3. Dùng pipet (6.7) chuyển 50 ml dung dịch (chỉ hơi đục) sang cốc có mỏ 100 ml và chỉnh pH đến 10,0 bằng dung dịch kali hydroxit (5.3), sử dụng máy đo pH (6.4).
9.2.4. Chuyển lượng chứa trong cốc có mỏ sang bình định mức 100 ml (6.6). Thêm nước (5.1) đến vạch và trộn.
9.2.5. Làm nguội dung dịch 10 min trong đá lạnh và lọc qua giấy lọc gấy nếp (6.5). Loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu tiên.
9.2.6. Dùng pipet lấy 25 ml hoặc thể tích thích hợp (V) của dịch lọc cho vào bình định mức 250 ml (6.6) và thêm nước đến vạch.
CHÚ THÍCH: Thể tích V cần được chọn sao cho hàm lượng axit L-(+)-glutamic của dung dịch nhỏ hơn 30 mg/l.
9.3. Phép xác định
9.3.1. Đưa nhiệt độ của dung dịch đệm (5.4) và của dịch lọc (9.2.6) về khoảng từ 20 oC đến 25 oC.
Dùng pipet cho vào hai cuvet (6.11), mỗi cuvet 2,50 ml dung dịch đệm (5.4), 0,20 ml dung dịch NAD (5.5), 0,20 ml dung dịch INT (5.6) và 0,05 ml dung dịch diaphorase (5.7).
Sau khi thêm dung dịch INT, hạn chế hỗn hợp tiếp xúc với ánh sáng đến mức có thể.
Dùng pipet lấy 0,50 ml dịch lọc (9.2.6) cho vào một cuvet để thu được dung dịch thử.
Dùng pipet lấy 0,50 ml nước (5.1) cho vào cuvet còn lại để thu được dung dịch mẫu trắng.
Trộn các dung dịch bằng dao trộn (6.9) và đọc độ hấp thụ A1 của từng cuvet ở bước sóng 492 nm so với nước. Nhiệt độ của dung dịch phải từ 20 oC đến 25 oC.
9.3.2. Dùng pipet lấy 0,05 ml dung dịch GLDH (5.8) cho vào từng cuvet. Trộn lượng chứa trong cuvet bằng cách đưa dao trộn lên-xuống.
Sau từ 10 min đến 15 min, đọc độ hấp thụ A2 của từng cuvet ở bước sóng 492 nm so với nước và cứ sau 2 min thì đọc độ hấp thụ cho đến khi độ hấp thụ tăng ổn định. Dựng đồ thị của độ hấp thụ theo thời gian. Ngoại suy các giá trị độ hấp thụ về thời điểm bắt đầu phản ứng (Phụ lục B).
9.3.3. Lặp lại các thao tác trong 9.3.1 và 9.3.2, nhưng thay 0,50 ml dịch lọc (9.2.6) trong cuvet thứ nhất bằng 0,50 ml dung dịch chuẩn axit L-(+)-glutamic (5.9).
9.3.4. Xác định độ ẩm của mẫu thử theo TCVN 8135 (ISO 1442).
10.1. Chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn
Tính chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn bằng công thức sau đây:
ΔAs = (A2s - A1s) - (A2b - A1b)
trong đó:
ΔAs là chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn;
A1b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng đo được trong 9.3.3 phù hợp với 9.3.1;
A2b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng đo được trong 9.3.3 phù hợp với 9.3.2;
A1s là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn đo được trong 9.3.3 phù hợp với 9.3.1;
A2s là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn đo được trong 9.3.3 phù hợp với 9.3.2;
10.2. Chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch thử
Tính chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch thử bằng công thức sau đây:
ΔA= (A2 - A1) - (A2b - A1b)
Trong đó:
ΔA là chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch thử;
A1 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 9.3.1;
A2 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 9.3.2;
A1b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng đo được trong 9.3.1;
A2b là độ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng đo được trong 9.3.2.
10.3. Tính hàm lượng axit L-(+)-glutamic
Tính hàm lượng axit L-(+)-glutamic theo công thức sau:
wg =
Trong đó:
wg là hàm lượng axit L-(+)-glutamic của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng;
ΔA là chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch thử (xem 10.2);
ΔAs là chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn (xem 10.1);
V là thể tích dịch lọc được lấy trong 9.2.6, tính bằng mililit (ml);
wm là độ ẩm của mẫu (9.3.4), tính bằng phần trăm khối lượng;
m là khối lượng phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam (g).
CHÚ THÍCH: Diễn giải đầy đủ về độ lệch trong công thức này được nêu trong Phụ lục C.
Biểu thị kết quả chính xác đến 0,01 %.
11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm
Độ chụm của phương pháp được thiết lập bằng phép thử liên phòng thử nghiệm được thực hiện phù hợp với ISO 5725 .
Các kết quả của các phép thử này đã được công bố (xem Tài liệu tham khảo [5] và [6]). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các dải nồng độ và các chất nền đã nêu.
11.2. Độ lặp lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến hành trên cùng một nguyên liệu thử, thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá 0,02 % (khối lượng) đối với hàm lượng axit L-(+)-glutamic đến 0,14 %.
11.3. Độ tái lập
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá 0,04 % (khối lượng) đối với hàm lượng axit L-(+)-glutamic đến 0,14 %.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.
- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu hai kết quả thu được.
(Quy định)
Thực hành an toàn khi xử lý axit perchloric (HClO4) phải như sau:
a) Loại bỏ ngay HClO4 bị tràn ra và rửa sạch bằng nhiều nước.
b) Tủ hút khói, ống dẫn và các thiết bị khác để loại bỏ hơi HClO4 phải được làm bằng vật liệu trơ hóa học và được thiết kế sao cho dễ dàng làm sạch bằng nước. Các hệ thống khí thải phải được xả vào nơi an toàn và quạt phải dễ làm sạch.
c) Tránh sử dụng các hóa chất hữu cơ trong tủ hút khói hoặc thiết bị loại bỏ khói được dùng cho HClO4.
d) Sử dụng kính bảo hộ, tấm chắn và các thiết bị khác cần thiết để bảo vệ cá nhân; dùng găng tay bằng polyvinyl clorua, không sử dụng găng tay bằng cao su.
e) Trong trường hợp làm cháy mẫu ẩm bằng HClO4, đầu tiên xử lý mẫu bằng axit nitric để phá hủy dễ dàng chất hữu cơ có thể oxi hóa, trừ khi có các quy định khác, không làm bay hơi đến khô.
f) Việc tiếp xúc HClO4 với các thuốc thử khan mạnh như phospho pentoxide hoặc axit sulfuric đậm đặc có thể hình thành HClO4 khan có phản ứng mạnh với chất hữu cơ và các chất khử. Với các thuốc thử như vậy, đặc biệt thực hành cẩn thận khi tiến hành phân tích có sử dụng HClO4. Các chất này cực kỳ nhạy có thể gây sốc và bỏng khi nồng độ 72 % (tính theo khối lượng).
CHÚ THÍCH: Lấy từ AOAC các phương pháp phân tích chính thức (1995), An toàn phòng thử nghiệm, Phụ lục B, trang 3.
(Tham khảo)
Ví dụ về đồ thị và ngoại suy giá trị độ hấp thụ
Hình B.1 - Ví dụ về đồ thị và ngoại suy giá trị độ hấp thụ
(Tham khảo)
Độ lệch của phương trình khi tính hàm lượng axit L-(+)-glutamic
C.1. Hệ số hấp thụ phân tử của formazane
Tính hệ số hấp thụ phân tử của formazane theo công thức sau:
k = ΔAs x x x 147,1 = 51,485 x ΔAs
Trong đó:
k là hệ số hấp thụ phân tử của formazane ở bước sóng 492 nm, tính bằng lít trên milimol centimet (l.mmol-1.cm-1);
ΔAs là chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn.
C.2. Hàm lượng axit L-(+)-glutamic
Tính hàm lượng axit L-(+)-glutamic của phần mẫu thử khô theo công thức sau:
w =
Trong đó:
wg là hàm lượng axit L-(+)-glutamic của mẫu thử khô, tính bằng phần trăm khối lượng;
ΔA là chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch thử;
k là hệ số hấp thụ phân tử của formazane ở bước sóng 492 nm, tính bằng lít trên milimol centimet (l.mmol-1.cm-1);
147,1 là hệ số hấp thụ phân tử tương đối của axit L-(+)-glutamic;
V là thể tích của dịch lọc được lấy trong 9.2.6, tính bằng mililit (ml);
wm là độ ẩm của mẫu (9.3.4), tính bằng phần trăm khối lượng (%);
m là khối lượng phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam (g).
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 4833-1 (ISO 3100-1), Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 1: Lấy mẫu.
[2] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.
[3] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.
[4] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.
[5] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Par. 35 LMBG. Bestimmung von L-Glutaminsaure (L-Glutamat) in Fleischerzeugnissen. L07.00-17, November 1981.
[6] HATTULA, M.T and WALLIN, H.C. J. AOAC International, 74, 1991, pp 921-925.
1) Số EC ở đây là chỉ số phân loại enzym quy định trong: The International Union of Biochemistry, Enzyme nomenclature, Elsevier, Amsterdam, 1965
[*] TCVN 4833-1 (ISO 3100-1) đã bị hủy và được thay thế bằng TCVN 7925 (ISO 17604). Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu thân thịt tươi để phân tích vi sinh vật.
Ý kiến bạn đọc
