Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9330-2:2012 (ISO 14461-2:2005) về Sữa và sản phẩm sữa - Kiểm soát chất lượng trong phòng thử nghiệm vi sinh vật - Phần 2: Xác định độ tin cậy số đếm khuẩn lạc của các đĩa song song và các bước pha loãng liên tiếp

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9330-2:2012

ISO 14461-2:2005

SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG TRONG PHÒNG THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT - PHẦN 2: XÁC ĐỊNH ĐỘ TIN CẬY SỐ ĐẾM KHUẨN LẠC CỦA CÁC ĐĨA SONG SONG VÀ CÁC BƯỚC PHA LOÃNG LIÊN TIẾP

Milk and milk products - Quality control in microbiological laboratories - Part 2: Determination of the reliability of colony counts of parallel plates and subsequent dilution steps

Lời nói đầu

TCVN 9330-2:2012 hoàn toàn tương đương với ISO 14461-2:2005;

TCVN 9330-2:2012 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;

Bộ tiêu chuẩn TCVN 9330:2012 Sữa và sản phẩm sữa - Kiểm soát chất lượng trong phòng thử nghiệm vi sinh vật gồm có các phần sau đây:

- TCVN 9330-1:2012 Sữa và sản phẩm sữa - Kiểm soát chất lượng trong phòng thử nghiệm vi sinh vật - Phần 1: Đánh giá năng lực thực hiện đếm khuẩn lạc;

- TCVN 9330-1:2012 Sữa và sản phẩm sữa - Kiểm soát chất lượng trong phòng thử nghiệm vi sinh vật - Phần 2: Xác định độ tin cậy số đếm khuẩn lạc của các đĩa song song và các bước pha loãng liên tiếp.

Lời giới thiệu

Mỗi phương pháp vi sinh vật bao gồm một số bước kế tiếp theo trình tự cụ thể (lấy mẫu con, pha loãng mẫu, đổ đĩa và đếm khuẩn lạc). Độ không đảm bảo đo của kết quả cuối cùng được xác định bởi tính biến thiên của tất cả các bước liên quan trong quy trình phân tích.

Để thu được các kết quả có độ không đảm bảo đo không quá lớn so với kết quả dự kiến khi thực hiện đúng phương pháp, người phân tích cần tuân thủ của quy định của Thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP).

Có ba yếu tố quan trọng nhất để đạt được số đếm đĩa chính xác là:

- tính đồng nhất của vật liệu mẫu,

- tính chính xác của các bước pha loãng,

- kỹ thuật cấy và/hoặc đếm khuẩn lạc ở các đĩa nuôi cấy.

Có thể đánh giá khả năng thực hiện kỹ thuật đếm khuẩn lạc của phòng thử nghiệm và đưa ra độ biến thiên mong muốn của phương pháp bằng cách đồng hóa kỹ vật liệu mẫu, tạo nhiều dãy dịch pha loãng và cấy một số đĩa từ cùng một dịch pha loãng.

Độ biến thiên quá lớn cho thấy ít nhất một trong các bước khi thực hiện phương pháp nằm ngoài tầm kiểm soát. Xác định các bước này bằng cách so sánh các đĩa nuôi cấy lặp lại, các dịch pha loãng khác nhau và các dãy pha loãng khác nhau. Khi phát hiện các bước của phương pháp phân tích có sự biến thiên quá lớn, phải tiến hành các biện pháp cần thiết để kiểm soát các bước trên.

SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG TRONG PHÒNG THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT - PHẦN 2: XÁC ĐỊNH ĐỘ TIN CẬY SỐ ĐẾM KHUẨN LẠC CỦA CÁC ĐĨA SONG SONG VÀ CÁC BƯỚC PHA LOÃNG LIÊN TIẾP

Milk and milk products - Quality control in microbiological laboratories - Part 2: Determination of the reliability of colony counts of parallel plates and subsequent dilution steps

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này mô tả quy trình thường xuyên để đánh giá kết quả định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc với các bước pha loãng thập phân liên tiếp và cấy một đĩa hoặc hai đĩa song song ở mỗi nồng độ pha loãng.

Quy trình này được áp dụng định kỳ trong các phòng thử nghiệm thực hiện kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Quy trình này đưa ra tiêu chí chấp nhận sự khác nhau giữa các kết quả thu được ở các đĩa song song và ở các bước pha loãng liên tiếp, như sau:

a) So sánh kết quả (số đếm khuẩn lạc) thu được từ các đĩa song song với các giới hạn trong bảng với số đếm tương ứng. Nếu vượt quá giới hạn thì có thể đã xảy ra một lỗi kỹ thuật nào đó khi tiến hành xác định song song.

b) So sánh kết quả (tổng số đếm khuẩn lạc) của hai đĩa song song ở hai bước pha loãng thập phân liên tiếp với các giới hạn trong bảng với tổng số đếm tương ứng. Nếu vượt quá giới hạn thì có thể đã xảy ra một lỗi kỹ thuật nào đó trong quá trình pha loãng.

c) Nếu số trường hợp vượt quá các giới hạn nêu trên nhiều hơn dự kiến thì quy trình thử nghiệm đó có thể thiếu độ tin cậy.

CHÚ THÍCH: Công thức tính các giá trị trong Bảng 1 và Bảng 2 được nêu và giải thích trong Điều 7.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 9330-1 (ISO 14461-1) Sữa và sản phẩm sữa - Kiểm soát chất lượng trong phòng thử nghiệm vi sinh vật - Phần 1: Đánh giá năng lực thực hiện đếm khuẩn lạc.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1. Số đếm khuẩn lạc (colony count)

Số lượng các vi sinh vật đếm được bằng phương pháp nêu trong TCVN 9330-1 (ISO 14461-1).

CHÚ THÍCH: Số lượng vi sinh vật được biểu thị theo gam hoặc mililit mẫu thử.

4. Nguyên tắc

So sánh kết quả đếm thu được với các giới hạn trong bảng cho từng số đếm cụ thể. Đánh giá kết quả dựa vào sự vượt quá các giới hạn. Tính và giải thích các giá trị trong bảng.

5. Cách tiến hành

5.1. Yêu cầu chung

Quy trình này phải được áp dụng thường xuyên trong các phòng thử nghiệm sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Trong mọi trường hợp, phải áp dụng phương pháp chuẩn hóa cho kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

Nếu phương pháp được sử dụng không phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế hoặc tiêu chuẩn được chấp nhận khác thì phải mô tả chi tiết phương pháp và tuân thủ đúng phương pháp.

Trong trường hợp phương pháp được tiến hành với chỉ một đĩa trong mỗi bước pha loãng thì quy trình được mô tả ở 5.2 phải được thực hiện với một tần số tối thiểu nhất định (ví dụ như một lần trong một trăm đơn vị mẫu được phân tích.)

5.2. Kết quả đếm hai đĩa song song

So sánh kết quả (số đếm khuẩn lạc) của hai đĩa song song với giới hạn trong Bảng 1.

So sánh số đếm cao và số đếm thấp của một cặp kết quả thu được với số đếm khuẩn lạc tương ứng trong Bảng 1. Sử dụng số đếm cao trong Bảng 1 làm căn cứ so sánh. Sau đó, so sánh số đếm thấp trong Bảng 1 với số đếm thấp thu được.

Nếu số đếm thấp thu được nhỏ hơn số đếm thấp trong Bảng 1 thì khả năng không chấp nhận sự khác nhau giữa kết quả của hai đĩa song song thu được là cao. (Xem kết quả của bước pha loãng thứ nhất ở Ví dụ 1 và Ví dụ 2 trong Điều 7).

Nếu số đếm thấp thu được lớn hơn hoặc bằng số đếm thấp trong bảng thì sự khác nhau giữa kết quả của hai đĩa song song được chấp nhận. (Xem kết quả của bước pha loãng thứ hai ở Ví dụ 1 và Ví dụ 2 trong Điều 7).

5.3. Tổng của các kết quả số đếm của các bước pha loãng liên tiếp

5.3.1. Sử dụng để kiểm tra tiếp theo các số đếm khuẩn lạc của hai dãy đĩa song song đạt phép thử trong 5.2. So sánh các tổng của các số đếm khuẩn lạc từ các đĩa song song qua hai bước pha loãng thập phân liên tiếp với giới hạn trong Bảng 2.

Đối với tổng số đếm thu được ở bước pha loãng 10^-x, so sánh tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-(x+1) với giới hạn dưới trong bảng cho tổng đó. Các tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-(x+1) có giá trị nằm trong khoảng giới hạn nêu trong Bảng 2 được chấp nhận.

Các tổng số đếm thu được nằm ngoài các giới hạn này cho thấy tỉ lệ các số đếm khuẩn lạc thu được qua hai bước pha loãng thập phân có độ chệch đáng kể so với tỉ lệ dự kiến.

5.3.2. Sử dụng để kiểm tra tiếp theo các số đếm khuẩn lạc của các đĩa song song mà không được phép thử trong 5.2 hoặc các số đếm của một đĩa trong mỗi bước pha loãng. So sánh các số đếm của các đĩa qua hai bước pha loãng thập phân liên tiếp với các giới hạn trong Bảng 2.

Đối với số đếm thu được ở bước pha loãng 10^-x, so sánh số đếm thu được ở bước pha loãng 10^-(x+1) với giới hạn dưới trong bảng cho số đếm đó. Các số đếm thu được ở bước pha loãng 10^-(x+1) có giá trị nằm trong khoảng giới hạn của Bảng 2 được chấp nhận.

Các số đếm thu được nằm ngoài những giới hạn này cho thấy tỉ lệ các số đếm khuẩn lạc thu được qua hai bước pha loãng thập phân có độ chệch đáng kể so với tỉ lệ dự kiến. (Hai phép so sánh kết quả được nêu trong Ví dụ 1 và Ví dụ 2 trong Điều 7).

Xem Hình 1 về lưu đồ của quy trình.

CHÚ THÍCH: Dấu (-) biểu thị kết quả được chấp nhận có giá trị thuộc giới hạn. Dấu (+) biểu thị kết quả nằm ngoài giới hạn do lỗi kỹ thuật.

Hình 1 - Biểu đồ mô tả sự kiểm tra quy trình đếm khuẩn lạc và đánh giá kết quả

6. Đánh giá

6.1. Các bảng kết quả

Đối với mỗi phép thử được mô tả trong 5.3.1 và 5.3.2, các kết quả nằm ngoài các giới hạn trong Bảng 1 hoặc Bảng 2 thường không được xảy ra nhiều hơn một lần trong 100 lần thử. Nếu các kết quả nằm ngoài các giới hạn này xảy ra thường xuyên hơn thì phải rà soát lại quy trình thử nghiệm vi sinh.

Bảng 1 - Các giới hạn quy ước cho số đếm khuẩn lạc của hai đĩa Petri song song

(với xác suất 99 % đối với mỗi phép so sánh)

6.2. Các ví dụ kiểm tra các đĩa song song

6.2.1. Ví dụ 1

Giả sử (24,12) là một cặp số đếm khuẩn lạc thu được thì 24 là giới hạn trên và 10 là giới hạn dưới. Vì 12 ³ 10 nên những số đếm này có thể được xem xét.

6.2.2. Ví dụ 2

Giả sử (97, 65) là một cặp số đếm khuẩn lạc thu được thì 97 là giới hạn trên và 65 là giới hạn dưới. Vì 65 = 65 nên những số đếm này có thể được xem xét.

6.2.3. Ví dụ 3

Giả sử (193, 142) là một cặp số đếm khuẩn lạc thu được thì 193 là giới hạn trên và 146 là giới hạn dưới. Vì 142 < 146 nên những số đếm này không được xem xét.

6.3. Các ví dụ kiểm tra các tổng của hai bước pha loãng liên tiếp

6.3.1. Ví dụ 1

Giả sử 232 là một số đếm/tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-x thì 12 là giới hạn dưới của số đếm/tổng ở bước pha loãng 10^-(x+1) và 37 là giới hạn trên của tổng / số đếm ở bước pha loãng 10^-(x+1). Nếu 15 là số đếm/ tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-(x+1) thì các tổng/ số đếm ở cả hai nồng độ có thể được xem xét, vì 12 < 15 < 37.

6.3.2. Ví dụ 2

Giả sử 357 là một số đếm/ tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-x thì 21 là giới hạn dưới của số đếm/ tổng ở bước pha loãng 10^-(x+1). Nếu 18 là số đếm/ tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-(x+1) thì các tổng/ số đếm ở cả hai bước pha loãng này không được xem xét, vì 18 < 21.

6.3.3. Ví dụ 3

Giả sử 151 là một số đếm/ tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-x thì 26 là giới hạn trên của số đếm/tổng ở bước pha loãng 10^-(x+1). Nếu 31 là một số đếm/ tổng quan sát được ở bước pha loãng 10^-(x+1) thì các tổng/ số đếm ở cả hai bước pha loãng không được xem xét, vì 31 > 26.

Bảng 2 - Các giới hạn quy ước cho tổng số đếm của hai đĩa song song hoặc số đếm từ một đĩa trên mỗi bước pha loãng của hai bước pha loãng thập phân liên tiếp

(với xác suất 99 % đối với mỗi phép so sánh)