Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-23:2022 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-23:2022

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 23: BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU DO IHNV Ở CÁ HỒI

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 23: Infectious haematopoietic necrosis disease in salmon

Lời nói đầu

TCVN 8710-23:2022 được xây dựng trên cơ sở tham khảo OIE (2019) Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, Chapter 2.3.4 Infection with infectious haematopoietic necrosis virus.

TCVN 8710-23:2022 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8710-1:2011, Phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm;

- TCVN 8710-2:2019, Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển;

- TCVN 8710-3:2019, Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm;

- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;

- TCVN 8710-5:2011, Phần 5: Bệnh taura ở tôm he;

- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpesvi rút ở cá chép;

- TCVN 8710-7:2019, Phần 7; Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;

- TCVN 8710-8:2012, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm;

- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;

- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11:2015, Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-12:2019, Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

- TCVN 8710-13:2015, Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovi rút ở tôm;

- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;

- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;

- TCVN 8710-22:2022, Phần 22: Bệnh sán lá 16 móc ở cá;

- TCVN 8710-23:2022, Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi;

- TCVN 8710-24:2022, Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn;

- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu.

 

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 23: BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU DO IHNV Ở CÁ HỒI

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 23: Infectious haematopoietic necrosis disease in salmon

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do infectious hematopoietic necrosis vi rút (IHNV) ở cá hồi.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

2.1   Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1.1

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi (infectious haematopoietic necrosis disease in salmon)

Bệnh truyền nhiễm do infectious hematopoietic necrosis vi rút (IHNV) ở cá hồi.

2.1.2

Vi rút gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (infectious hematopoietic necrosis vi rút)

Vi rút thuộc giống Novirhabdovi rút, họ Rhabdoviridae, có vật chất di truyền là ARN mạch đơn (ssRNA).

CHÚ THÍCH: IHNV có hình đầu đạn, có vỏ, đa hình, đường kính từ 45 nm đến 100 nm và dài từ 100 nm đến 430 nm. Bộ gen có khoảng 11000 nucleotid mã hóa, sáu loại protein: Nucleoprotein (N), Phosphoprotein (P), Matrix protein (M), Glycoprotein (G), Non-virion protein (NV) và protein mã hóa enzym ARN polymerase (L).

2.2  Các từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid):	axit deoxyribonucleic;
- ARN (Ribonucleic acid):	axit ribonucleic;
- CPE (cytopathic effect):	bệnh lý tế bào;
- FBS (Fetal bovine serum):	huyết thanh nhau thai bò;
- PBS (Phosphate buffered saline):	dung dịch muối đệm phosphat;
- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction):	phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược;
- TAE (Tris-acetate-EDTA):	Tris-axetat-axit etylendiamintetraaxetic;
- TBE (Tris-borate-EDTA):	Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic;
- TE (Tris-EDTA):	Tris-axit etylendiamintetraaxetic.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1  Etanol, từ 70 % đến 100 %

3.1.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), (xem A.2).

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT-PCR

3.2.1  Mồi (primers) RT-PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.2  Thạch agarose

3.2.3  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (xem A.1)

3.2.4  Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe

3.2.5  Chất đệm tải mẫu (loading dye 6X)

3.2.6  Dung dịch đệm TE

3.2.7  Kít nhân gen RT-PCR

3.2.8  Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.9  Kít tách chiết ARN

3.2.10  Thang chuẩn ADN (ladder/ marker)

3.3  Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào

3.3.1  Thuốc khử trùng, Virkon 1 %

3.3.2  Dung dịch chứa penicillin (100 IU/mL) và streptomycin (100 µg/mL) hoặc gentamycin (50 µg/mL)

3.3.3  Môi trường L-15 Leibovitz (L-15 Leibovitz medium)

3.3.4  FBS, 10 % thể tích

3.3.5  Dung dịch glutamin, 2 mM

3.3.6  Dòng tế bào EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini)

3.3.7  Môi trường MEM (Earles);

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1  Tủ lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

4.1.2  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ - 20 °C tới - 80 °C

4.1.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

4.1.4  Pipet đơn kênh các loại

4.1.5  Ống đong, dung tích 100 mL; 500 mL; 1000 mL

4.1.6  Máy ly tâm, có thể hoạt động với gia tốc 2 000 g đến 4 000 g và gia tốc 12 000 g.

4.1.7  Lò vi sóng

4.1.8  Dụng cụ chứa mẫu, kín, có nắp đậy, không rò rỉ, vô trùng.

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT-PCR

4.2.1  Máy nhân gen PCR

4.2.2  Máy lắc trộn Vortex

4.2.3  Máy ly tâm Spindown

4.2.4  Khay đựng đá lạnh

4.2.5  Bộ khuôn và lược đổ thạch

4.2.6  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.2.7  Máy đọc sản phẩm PCR

4.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

4.3.1  Đĩa nuôi cấy 24 giếng (hoặc đĩa nuôi cấy 96 giếng)

4.3.2  Chai nuôi cấy

4.3.3  Màng lọc, 0,45 µM

4.3.4  Tủ ấm

4.3.5  Kính hiển vi soi ngược, vật kính có độ phóng đại 4 X và 10 X

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

Các loài cá hồi cảm nhiễm: cá hồi chấm hồng bắc cực (Salvelinus alpinus), cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar), cá hồi suối (Salvelinus foritinalis), cá hồi nâu (Salmo trutta), cá hồi Chinook (Oncorhynchus tshawytscha), cá hồi chó (Oncorhynchus keta), cá hồi coho (Oncorhynchus kisutch), cá hồi hồ (Salvelinus namaycush), cá hồi masu (Oncorhynchus masou), cá hồi đỏ (Oncorhynchus nerka), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss)...

Phân bố địa lý: IHNV đã được phát hiện Ở Bắc Mỹ, châu Á và châu Âu. Các quốc gia đã xác nhận nhiễm hoặc nghi ngờ nhiễm IHNV bao gồm: Áo, Bì, Canada, Trung Quốc, Croatia, Cộng hòa Séc, Pháp, Đức, Iran, Ý, Nhật Bản, Hàn Quốc, Hà Lan, Ba Lan, Nga, Slovenia, Tây Ban Nha, Thụy Sĩ và Mỹ. Dịch bệnh IHNV đã được phát hiện ở cả cá hồi nuôi nước ngọt và nước mặn.

IHNV xâm nhập qua mang và vây; các cơ quan như thận, lá lách, tim, não là nơi chứa vi rút nhiều nhất, hầu hết ở các giai đoạn của cá đều có thể bị nhiễm vi rút nhưng giai đoạn cá bột và cá giống là dễ mẫn cảm nhất.

IHNV được thải qua phân, nước tiểu, buồng trứng, dịch nhày ra ngoài môi trường nước, vi rút có thể tồn tại trong nước ngọt một tháng, đặc biệt nếu môi trường giàu chất hữu cơ.

Động vật không xương sống và giáp xác có thể là vật chủ trung gian mang mầm bệnh.

Trong điều kiện tự nhiên, cá thường bị nhiễm ở điều kiện từ 8 °C đến 15 °C. Khả năng gây bệnh cao nhất ở 10 °C và bệnh không xảy ra tự nhiên trên 15 °C;

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Bệnh thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu như cá lờ đờ xen kẽ với những hoạt động bất thường như bơi xoắn ốc và nhấp nháy, da sẫm màu, mang nhợt nhạt, bụng phình to, xuất huyết điểm bên trong và bên ngoài cơ thể cá.

Một số cá thể sống sót sau khi khỏi bệnh có thể bị biến dạng cột sống.

5.3  Bệnh tích

- Xuất huyết điểm ở các cơ quan nội tạng, ruột trống rỗng.

- Gan, thận và lách đều có màu nhợt nhạt, có dịch nhày trong khoang bụng.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Phát hiện IHNV bằng phương pháp RT-PCR

6.1.1  Lấy mẫu

Cá có kích thước < 4 cm:	Lấy nguyên con, từ 10 con đến 15 con.
Cá có kích thước từ 4 cm đến 6 cm:	Lấy nguyên con, từ 5 con đến 10 con.
Cá có kích thước > 6 cm:	Lấy nguyên con, từ 3 con đến 5 con hoặc lấy gan, thận, lách, tim, não của từ 3 con đến 5 con.
Cá bố mẹ:	Lấy máu, trứng, dịch nhày hoặc sẹ (bằng que thăm trứng hoặc sẹ).

Mẫu bệnh phẩm phải được lấy vô trùng và để riêng biệt trong dụng cụ chứa mẫu (4.1.8). Đối với các mẫu bệnh phẩm dự kiến nuôi cấy vi rút trên môi trường nuôi cấy tế bào cần giữ trong các dụng cụ chứa môi trường nuôi cấy tế bào bổ sung kháng sinh (3.3.2).

6.1.2  Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm để làm phản ứng RT-PCR: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h khi vận chuyển về phòng thí nghiệm hoặc bảo quản trong cồn 90 % với tỉ lệ mẫu : cồn bằng 1:10.

Mẫu được được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C chuyển đến phòng thí nghiệm chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ - 20 °C đến - 80 °C.

6.1.3  Chuẩn bị mẫu

Cho dung dịch PBS (3.1.2) vào 30 mg mẫu với tỷ lệ dung dịch PBS : mẫu bằng 9 : 1, nghiền mẫu để tạo thành huyễn dịch 10 %. Chuyển huyễn dịch vào 2 ống vô trùng đóng nắp và để vào tủ lạnh âm sâu (- 80 °C) trong thời gian tối thiểu 1 h trước khi tiến hành chiết tách ARN. Một ống mẫu để xét nghiệm và một ống lưu mẫu.

6.1.4  Cách tiến hành

6.1.4.1  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết ARN (3.2.9) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit hoặc Taco RNA/DNA kít hoặc Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA (Phụ lục B).

6.1.4.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT-PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu mã hóa cho Glycoprotein của vi rút IHNV sử dụng cặp mồi IHNV F/IHNV R (xem Phụ lục C, Bảng C.1).

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm Spindown (4.2.3) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Sử dụng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM/µL làm gốc.

Mồi (3.2.1) được sử dụng ở nồng độ 20 µM/µL: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (20 µl mồi gốc và 80 µl nước).

6.1.4.3  Tiến hành phản ứng RT-PCR

Thực hiện phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi IHNV F/IHNV R, xem Phụ lục C.

6.1.4.4  Chạy điện di

6.1.4.4.1  Chuẩn bị bản thạch

Pha thạch agarose (3.2.2) nồng độ từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) trong bình thủy tinh, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ thạch giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khuôn (4.2.5) đã được cài lược, bản thạch không dày quá 0,8 cm. Khi bản thạch đông, gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản thạch vào bể điện di (4.2.6) đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.3) vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain [1]⁾ và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2  Điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (loading dye 6X) (3.2.5) vào 8 µl sản phẩm RT-PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder/marker) (3.2.10) vào một giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.6), ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 20 min đến 30 min.

6.1.4.4.3  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc sản phẩm PCR (4.2.7).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Đối chứng âm có kết quả âm tính, không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vạch sáng rõ có kích thước 693 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Mẫu xét nghiệm âm tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng 693 bp (không có sản phẩm khuếch đại);

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử xuất hiện sản phẩm khuếch đại có vạch sáng kích thước 693 bp;

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

6.2  Phân lập IHNV trên môi trường tế bào

6.2.1  Chuẩn bị tế bào một lớp

Chuẩn bị tế bào EPC (3.3.6) một lớp trên đĩa 24 giếng (4.3.1) hoặc chai nuôi tế bào 25 cm² (4.3.2) ở 22 °C đến 25 °C khoảng 48 h trước khi thực hiện quá trình phân lập vi rút. Mật độ tế bào nuôi cấy với đĩa 24 giếng là khoảng 500 000 tế bào/giếng (mỗi giếng chứa 1,5 mL môi trường nuôi cấy tế bào); chai 25 cm² là 2 000 000 tế bào/chai (5 ml môi trường nuôi cấy tế bào/chai). Thành phần môi trường tế bào xem (Phụ lục D). Sau 2 ngày, tế bào phủ đều khoảng 80 % đến 90 % diện tích đáy chai hay giếng nuôi cấy tế bào, môi trường nuôi cấy tế bào trong, màu đỏ cam là đạt yêu cầu.

6.2.2  Môi trường phân lập vi rút

Môi trường phân lập vi rút phải được chuẩn bị trước, lượng môi trường chuẩn bị căn cứ vào số mẫu cần phân lập vi rút. Thành phần môi trường phân lập vi rút IHNV (Phụ lục D).

6.2.3  Lấy mẫu, theo 6.1.1.

6.2.4  Bảo quản mẫu, theo 6.1.2.

6.2.5  Chuẩn bị mẫu

Nghiền mẫu bệnh phẩm trong môi trường phân lập vi rút, tạo thành huyễn dịch có độ pha loãng 1/10 (0,1 g/mL)

Pha loãng mẫu bệnh phẩm:

- Ly tâm huyễn dịch mẫu bệnh phẩm (có nồng độ pha loãng 1/10) với gia tốc 2 000 g đến 4 000 g trong 15 min, ở 4 °C.

- Thu dịch trong phía trên và lọc qua màng lọc 0,45 µM (4.3.3). Tiến hành pha loãng với môi trường phân lập vi rút để tạo ra huyễn dịch có nồng độ 1/100.

Bảo quản mẫu và mẫu đã pha loãng ở - 80 °C để có thể tiếp tục gây nhiễm tế bào ở lần sau.

LƯU Ý: Thực hiện xử lý mẫu trên đá lạnh.

Hệ thống đối chứng:

- Đối chứng âm (đối chứng tế bào); Chỉ gồm tế bào và môi trường phân lập vi rút.

6.2.6  Gây nhiễm vi rút từ mẫu trên tế bào một lớp EPC

Hút bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trong đĩa 24 giếng (4.3.1).

Gây nhiễm vi rút với hai nồng độ (1/10; 1/100) lên tế bào một lớp tế bào EPC (3.3.6) đã được nuôi trên đĩa 24 giếng (4.3.1). Mỗi nồng độ pha loãng vi rút được đưa vào hai giếng, mỗi giếng là 150 µL. Ủ các đĩa đã gây nhiễm vi rút trong 1 h ở nhiệt độ 15 °C, sau đó bổ sung vào mỗi giếng 1,5 mL môi trường phân lập vi rút. Lưu ý thực hiện với giếng chứa hệ thống đối chứng âm trước, tiếp theo từ giếng có nồng độ vi rút thấp đến nồng độ cao. Nồng độ pha loãng vi rút cuối cùng là 1/10; 1/100.

Chuyển đĩa 24 giếng cấy vi rút vào tủ ấm (4.3.4) và ủ ở nhiệt độ 15 °C trong 7 ngày đến 10 ngày.

Sau 24 h gây nhiễm vi rút, theo dõi sự xuất hiện bệnh lý tế bào (CPE) bằng kính hiển vi soi ngược (4.3.5) với vật kính 4 X và 10 X, ít nhất ba lần một tuần để phát hiện CPE. Trên môi trường tế bào một lớp EPC, IHNV gây ra CPE lúc đầu tế bào co cụm sau đó phồng to hơn và bong khỏi lớp tế bào.

Tiếp tục theo dõi bệnh lý tế bào đến ngày thứ 10 sau khi gây nhiễm, nếu xuất hiện CPE tiến hành thu dịch tế bào đem ly tâm (4.1.6) với gia tốc từ 2 000 g đến 4 000 g trong 15 min, ở 4 °C, lấy phần dịch trong, tách chiết ARN và thực hiện phản ứng RT-PCR để xác nhận sự hiện diện của vi rút.

Nếu không xuất hiện CPE, thu hồi dịch tế bào và tế bào đơn lớp bám ở đáy giếng ở các nồng độ (1/10; 1/100) của cùng một mẫu vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm (4.1.6) với gia tốc từ 2 000 g đến 4 000 g trong 15 min. Sau đó hút phần dịch trong và tiếp tục pha loãng thành nồng độ (1/10) và gây nhiễm lại trên tế bào một lớp EPC (3.3.6) của đĩa 24 giếng. Có thể gây nhiễm 1 lần đến 2 lần từ dịch tế bào của lần cấy truyền thứ nhất. Nếu không xuất hiện CPE sau 3 lần gây nhiễm mẫu được xem là âm tính.

6.2.7  Đánh giá kết quả

Kiểm tra hệ thống đối chứng âm (đối chứng tế bào): Tế bào phát triển bình thường.

Mẫu âm tính là mẫu sau 3 lần gây nhiễm không xuất hiện CPE.

Mẫu dương tính là mẫu xuất hiện CPE và có kết quả thử nghiệm dương tính IHNV bằng kỹ thuật RT-PCR.

7  Kết luận

Mẫu cá được xác định là nhiễm bệnh hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và:

- Có kết quả dương tính với IHNV bằng phương pháp RT-PCR, hoặc:

- Có kết quả dương tính bằng phương pháp phân lập IHNV từ bệnh phẩm trên môi trường tế bào.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X:	100 ml
Nước khử ion:	900 ml
Tổng:	1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1 X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10 X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.2.1  Thành phần

- Natri clorua (NaCI)	8 g
- Nath hydro phosphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O)	2,9 g
- Kali dihydro phosphat (KH2PO4)	0,2 g
- Kali clorua (KCI)	0,2 g
- Nước cất	1000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH về trung tính bằng dung dịch natri hydroxit 1 N hoặc dung dịch axit clohydric 1 N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

B.1  Tách chiết ARN bằng bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit

B.1.1  Chuẩn bị thuốc thử

Các thuốc thử cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit, Cat. No: 12280-050, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

- Proteinase K;

- Dung dịch đệm Lysis;

- Dung dịch Carrier ARN;

- Dung dịch đệm rửa (W5);

- Nước không chứa RNAse (E3);

Cách pha hỗn hợp dung dịch Carrier ARN và đệm Lysis:

Thể tích đệm Lysis cần chuẩn bị, A, biểu thị bằng mililit (mL), được tính theo Công thức (B.1):

A = N x 0,21

(B.1)

Thể tích dung dịch Carrier ARN cần chuẩn bị, B, biểu thị bằng microlit (µL), được tính theo Công thức (B.2):

B = A x 28

(B.2)

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết.

B.1.2  Các tiến hành

1. Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml.

2. Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K.

(Nếu thể tích mẫu < 200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch đệm phosphat (PBS) hoặc dung dịch natri clorua 0,9 %).

3. Cho hỗn hợp dung dịch đệm Lysis và dung dịch Carrier ARN vào ống chứa mẫu, đóng nắp ống và lắc trộn 15 s.

4. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min.

5. Cho thêm 250 µL cồn 96 % đến 100 % vào ống mẫu, đóng nắp và lắc trộn 15 s.

6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min.

(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12 000 g trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).

7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc.

8. Ly tâm cột lọc ở 12 000 g trong 2 min đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.

9. Cho 500 µL nước đệm rửa (W5) vào cột lọc, ly tâm 12 000 g trong 2 min đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.

10. Lặp lại bước 9 với 500 µL nước đệm rửa (W5) một lần nữa.

11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới.

12. Ly tâm khô 12 000 g trong 1 min cho khô sạch nước đệm rửa W5.

13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL.

14. Cho 10 µL đến 50 µL nước không chứa ARNse (E3) (có sẵn) vào cột lọc.

15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min, ly tâm cột lọc ở 12 000 g trong 1 min đến 2 min.

16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc, bảo quản ARN ở nhiệt độ - 80 °C.

CHÚ THÍCH: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh IHNV.

B.2  Tách chiết ARN bằng kit tách chiết TACO RNA/DNA

B.2.1  Vật liệu: Bộ kít tách chiết TACO RNA/DNA (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)

Etanol 100 % (cồn tuyệt đối)

B.2.2  Chuẩn bị

- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml cồn tuyệt đối

- Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml cồn tuyệt đối

- Tiến hành theo sơ đồ

Thuốc Thử

Lượng (µl)

Thuốc thử

Lượng (µl)

H

G

F

E

D

C

B

A

Cồn tuyệt đối

250

► 1

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

► 2

Dung dịch đệm rửa A

750

► 3

Dung dịch đệm rửa B

750

► 4

Dung dịch đệm rửa B

750

► 5

Nước đệm

100

► 6

Cồn tuyệt đối

250

► 7

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

► 8

Dung dịch đệm rửa A

750

► 9

Dung dịch đệm rửa B

750

► 10

Dung dịch đệm rửa B

750

► 11

Nước đệm

100

► 12

B.2.3  Chuẩn bị mẫu

- Cho 250 µL dung dịch đệm vào các ống eppendort.

- Cho 100 µL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy Vortex (4.2.2) trong 15 s.

- Ly tâm 12 000 g trong 1 min.

- Cho 350 µL (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

B.2.4  Đưa mẫu vào máy TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Đặt lược vào máy TACO.

- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min.

- Thu 100 µL ARN từ các giếng trong cột 6 và 12 sang các ống eppendort mới.

CHÚ THÍCH: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh IHNV.

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi bằng phương pháp RT- PCR

C.1  Mồi của phương pháp RT-PCR

Bảng C.1 - Trình tự các cặp mồi^[4]

Mồi	Trình tự nucleotit
IHNVF	5’-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3’
IHNV R	5’-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3’

C.2  Thực hiện phản ứng RT-PCR

Thực hiện phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi IHNV F/IHNV R

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng xem Bảng C.2.

VÍ DỤ: RT-PCR dùng kít nhân gen Superscript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^® Taq DNA Polymerase .Cat: 12574-026[2]⁾

Bảng C.2 - Thành phần của phản ứng RT- PCR

Thành phần	Nồng độ	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARNse và DNase		8
2X Reaction Mix		12,5
Mồi IHNVF	20 µM	0,5
Mồi IHNV R	20 µM	0,5
Enzym Taq Mix		0,5
Tổng thể tích		22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 3 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng IHNV chuẩn;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 3 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng;

- Tiến hành phản ứng RT-PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt như nêu trong Bảng C.3 (Phụ lục C).

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR^[4]

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Chu kỳ
50	30 min	1
95	2 min
95	30 s	30
50	30 s
68	1 min
68	7 min	1

 

Phụ lục D

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy tế bào EPC

Có thể sử dụng môi trường ở mục D.1 hoặc D.2 thành phần như sau:

D.1  Môi trường có thành phần cơ bản là môi trường L-15 Leibovitz

- Môi trường L-15 Leibovitz (3.3.3);

- Dung dịch glutamin 2 mM (3.3.5);

- FBS 10 % thể tích (3.3.4);

- Dung dịch chứa penicillin (100 IU/mL) và streptomycin (100 µg/mL) hoặc gentamycin (50 µg/mL) (3.3.2)

D.2  Môi trường có thành phần cơ bản là Minimum Essential Medium (MEM)

- MEM (Earles) (3.3.7);

- Dung dịch glutamin 2 mM (3.3.5);

- 1 % Non Essential Amino Acids (NEAA);

- 120 mg/L Sodium Pyruvate;

- FBS 10% thể tích (3.3.4);

- Dung dịch chứa penicillin (100 IU/mL) và streptomycin (100 µg/mL) hoặc gentamycin (50 µg/mL) (3.3.2)

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bootladn Im & leong jc (1999). Vi rút hoại tử tạo máu truyền nhiễm. Trong : Bệnh và rối loạn cá, Tập 3: Nhiễm virut, vi khuẩn và nấm. Woo PTK & Bruno DW, biên tập. CAB International, Oxon, UK, 57;

[2] FAO/NACA. 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fish. Pap. No.402/2;

[3] Emmenegger ej, meyers tr, burton to & kurath g. (2000). Đa dạng di truyền và dịch tễ học của vi rút hoại tử tạo máu truyền nhiễm ở Alaska. Dis. Aquat. Org. ,40, 163 Kho176;

[4] Eurl for fish diseases. 2015. Official Journal of the European Union, Diagnostic methods and procedures for the surveillance and onfirmation of IHN and VHS.p 247/37-247/45.