Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-22:2022 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 22: Bệnh sán lá 16 móc ở cá

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-22:2022

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 22: BỆNH SÁN LÁ 16 MÓC Ở CÁ

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 22: Dactylogyrosis in fish

Lời nói đầu

TCVN 8710-22:2022 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8710-1:2011, Phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm;

- TCVN 8710-2:2019, Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển;

- TCVN 8710-3:2019, Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm;

- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;

- TCVN 8710-5:2011, Phần 5: Bệnh taura ở tôm he;

- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép;

- TCVN 8710-7:2019, Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;

- TCVN 8710-8:2012, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm;

- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;

- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11:2015, Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-12:2019, Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

- TCVN 8710-13:2015, Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;

- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;

- TCVN 8710-22:2022, Phần 22: Bệnh sán lá 16 móc ở cá;

- TCVN 8710-23:2022, Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi;

- TCVN 8710-24:2022, Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn;

- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu.

 

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 22: BỆNH SÁN LÁ 16 MÓC Ở CÁ

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 22: Dactylogyrosis in fish

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh sán lá 16 móc ở cá.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1.1

Bệnh sán lá 16 móc ở cá (Dactylogyrosis in fish)

Bệnh do một số loài sán lá đơn chủ thuộc giống Dactylogyrus gây ra ở cá.

2.1.2

Sán lá 16 móc (Gill Fluke)

Loài ký sinh trùng thuộc giống Dactylogyrus (Diesing, 1850), họ Dactylogyridea (Bychowsky, 1937), bộ Dactylogyride (Bychowsky, 1937).

2.2  Các từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid):	axit deoxyribonucleic;
- PBS (Phosphate buffered saline):	dung dịch muối đệm phosphat;
- PCR (Polymerase Chain Reaction):	phản ứng chuỗi polymerase;
- TAE (Tris-acetate-EDTA):	Tris-axetat-axit etylendiamintetraaxetic;
- TBE (Tris-borate-EDTA):	Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic;
- TE (Tris-EDTA):	Tris-axit etylendiamintetraaxetic.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước sử dụng phải là nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1  Etanol, từ 70 % đến 100 % (thể tích)

3.1.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

3.1.3  Nước muối sinh lý (dung dịch natri clorua 0,9 %)

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR

3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.2  Kít tách chiết ADN

3.2.3  Kít nhân gen PCR

3.2.4  Dung dịch đệm TE

3.2.5  Thang chuẩn ADN (Ladder/Marker)

3.2.6  Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.7  Thạch agarose

3.2.8  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (xem A.1).

3.2.9  Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.10  Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6 X)

3.3  Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp nhuộm Carmin

3.3.1  Dung dịch nhuộm AFA

3.3.2  Dung dịch nhuộm Semichon’s Carmin

3.3.3  Dung dịch tẩy màu (cồn axit)

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1  Tủ lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

4.1.2  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ - 20 °C đến - 80 °C

4.1.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

4.1.4  Pipet đơn kênh các loại

4.1.5  Ống đong, dung tích 100 mL; 500 mL; 1000 mL

4.1.6  Máy ly tâm

4.1.7  Lò vi sóng

4.1.8  Dụng cụ chứa mẫu, kín, có nắp đậy, không rò rỉ, vô trùng.

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR

4.2.1  Máy nhân gen PCR

4.2.2  Máy tách chiết Taco

4.2.3  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g, 12 000 g và 20 000 g

4.2.4  Máy lắc trộn Vortex

4.2.5  Máy ly tâm Spindown

4.2.6  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.2.7  Máy đọc sản phẩm PCR

4.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp soi tươi

4.3.1  Kính hiển vi, có độ phóng đại 4 X, 10 X và 40 X.

4.3.2  Lam kính

4.3.3  Lamen

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

Sán lá 16 móc đẻ trứng đã thụ tinh ra môi trường nước, ở nhiệt độ thích hợp trứng phát triển thành ấu trùng, ấu trùng bơi lội tự do trong nước một thời gian, sau đó bám vào da, vây, đuôi và mang cá, phát triển thành trùng trưởng thành, tiếp tục chu kỳ ký sinh.

Mỗi loài Dactylogyrus chỉ ký sinh ở một loài cá ký chủ, ví dụ: Dactylogyrus ctenopharyngodon ký sinh ở cá trắm cỏ, D. hypophthalmichthys ký sinh ở cá mè trắng Trung Quốc, D. harmandi ký sinh ở cá mè trắng Việt Nam.

Sán lá 16 móc ký sinh trên cá ở nhiều lứa tuổi nhưng gây thiệt hại nghiêm trọng nhất là đối với cá hương, cá giống.

Bệnh do sán lá 16 móc phát triển mạnh trong các ao nuôi mật độ dày, điều kiện môi trường ô nhiễm hữu cơ, nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển khoảng từ 22 °C đến 28 °C.

Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện nhiều vào mùa xuân, mùa thu ở miền Bắc, mùa mưa ở miền Nam.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Khi ký sinh, sán lá 16 móc dùng móc của đĩa bám sau để bám vào tổ chức cơ thể ký chủ, tuyến đầu tiết ra enzym hialuronodase phá hoại tế bào tổ chức, làm mang và da cá nhợt nhạt, tiết nhiều dịch nhờn gây ảnh hưởng đến hô hấp của cá.

Khi bị sán lá 16 móc tấn công, da cá sẫm màu, đôi khi xuất hiện màu trắng xám của chất nhày trên da, đặc biệt là phía sau vây hoặc phía trước lưng cá.

Cá có dấu hiệu bơi lội bất thường, mang có hiện tượng sưng, phù nề, cá nổi đầu và bơi lội chậm chạp, lờ đờ, cơ thể gầy yếu.

Cá nhiễm sán lá 16 móc có thể gây chết từ rải rác tới hàng loạt ở cá hương và cá giống.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Phương pháp soi tươi

6.1.1  Lấy mẫu

Cá có kích thước < 4 cm:	Lấy nguyên con, từ 10 con đến 15 con.
Cá có kích thước từ 4 cm đến 6 cm:	Lấy nguyên con, từ 5 con đến 10 con.
Cá có kích thước > 6 cm và cá bố mẹ:	Lấy nguyên con, từ 3 con đến 5 con hoặc lấy mang của từ 3 con đến 5 con.

Mẫu bệnh phẩm phải được lấy vô trùng và để riêng biệt trong dụng cụ chứa mẫu (4.1.8).

6.1.2  Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản sống không thay nước khi vận chuyển về phòng thí nghiệm.

Trong phòng thí nghiệm, mẫu sán được thu và bảo quản trong dung dịch etanol 70 % (3.1.1) theo tỷ lệ mẫu : etanol bằng 1:10.

6.1.3  Cách tiến hành

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý (3.1.3) lên trên lam kính, tiếp theo lấy nhớt mang và nhớt trên da, vây, đuôi cho vào lam kính (4.3.2) chứa nước muối sinh lý sau đó ép lamen (4.3.3) lên trên và tiến hành soi trên kính hiển vi (4.3.1) với độ phóng đại 4 X, 10 X và 40 X.

6.1.4  Đọc kết quả

Định loại sán lá đơn chủ Dactylogyrus bằng hình thái học trên kính hiển vi tại các độ phóng đại 4 X, 10 X và 40 X như sau:

- Sán có dạng dẹp, màu trắng nhạt, chiều dài cơ thể dao động từ 0,4 mm đến 1,0 mm và vận động linh hoạt theo phương thức của con sâu đo.

- Cơ thể gồm có phần đầu chia làm 4 thùy và có 4 tuyến đầu (khi sán vươn dài về phía trước mới có thể nhìn thấy các thùy này).

- Phía trước có 4 điểm mắt do các đám tế bào sắc tố tạo thành tác dụng cảm giác ánh sáng.

- Phía sau cơ thể có đĩa bám, chính giữa đĩa bám có một đôi móc lớn, hai móc nối giữa nối với nhau bởi các thanh nối lưng và thanh nối bụng, xung quanh đĩa bám có 7 đôi móc rìa.

6.2  Phương pháp nhuộm Carmin

6.2.1  Lấy mẫu, theo 6.1.1.

6.2.2  Bảo quản mẫu, theo 6.1.2.

6.2.3  Chuẩn bị mẫu

Lấy một phần cung mang của cá, đặt phần cung mang lên lam kính, dùng dao cạo nhớt trên mang cá, hút phần dung dịch vào ống effendoft, bổ sung từ 500 µl đến 1000 µl nước muối sinh lý (3.1.3), thu sán. Sau đó chuyển sán sang etanol 70 % đựng trong dụng cụ chứa mẫu (4.1.8).

Phải dùng các dụng cụ vô trùng khác nhau khi lấy mô ở các mẫu khác nhau để tránh lây nhiễm.

6.2.4  Cách tiến hành

Tiến hành xử lý mẫu, nhuộm soi tiêu bản theo hướng dẫn (xem Phụ lục D).

6.2.5  Đọc kết quả

Soi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao, sau khi nhuộm, có thể quan sát rõ hình thái bên ngoài (theo 6.1.4) và cấu tạo cơ quan bên trong của sán như sau:

- Cơ quan tiêu hóa có miệng hình phễu ở trước, tiếp theo là hầu, thực quản ngắn, ruột chia làm hai nhánh chạy dọc cơ thể xuống phía sau rồi tiếp hợp tạo thành ruột kín. Chỗ ruột gặp nhau hơi phình to, sán lá đơn chủ Dactylogyrus không có hậu môn.

- Cơ quan sinh dục lưỡng tính, cơ quan sinh dục đực và cơ quan sinh dục cái trên cùng cơ thể. Cơ quan sinh dục cái có một buồng trứng thường ở phía trước tinh hoàn, buồng trứng hướng về phía trước có ống dẫn trứng thông với tử cung và lỗ sinh dục (âm đạo) ở mặt bụng gần vị trí ruột phân nhánh. Cơ quan sinh dục đực gồm có tinh hoàn ở giữa hoặc ở phía sau cơ thể, ống dẫn tinh nhỏ thông với túi chứa tinh đến cơ quan giao cấu rồi đến xoang sinh dục.

6.3  Phương pháp PCR

6.3.1  Lấy mẫu, theo 6.1.1.

6.3.2  Bảo quản mẫu

- Trong quá trình vận chuyển, mẫu cá được vận chuyển đến phòng thí nghiệm phải còn sống.

- Hoặc mẫu cá được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h khi vận chuyển về phòng thí nghiệm.

- Trong phòng thí nghiệm mẫu sán được thu và bảo quản trong dung dịch etanol 70 % (3.1.1) theo tỷ lệ mẫu : etanol bằng 1:10.

6.3.3  Cách tiến hành

6.3.3.1  Chuẩn bị mẫu

Lấy một phần cung mang của cá, đặt phần cung mang lên lam kính và dùng pank kéo cạo phần nhớt và dùng dao cạo nhớt trên mang cá, hút phần dung dịch vào ống eppendoft, bổ sung từ 500 µl đến 1000 µl nước muối sinh lý (3.1.3), trộn đều, đem ly tâm, thu phần đáy là ký sinh trùng. Sau đó cho thêm 500 µl dung dịch PBS (3.1.2).

6.3.3.2  Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết ADN (3.2.2) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)[1]⁾ (xem Phụ lục B.1) hoặc sử dụng kít tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)¹⁾ (xem Phụ lục B.2).

6.3.3.3  Chuẩn bị mồi

Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Dactylogyrus F1 và Dactylogyrus R1 (3.2.1) để phát hiện sán lá 16 móc.

Trình tự cặp mồi (xem Phụ lục C, Bảng C.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm spindown (4.2.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Sử dụng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi gốc ở nồng độ 100 µM.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.6) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.3.3.4  Cách tiến hành

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen PCR (4.2.1) theo phương pháp PCR sử dụng cặp mồi Dactylogyrus F1 và Dactylogyrus R1, sử dụng kít nhân gen PCR (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.3.3.5  Điện di

6.3.3.5.1  Chuẩn bị bản thạch

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.7) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1 X hoặc TAE 1 X (3.2.8) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ của thạch giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.9) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược, bản thạch không dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản thạch vào bể điện di (4.2.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1 X hoặc TAE 1 X) vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.3.3.5.2  Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (loading dye 6 X) (3.2.10) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.5) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (3.2.5) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.3.3.6  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc sản phẩm PCR (4.2.7).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm có kết quả âm tính, không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu đối chứng dương có kết quả dương tính, được thể hiện bằng vạch sáng rõ có kích thước 556 bp;

Với điều kiện phản ứng trên, mẫu xét nghiệm âm tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng 556 bp (không có sản phẩm khuếch đại);

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử xuất hiện sản phẩm khuếch đại có vạch sáng kích thước 556 bp;

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

7  Kết luận

Cá được xác định nhiễm bệnh sán lá 16 móc khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh và:

- Định loại hình thái học sán lá 16 móc bằng phương pháp soi tươi, hoặc:

- Định loại hình thái học sán lá 16 móc bằng phương pháp nhuộm Carmin, hoặc:

- Có kết quả dương tính bằng phương pháp PCR với sán lá 16 móc Dactylogyrus sp.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10 X:	100 ml
Nước khử ion:	900 ml
Tổng:	1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10 X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.2.1  Thành phần

Natri clorua (NaCI)	8g
Natri hydro phosphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O)	2,9 g
Kali dihydro phosphat (KH2PO4)	0,2 g
Kali clorua (KCI)	0,2 g
Nước cất	1000ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH về trung tính bằng dung dịch natri hydroxit 1 N hoặc dung dịch axit clohydric 1 N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B.1  Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)

- Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống eppendort, thêm 180 µl dung dịch ATL, thêm 20 µl proteinase K vào, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex (4.2.4);

- Ủ ở 56 °C qua đêm cho đến khi hoàn toàn đồng nhất. Lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex;

- Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer). Lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex;

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min;

- Thêm 200 µl etanol (từ 96 % đến 100 %) vào ống eppendort. Lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex;

- Hút huyễn dịch trong ống eppendort, chuyển sang cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột lọc;

- Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột lọc;

- Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml;

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống eppendort 1,5 ml khác.

- Bảo quản mẫu ADN ở 2 °C đến 8 °C trong vài tuần và bảo quản ở - 20 °C trong thời gian dài.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện ký sinh trùng Dactylogyrus sp. trên cá.

B.2  Tách chiết ADN bằng bộ kít TACO RNA/DNA Extraction Kít

B.2.1  Vật liệu thử

- Bộ kít chiết tách TACO RNA/DNA Extraction Kít (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)

- Etanol 100 % (cồn tuyệt đối)

B.2.2  Chuẩn bị:

- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml cồn tuyệt đối

- Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml cồn tuyệt đối

- Tiến hành theo sơ đồ:

Thuốc Thử

Lượng (µl)

Thuốc thử

Lượng (µl)

H

G

F

E

D

C

B

A

Cồn tuyệt đối

250

► 1

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

► 2

Dung dịch đệm rửa A

750

► 3

Dung dịch đệm rửa B

750

► 4

Dung dịch đệm rửa B

750

► 5

Nước đệm

100

► 6

Cồn tuyệt đối

250

► 7

Dung dịch đệm rửa A

750

Hạt từ

50

► 8

Dung dịch đệm rửa A

750

► 9

Dung dịch đệm rửa B

750

► 10

Dung dịch đệm rửa B

750

► 11

Nước đệm

100

► 12

B.2.3  Chuẩn bị mẫu:

- Cho 250 µL dung dịch đệm vào các ống eppendort.

- Cho 100 µL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy Vortex (4.2.4) trong 15 s.

- Ly tâm 12 000 g trong 1 min.

- Cho 350 µL (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc cột 7.

B.2.4  Đưa mẫu vào máy TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Đặt lược vào máy TACO.

- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min.

- Thu 100 µL ADN từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendort mới.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện sán lá Dactylogyrus sp. ở cá.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp PCR phát hiện sán lá 16 móc ở cá

C.1  Trình tự cặp mồi

Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi

Tên mồi	Trình tự cặp mồi	Kích thước sản phẩm
Dactylogyrus F1	5’ - GCGAGTGAACGGAGATTAGC - 3’	556 bp
Dactylogyrus R1	5’ - CCATTATTGACCGTGATGTATG - 3’

C.2  Thực hiện phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR bao gồm:

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi Dactylogyrus F1 và Dactylogyrus R1 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) Cat K0171)3⁾

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần	Nồng độ (µM)	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/DNA		6,5
Dung dịch 2X Reaction Mix		12,5
Mồi Dactylogyrus F1	20	0,5
Mồi Dactylogyrus R1	20	0,5
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng		20

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ^[1]

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
95	05 min	1
94	30 s	35
53	45 s
72	45 s
72	10 min	1

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp nhuộm Carmin

D.1  Thành phần thuốc thử

D.1.1  Thuốc nhuộm Semichon’s carmin

- Axit axetic 100 %: 50 ml

- Nước cất: 50 ml

- Chất nhuộm Carmine đỏ

D.1.2  Thuốc nhuộm AFA

- Formaldehyd 37 %: 10 ml

- Etanol 95 %: 5 ml

- Axit axetic 100 %: 2 ml

- Nước cất: 40 ml

D.1.3  Dung dịch tẩy màu

- Axit clohydric: 1 ml

- Etanol 70 %: 100 ml

D.2  Chuẩn bị

Chuẩn bị 1 lọ thủy tinh, cho axit axetic 100 % và nước cất, thêm Carmin đỏ đến khi dung dịch bão hòa, sau đó đặt lọ dung dịch vào chậu nước ấm 90 °C trong vòng 15 min. Cuối cùng gạn phần nổi phía trên bằng giấy lọc và thu phần dung dịch ở dưới.

D.3  Cách tiến hành

- Ngâm mẫu sán trong etanol 70 % (3.1.1);

- Đặt mẫu sán giữa 2 lam kính, ép nhẹ và ngâm trong bể chứa dung dịch nhuộm AFA (3.3.1) qua đêm;

- Chuyển vào ngâm trong ethanol 70 % trong 30 min;

- Chuyển vào đĩa petri chứa dung dịch nhuộm Semichon’s carmine (3.3.2) trong 60 min;

- Rửa bằng cồn 70 % trong 30 min và làm nhạt màu bằng cách nhúng vào cồn axit (3.3.3) trong 5 min mỗi lần, lặp lại cho đến khi màu hồng của mẫu xuất hiện;

- Rút nước bằng cách ngâm etanol trong vòng 30 min cho mỗi nồng độ: 80 %, 90 % và 100 %;.

- Làm trong bằng xylen trong 1 min và gắn keo dán D.P.X mountant trên lam kính với lamen;

- Dán nhãn với thông tin như ngày, tên loài, nơi lấy mẫu và người lấy mẫu.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Amin Ahmadi, Hassan Borji, Abolghasem Naghibi, Mohammad Reza Nasiri, Hassan Sharifiyazdi (2017). Morphologic ADN molecular (28S rDNA) characterization of Dactylogyrus spp. in Cyprinus carpio ADN ctenopharyngodon idella in Mashhad, Iran, 280-284p;

[2] Animal Parasitology, Biology 625 laboratory manual (.pdf version) Fall semester 2005 Tuesdays 02:30-5:20; Ackert Rm 226 (Copyright© 2004-2005 Steve J Upton PhD, Kansas state University);

[3] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học Thủy sản. NXB Nông nghiệp;

[4] Hà Ký, Bùi Quang Tề (2007). Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật; 316p;

[5] Trương Đình Hoài, Nguyễn Thị Hậu, Kim Văn Vạn (2013). Một số đặc điểm sinh học sinh sản của sán lá đơn chủ đẻ trứng Dactylogyrus sp. ký sinh trên cá trắm cỏ. Tạp chí khoa học và phát triển tập 11, số 7: 957-964;

[6] Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa (2005). Giáo trình bệnh học Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ;

[7] Mozhdeganlou, Z.; Ebrahimzadeh Mousavi, H.; Shayan, P.; Soltani, M.; Ebrahimzadeh, E. and M. Rostami (2011). Detection of single spp. in DNA extracted from infected gill tissue of fishes using Polymerase Chain Reaction. International Journal of Veterinary Research. 5; 2: 77-80.