Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-37:2020 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 37: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-37:2020

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 37: VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC PHÒNG BỆNH MAREK Ở GÀ

Vaccine testing procedure - Part 37: Marek disease vaccine, live

Lời nói đầu

TCVN 8685-37:2020 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương 1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1:2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2:2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

- TCVN 8685-3:2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;

- TCVN 8685-4:2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5:2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6:2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7:2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8:2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9:2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10:2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11:2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12:2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-13:2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-14:2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15:2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16:2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17:2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18:2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19:2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8685-20:2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21:2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22:2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

- TCVN 8685-23:2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella enteritidis ở gà;

- TCVN 8685-24:2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25:2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8685-26:2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27:2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-28:2019, Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng ở lợn;

- TCVN 8685-29:2019, Phần 29: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) ở gà;

- TCVN 8685-30:2019, Phần 30: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm não tủy truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-31:2019, Phần 31 vắc xin phòng bệnh Dại ở chó;

- TCVN 8685-32:2019, Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma gallisepticum ở gia cầm;

- TCVN 8685-33:2019, Phần 33: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Riermerella anatipestifer;

- TCVN 8685-34:2020, Phần 34: Vắc xin phòng bệnh tiêu chảy thành dịch do Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-35:2020, Phần 35: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8685-36:2020, Phần 36: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng và bệnh đóng dấu ở lợn;

- TCVN 8685-37:2020, Phần 37: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8685-38:2020, Phần 38: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh do Leptospira gây ra;

- TCVN 8685-39:2020, Phần 39: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng còi cọc do Circovirus gây ra ở lợn.

 

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 37: VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC PHÒNG BỆNH MAREK Ở GÀ

Vaccine testing procedure - Part 37: Marek disease vaccine, live

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình kiểm nghiệm vắc xin nhược độc dạng đông khô và dạng đông lạnh phòng bệnh Marek ở gà.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684:2011 Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết

3  Chữ viết tắt

PBS: Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phốt phát)

PFU: Plaque-forphiitg Unit (Đơn vị hình thành mảng bám)

VNT: Viral Neutralization Test (Phản ứng trung hòa vi rút)

TCID₅₀: Tissue Culture Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50% tế bào)

FBS: Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bào thai bê)

DMEM: Dulbeccơs Modified Eagle Media (Môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ)

CPE: Cytopathic Effect (Bệnh tích tế bào)

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ thuần khiết bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu an toàn và hiệu lực được đánh giá trên gà 1 ngày tuổi, khỏe mạnh, không có kháng thể Marek.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Gà 1 ngày tuổi, gà khỏe, không có kháng thể Marek.

5.2  Nước muối sinh lý vô trùng, nồng độ từ 0,85 % đến 0,9 %.

5.3  Tế bào xơ phôi gà 1 lớp

6  Cách tiến hành

6.1  Kiểm tra cảm quan

6.1.1  Vắc xin dạng đông lạnh

- Sau khi vắc xin được giải đông, lắc nhẹ lọ vắc xin và quan sát độ đồng đều của hỗn dịch bằng mắt thường.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra cảm quan khi có hỗn dịch đồng đều, không đông vón, không lắng cặn.

6.1.2  Vắc xin dạng đông khô

- Quan sát hình dạng viên vắc xin và độ đồng đều của hỗn dịch sau khi hoàn nguyên với nước muối sinh lý vô trùng (5.2) bằng mắt thường.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra cảm quan khi có dạng viên xốp, dễ tách khỏi thành lọ, hỗn dịch sau khi hoàn nguyên đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

6.2  Kiểm tra độ thuần khiết

- Kiểm tra độ thuần khiết theo 4.1, 4.2 TCVN 8684:2011.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra thuần khiết khi không có bất cứ tạp khuẩn hay nấm mốc nào mọc trên các môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

6.3  Kiểm tra tính an toàn

- Tiêm dưới da cho 10 gà (5.1), mỗi gà 10 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Sau khi tiêm, theo dõi gà thí nghiệm trong 21 ngày.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra an toàn khi cả 10 gà sống khỏe, phát triển bình thường, không có biểu hiện khác thường cũng như không có biểu hiện triệu chứng của bệnh Marek.

6.4  Kiểm tra hiệu lực

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

6.4.1  Phương pháp trung hòa

- Sử dụng 30 gà (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 20 gà, mỗi gà được tiêm dưới da 1 liều vắc xin ghi trên nhãn;

+ Nhóm 2: gồm 10 gà làm đối chứng, mỗi gà được tiêm nước muối sinh lý vô trùng (5.2) với liều lượng và đường tiêm như gà nhóm 1.

- Sau khi tiêm vắc xin từ 28 ngày đến 35 ngày, 20 gà nhóm 1 và 10 gà nhóm 2 được lấy máu, chắt huyết thanh, kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phản ứng trung hoà với chủng vi rút vắc xin.

Phản ứng trung hòa vi rút được nêu trong Phụ lục A.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra hiệu lực khi:

+ Ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 1 có hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 1/16;

+ Ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 2 âm tính.

6.4.2  Phương pháp chuẩn độ hàm lượng vi rút vắc xin

- Chuẩn độ hàm lượng vi rút vắc xin trên tế bào xơ phôi gà 1 lớp (5.3).

Cách tiến hành chuẩn độ hàm lượng vi rút vắc xin được nêu trong Phụ lục B.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra hiệu lực khi mỗi liều vắc xin có ít nhất 1000 PFU/ml.

7  Kết luận

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, độ thuần khiết, an toàn và hiệu lực như đã nêu lần lượt ở 6.1, 6.2, 6.3 và 6.4.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Phản ứng trung hòa vi rút (Viral Neutralization Test - VNT)

A.1  Vật liệu và thuốc thử

A.1.1  Dung dịch PBS 1 X, pH 7,2.

A.1.2  Dung dịch trypsin 1 X.

A.1.3  Huyết thanh bào thai bê (FBS).

A.1.4  Môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM có bổ sung 5 % đến 10 % huyết thanh bào thai bê.

A.1.5  Trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi.

A.1.6  Giống vi rút đông khô

A.1.7  Huyết thanh đối chứng

A.2  Thiết bị, dụng cụ

A.2.1  Panh, kéo nhọn vô trùng.

A.2.2  Đĩa lồng (đĩa petri) vô trùng.

A.2.3  Bình tam giác, cốc đong vô trùng.

A.2.4  Máy khuấy từ, tốc độ từ 5 vòng/phút đến 200 vòng/phút.

A.2.5  Máy ly tâm, có thể quay với tốc độ 1500 vòng/phút.

A.2.6  Kính hiển vi có vật kính với độ phóng đại 10 X.

A.2.7  Đĩa phản ứng 6 giếng sạch.

A.2.8  Đĩa phản ứng 96 giếng sạch.

A.2.9  Tủ ấm CO₂, duy trì nhiệt độ 37 °C, có bổ sung từ 5 % đến 10 % CO₂.

A.2.10  Bơm tiêm một lần, dung tích 5 ml, 10 ml.

A.2.11  Buồng đếm tế bào Neubauer Improved

A.2.12  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

A.2.13  Micropipet, dung tích từ 100 μl đến 1000 μl.

A.2.14  Micropipet, dung tích từ 50 μl đến 100 μl.

A.3  Cách tiến hành

A.3.1  Chuẩn bị tế bào có mật độ 3 × 10⁵ tế bào/ ml

A.3.1.1  Bộc lộ phôi

- Dùng panh (A.2.1) đập lớp vỏ của trứng gà có phôi (A.1.5) ở phía buồng hơi và bộc lộ màng cứng. Lấy panh (A.2.1) gắp phôi ra ngoài, tập trung phôi vào cốc đong (A.2.3).

- Rửa phôi từ 2 lần đến 3 lần bằng dung dịch PBS (A.1.1).

- Gắp phôi ra đĩa lồng (A.2.2). Dùng kéo nhọn (A.2.1) loại bỏ chân, cánh, đầu, cơ quan nội tạng.

- Rửa phôi đã cắt từ 2 lần đến 3 lần bằng dung dịch PBS (A.1.1) với lượng 10 ml/ phôi/ lần rửa.

- Dùng kéo nhọn (A.2.1) cắt nhỏ phôi và chuyển vào bình tam giác (A.2.3).

- Dùng bơm tiêm một lần (A.2.10) hút dung dịch PBS (A.1.1) vào bình tam giác chứa phôi đã được cắt nhỏ với lượng 10 ml/ phôi. Đặt bình tam giác trên máy khuấy từ (A.2.4) để rửa phôi trong vòng 10 phút. Sau đó để lắng, dùng bơm tiêm một lần (A.2.10) hút bỏ dịch nổi ở trên, chỉ giữ lại cặn.

A.3.1.2  Trypsin hóa tách tế bào

- Dùng bơm tiêm một lần (A.2.10) hút dung dịch trypsin (A. 1,2) vào bình tam giác chứa phôi đã được bộc lộ (A.3.1.1) với lượng 5 ml/ phôi.

- Giữ bình trypsin ở nhiệt độ 37 °C trong khoảng 15 phút đến 20 phút.

- Quan sát tế bào đã được trypsin hóa hoàn toàn (hỗn dịch màu trắng đục, đồng đều).

- Bổ sung 2 % huyết thanh bào thai bê FBS (A.1.3) so với lượng trypsin đã dùng để trung hòa dung dịch, cuối cùng ta thu được tế bào đã được trypsin hóa.

A.3.1.3  Loại bỏ trypsin

Ly tâm tế bào đã được trypsin hỏa (A.3.1.2) bằng máy ly tâm (A.2.5) với tốc độ 1500 vòng/phút, trong 15 phút ở nhiệt độ 4 °C. Dùng bơm tiêm một lần (A.2.10) hút bỏ dịch nổi phía trên, thu được cặn tế bào.

A.3.1.4  Cân bằng môi trường và đếm số tế bào

- Dùng bơm tiêm một lần (A.2.10) hút 6 ml môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) cho từ từ vào bình tam giác chứa cặn tế bào đã được loại bỏ trypsin (A.3.1.3).

- Pha loãng tế bào 10 lần (ví dụ 100 μl tế bào với 900 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4)), dùng buồng đếm tế bào (A.2.11) đếm số tế bào trên kính hiển vi (A.2.6) ở vật kính 10 X, tính số tế bào có trong 1 ml theo công thức sau:

A.3.1.5  Cấy chuyển tế bào

- Pha loãng tế bào đến mật độ 3 × 10⁵ tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4).

Cách pha loãng tế bào như sau:

+ Thể tích môi trường nuôi cấy tế bào của mỗi đĩa phản ứng 96 giếng là 5ml, nên số lượng tế bào cần sử dụng là 5 × 3 × 10⁵ tế bào.

+ Thể tích tế bào cần sử dụng = (5 × 3 × 10⁵)/số tế bào (tính theo công thức trong mục A.3.1.4)

+ Thể tích môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM = 5ml - thể tích tế bào cần sử dụng.

+ Trộn đều thể tích tế bào cần sử dụng và môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4), chuyển 50 μl vào các giếng của đĩa phản ứng 96 giếng (A.2.8).

- Bảo quản tế bào ở tủ lạnh (A.2.12) để thực hiện các bước pha loãng huyết thanh.

A.3.2  Pha loãng dung dịch vi rút

- Hoàn nguyên vào lọ giống vi rút đông khô (A.1.6) bằng môi trường DMEM để được nồng độ 10^-1.

- Lấy 1 ml dung dịch nồng độ 10^-1 cho vào 9 ml dung dịch PBS (A.1.1), trộn đều được dung dịch nồng độ 10^-2, lấy tiếp 1 ml dung dịch nồng độ 10^-2 cho vào 9 ml dung dịch PBS (A.1.1) được dung dịch nồng độ 10^-3, tiến hành lặp lại cho đến nồng độ pha loãng cao nhất và gần với nồng độ cần trung hoà (100 TCID₅₀).

- Lấy 1 ml dung dịch vi rút ở nồng độ pha loãng cao nhất và thể tích DMEM, trộn đều với nhau để được nồng độ pha loãng 100 TCID₅₀.

A.3.3  Pha loãng huyết thanh

CHÚ DẪN:

Cột: từ cột 1 đến cột 12

Hàng: từ hàng A đến hàng H

Hình A.1 - Minh họa đĩa nhựa 96 giếng

- Thực hiện trên đĩa phản ứng 96 giếng (A.2.8) theo các bước sau:

Bước 1: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 150 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng A1, A3, A5, A7, A9 và A11 của đĩa phản ứng.

Bước 2: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 100 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng từ B1 đến H1, từ B3 đến H3, từ B5 đến H5, tử B7 đến H7, từ B9 đến H9 và từ B11.đến H11.

Bước 3: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl mẫu huyết thanh cần Kiểm tra (6.4.1) vào các giếng A1, A3, A5, A7, A9, A11.

Bước 4: pha loãng bậc 2 mẫu huyết thanh từ A1 đến H1, từ A3 đến H3, từ A5 đến H5, từ A7 đến H7, từ A9 đến H9 và từ A11 đến H11 và loại bỏ 100 μl.

Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) chuyển 50 μl mẫu huyết thanh đã pha loãng ở bước 4 từ cột 1 sang cột 2, từ cột 3 sang cột 4, từ cột 5 sang cột 6, từ cột 7 sang cột 8, từ cột 9 sang cột 10 và từ cột 11 sang cột 12.

Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút (A.3.2) vào các giếng.

Bảng A.1 - Sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa phản ứng 96 giếng

Mẫu   Độ pha loãng

Mẫu huyết thanh 01

Mẫu huyết thanh 02

Mẫu huyết thanh 03

Mẫu huyết thanh 04

Mẫu huyết thanh 05

Mẫu huyết thanh 06

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/4

B

1/8

C

1/32

D

1/64

E

1/128

F

1/256

G

1/512

H

Bước 6: ủ đĩa ở tủ ấm C02 (A.2.9) trong 45 phút đến 60 phút.

Bước 7: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường DMEM chứa tế bào xơ phôi gà 1 lớp (A.3.1.3) vào tất cả các giếng.

Bước 7: ủ đĩa ở tủ ấm C02 (A.2.9) trong 48 giờ đến 72 giờ.

Bước 8: kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi (A.2.6) ở vật kính 10 × để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào chết nhiều).

A.3.4  Thực hiện trên đĩa đối chứng

Chuẩn bị 1 đĩa phản ứng 96 giếng (A.2.8) làm đĩa đối chứng, sơ đồ bố trí mẫu đối chứng trên đĩa phản ứng 96 giếng được nêu ở bảng A.2.

Bảng A.2 - Sơ đồ bố trí mẫu đối chứng trên đĩa phản ứng 96 giếng

Mẫu     Độ pha loãng

Đối chứng huyết thanh

Đối chứng tế bào

Đối chứng môi trường

Dung dịch vi rút 10-1

Dung dịch vi rút 10-2

Dung dịch vi rút 10-3

Dung dịch vi rút 10-4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/4

B

1/8

C

1/32

D

1/64

E

1/128

F

1/256

G

1/512

H

A.3.4.1  Đối chứng huyết thanh

Bước 1: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 150 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào giếng A1 của đĩa phản ứng 96 giếng (A.2.8).

Bước 2: dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 100 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng từ giếng B1 đến giếng H1 của đĩa phản ứng.

Bước 3: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng (A.1.7) vào giếng A1. Tiến hành pha loãng bậc hai từ giếng A1 đến giếng H1 và loại bỏ 100 μl ở giếng H1.

Bước 4: dùng micropipet (A.2.14) chuyển 50 μl mẫu huyết thanh đã pha loãng từ cột 1 sang cột 2 của đĩa phản ứng.

Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút (A.3.2) vào các giếng từ giếng A1 đến giếng H2 của đĩa phản ứng.

A.3.4.2  Đối chứng tế bào

Dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các từ giếng A3 đến giếng H4 của đĩa phản ứng.

A.3.4.3  Đối chứng môi trường

Dùng micropipet (A.2.13) nhỏ 150 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào giếng A6 đến H7.

A.3.4.4  Chuẩn độ lại vi rút sử dụng

- Bước 1: pha loãng dung dịch vi rút (A.3.2) thành nồng độ 10^-1 (100 μl dung dịch vi rút với 900 μl môi trường DMEM), tiếp tục pha loãng đến các nồng độ 10^-2, 10^-3 và 10^-4.

- Bước 2: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (A.1.4) vào các giếng từ A9 đến H12.

- Bước 3: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút pha loãng ở nồng độ 10^-1 vào các giếng từ A9 đến H9.

- Bước 4: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút pha loãng ở nồng độ 10^-2 vào các giếng từ A10 đến H10.

- Bước 5: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút pha loãng ở nồng độ 10^-3 vào các giếng từ A11 đến H11.

- Bước 6: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl dung dịch vi rút pha loãng ở nồng độ 10^-4 vào các giếng từ A12 đến H12.

- Bước 7: ủ đĩa ở tủ ấm C02 (A.2.9) trong 45 phút đến 60 phút.

- Bước 8: dùng micropipet (A.2.14) nhỏ 50 μl môi trường DMEM chứa tế bào xơ phôi gà 1 lớp (A.3.1.3) vào tất cả các giếng từ A1 đến H2, từ A3 đến H4 và từ A9 đến H12.

A.3.4.5  Ủ đĩa

Ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (A.2.9) trong 24 giờ đến 48 giờ.

A.3.4.6  Soi kính kiểm tra tế bào

Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi (A.2.6) ở vật kính 10 X để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào chết nhiều).

A.3.5  Đọc kết quả

- Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi ngược (A.2.6) để ghi nhận bệnh lý tế bào trên từng giếng.

- Điều kiện chấp nhận kết quả:

+ Đối chứng tế bào: bình thường;

+ Đối chứng môi trường: bình thường;

+ Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh dương chuẩn chỉ chênh lệch ± 1 độ pha loãng bậc 2 so với hiệu giá đã biết;

+ Hiệu giá chuẩn độ lại của vi rút 100 TCID₅₀ nằm trong khoảng log₁₀ 1,5 đến log₁₀ 2,5.

- Kết quả dương tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi (A.2.6) không có bệnh tích tế bào (không có CPE).

- Kết quả âm tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi (A.2.6) có bệnh tích tế bào (có CPE).

- Bệnh tích tế bào được ghi nhận vào phiếu kết quả. Kết quả được tính bằng công thức Karber (1931).

Trong đó:

a  là độ pha loãng cao nhất không có bệnh tích tế bào;

r_l  là số giếng có bệnh tích tế bào ở từng độ pha loãng huyết thanh;

n là số giếng sử dụng cho một độ pha loãng huyết thanh.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Chuẩn độ hàm lượng vi rút vắc xin

B.1  Vật liệu và thuốc thử

B.1.1  Trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi.

B.1.2  Dung dịch PBS 1 X, pH 7,2.

B.1.3  Dung dịch trypsin 1 X.

B.1.4  Huyết thanh bào thai bê (FBS).

B.1.5  Môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM có bổ sung 5 % đến 10 % huyết thanh bào thai bê

B.1.6  Huyễn dịch vi rút Marek.

B.1.7  Dung dịch pha loãng vi rút DMEM 1 X (dung dịch A).

B.1.8  Dung dịch DMEM 1X có bổ sung 2 % FBS, kháng sinh kháng nấm (dung dịch B).

B.1.9  Dung dịch DMEM 2X có bổ sung 2 % FBS, kháng sinh kháng nấm (dung dịch C).

B.1.10  Agar 1 % trong dung dịch DMEM có bổ sung 2 % FBS (dung dịch D).

B.1.11  Dung dịch tím violet 0.1 % trong formalone 10 % (dung dịch E).

B.2  Thiết bị, dụng cụ

B.2.1  Panh, kéo nhọn vô trùng.

B.2.2  Đĩa lồng (đĩa petri) vô trùng.

B.2.3  Bình tam giác, cốc đong vô trùng.

B.2.4  Máy khuấy từ, tốc độ từ 5 vòng/phút đến 200 vòng/phút.

B.2.5  Máy ly tâm, có thể quay với tốc độ 1500 vòng/phút.

B.2.6  Kính hiển vi có vật kính với độ phóng đại 10 X.

B.2.7  Đĩa phản ứng 6 giếng sạch.

B.2.8  Đĩa phản ứng 96 giếng sạch.

B.2.9  Tủ ấm CO₂, duy trì nhiệt độ 37 °C, có bổ sung từ 5 % đến 10 % CO₂.

B.2.10  Bơm tiêm một lần, dung tích 5 ml, 10 ml.

B.2.11  Buồng đếm tế bào Neubauer Improved

B.2.12  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

B.2.13  Micropipet, dung tích từ 100 μl đến 1000 μl.

B.2.14  Micropipet, dung tích từ 50 μl đến 100 μl.

B.2.15  Ống eppendorf, dung tích 100 μl đến 1000 μl.

B.2.16  Pipet, dung tích từ 0,5 ml đến 5 ml.

B.3  Cách tiến hành

B.3.1  Chuẩn bị tế bào có mật độ 3 x 10⁵ tế bào/ml

B.3.1.1  Bộc lộ phôi

- Bước 1: dùng panh (B.2.1) đập lớp vỏ của trứng gà có phôi (B.1.1) ở phía buồng hơi và bộc lộ màng cứng. Lấy panh (B.2.1) gắp phôi ra ngoài, tập trung phôi vào cốc đong (B.2.3).

- Bước 2: rửa phôi từ 2 lần đến 3 lần bằng dung dịch PBS (B.1.2).

- Bước 3: gắp phôi ra đĩa lồng (B.2.2). Dùng kéo nhọn (B.2.1) loại bỏ chân, cánh, đầu, cơ quan nội tạng.

- Bước 4: rửa phôi đã cắt từ 2 lần đến 3 lần bằng dung dịch PBS (B.1.2) với lượng 10 ml/ phôi/ lần rửa.

- Bước 5: dùng kéo nhọn (B.2.1) cắt nhỏ phôi và chuyển vào bình tam giác (B.2.3).

- Bước 6: dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút dung dịch PBS (B.1.2) vào bình tam giác chứa phôi đã được cắt nhỏ với lượng 10 ml/ phôi. Đặt bình tam giác trên máy khuấy từ (B.2.4) để rửa phôi trong vòng 10 phút. Sau đó để lắng, dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút bỏ dịch nổi ở trên, chỉ giữ lại cặn.

B.3.1.2  Trypsin hóa tách tế bào

- Bước 1: dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút dung dịch trypsin (B.1.3) vào bình tam giác chứa phôi đã được bộc lộ (B.3.1.1) với lượng 5 ml/ phôi.

- Bước 2: giữ bình trypsin ở nhiệt độ 37 °C trong khoảng 15 phút đến 20 phút.

- Bước 3: quan sát tế bào đã được trypsin hóa hoàn toàn (hỗn dịch màu trắng đục, đồng đều).

- Bước 4: bổ sung 2 % huyết thanh bào thai bê FBS (B.1.4) so với lượng trypsin đã dùng để trung hòa dung dịch, cuối cùng ta thu được tế bào đã được trypsin hóa.

B.3.1.3  Loại bỏ trypsin

Ly tâm tế bào sau khi trypsin hóa bằng máy ly tâm (B.2.5) với tốc độ 1500 vòng/phút, trong 15 phút ở nhiệt độ 4 °C. Dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút bỏ dịch nổi phía trên, thu được cặn tế bào.

B.3.1.4  Cân bằng môi trường và đếm số tế bào

- Dùng bơm tiêm một lần (B.2.10) hút 6 ml môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (B.1.5) cho từ từ vào bình tam giác chứa cặn tế bào đã được loại bỏ trypsin (B.3.1.3).

- Pha loãng tế bào 10 lần (ví dụ 100 μl tế bào với 900 μl môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (B.1.5)), dùng buồng đếm tế bào (B.2.11) để đếm số tế bào trên kính hiển vi (B.2.6) ở vật kính 10 X, tính số tế bào có trong 1 ml theo công thức sau:

B.3.1.5  Cấy chuyển tế bào

- Pha loãng tế bào đến 3 × 10⁶ tế bào/ ml trong môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM (B.1.5) vừa đủ thể tích cần nuôi cấy.

- Cách pha loãng tế bào như sau:

+ Thể tích môi trường nuôi cấy tế bào của mỗi đĩa phản ứng 6 giếng là 10 ml, nên số lượng tế bào cần sử dụng là 10 × 3 × 10⁵ tế bào.

+ Thể tích tế bào cần sử dụng = (10 x 3 x 10⁵)/số tế bào (tính theo công thức trong mục A.3.1.4)

+ Thể tích môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM = 10 ml - thể tích tế bào cần sử dụng.

+ Trộn đều thể tích tế bào cần sử dụng và môi trường nuôi cấy tế bào đầy đủ DMEM.

- Chuyển 1,6 ml huyễn dịch tế bào vào các giếng của đĩa phản ứng 6 giếng (B.2.7).

B.3.1.6  Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển

Giữ huyễn dịch tế bào (B.3.1.5) ở tủ ấm CO₂ (B.2.9) theo dõi sự phát triển của tế bào trong 1 ngày đến 2 ngày, khi tế bào bám đáy 100 % tiến hành chuẩn độ vi rút trên tế bào.

B.3.2  Chuẩn độ vi rút trên tế bào

B.3.2.1  Pha loãng vi rút

- Bước 1: dùng micropipet (B.2.13) cho dung dịch A vào 10 ống eppendorf (B.2.15), mỗi ống 900 μl và đánh số thứ tự từ 1 đến 10.

- Bước 2: dùng micropipet (B.2.14) chuyển 100 μl huyễn dịch vi rút Marek (B.1.6) vào ống 1, trộn đều.

- Bước 3: dùng micropipet (B.2.14) lần lượt chuyển 100 μl huyễn dịch vi rút từ ống 1 sang ống 2, thực hiện lần lượt cho đến ống 10 ta được huyễn dịch vi rút pha loãng từ 10^-1 đến 10^-10.

B.3.2.2  Gây nhiễm vi rút trên đĩa phản ứng 6 giếng

- Bước 1: loại bỏ môi trường trên đĩa phản ứng 6 giếng (B.3.1.5).

- Bước 2: dùng micropipet (B.2.14) nhỏ huyễn dịch vi rút pha loãng (B.3.2.1) vào các giếng của đĩa phản ứng 6 giếng ở các nồng độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-10, mỗi giếng 1 ml.

- Bước 3: gây nhiễm vi rút ở các nồng độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-10, mỗi giếng 1 ml, giếng đối chứng tế bào cho 1 ml dung dịch A.

- Bước 4: ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (B.2.9) trong 1 giờ.

- Bước 5: loại bỏ môi trường gây nhiễm vi rút trên đĩa phản ứng 6 giếng.

- Bước 6: dùng pipet (B.2.16) cho dung dịch A (B.1.7) vào tất cả các giếng, mỗi giếng 2 ml.

B.3.2.3  Phủ thạch

- Bước 1: dùng pipet (B.2.16) cho dung dịch D (B.1.10) vào tất cả các giếng, mỗi giếng 2 ml.

- Bước 2: để đĩa ở nhiệt độ phòng 15 phút đến 20 phút cho đông thạch. Lật ngược đĩa phản ứng 6 giếng.

- Bước 3: ủ đĩa ở tủ ấm CO₂ (B.2.9) trong 2 ngày đến 4 ngày.

B.3.2.4  Cố định tế bào

- Bước 1: dùng micropipet (B.2.14) nhỏ dung dịch C (B.1.9) vào các giếng của đĩa phản ứng 6 giếng, mỗi giếng 100 μl.

- Bước 2: để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

B.3.2.5  Nhuộm tế bào

- Bước 1: dùng pipet (B.2.16) cho dung dịch E (B.1.11) vào các giếng của dĩa phản ứng 6 giếng, mỗi giếng 2 ml.

- Bước 2: để đĩa ở nhiệt độ phòng trên 12 giờ.

- Bước 3: loại bỏ lớp thạch phía trên. Rửa tế bào dưới vòi nước sau đó làm khô.

B.3.2.6  Đọc kết quả

- Các giếng dương tính: tế bào bị phá hủy để lại khoảng trống trắng ở giếng (Plaque).

- Các giếng âm tính: tế bào không bị phá hủy bắt màu tím violet.

- Tính số lượng đơn vị mảng bám (PFU/1 ml) theo công thức sau:

X = A x 1/n x B

Trong đó:

X: đơn vị mảng bám (PFU)

A: số mảng bám ở nồng độ pha loãng cao nhất

B: độ pha loãng vi rút cao nhất mà vẫn còn mảng bám

n: lượng vi rút gây nhiễm

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ASEAN, (2012). Asean Standard Requirements for Marek’s Disease Vaccine, live. 2nd edition, p28 - 29.

[2] OIE Terrestrial Manual (2012). Chapter 2.3.13 Marek's disease. Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.

[3] Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, (2010). TCCS 16VR-10KN1 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Marek nhược độc.