Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-32:2019 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma gallisepticum ở gia cầm

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-32 : 2019

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 32: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH MYCOPLASMA GALLISEPTICUM Ở GIA CẦM

Vaccine testing procedure - Part 32: Mycoplasma gallisepticum Bacterin

Lời nói đầu

TCVN 8685-32 : 2019 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương 1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

- TCVN 8685-3.2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;

- TCVN 8685-4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-13 : 2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18 : 2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8685-20 : 2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21 : 2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22 : 2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

- TCVN 8685-23 : 2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella enteritidis ở gà;

- TCVN 8685-24 : 2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25 : 2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8685-26 : 2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27 : 2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-28 : 2019, Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng ở lợn;

- TCVN 8685-29 : 2019, Phần 29: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) ở gà;

- TCVN 8685-30 : 2019, Phần 30: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm não tủy truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-31 : 2019, Phần 31: Vắc xin phòng bệnh Dại ở chó;

- TCVN 8685-32 : 2019, Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma gallisepticum ở gia cầm;

- TCVN 8685-33 : 2019, Phần 33: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm.

 

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 32: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH MYCOPLASMA GALLISEPTICUM Ở GIA CẦM

Vaccine testing procedure - Part 32: Mycoplasma gallisepticum Bacterin

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt được sản xuất từ chủng vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum gây bệnh ở gia cầm.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684 : 2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.

3  Ký hiệu và chữ viết tắt

CFU : Colony Forming Unit

MLD : Minimum Lethal Dose

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu tính an toàn và tính hiệu lực được đánh giá trên các động vật thí nghiệm.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Gà 3 tuần tuổi đến 4 tuần tuổi, khỏe mạnh, không có kháng thể kháng Mycoplasma gallisepticum

5.2  Vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum cường độc chủng R

5.3  Nước muối sinh lý, đã được hấp tiệt trùng, nồng độ 0,9 %

5.4  Gà trống khỏe, đã trường thành, không có kháng thể kháng Mycoplasma gallisepticum

5.5  Kit phát hiện kháng thể Mycoplasma gallisepticum

5.6  Dung dịch natri citrat 5 %

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường cụ thể như sau

6.1  Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0.5 °C và 5 % đến 10 % CO₂

6.2  Tủ lạnh có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

6.3  Tủ lạnh sâu có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C

6.4  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm

6.5  Máy ly tâm ly tâm với gia tốc 3000 g

6.6  Nồi hấp có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15 min, 20 min

6.7  Cân điện tử có dải đo từ 0 g đến 200 g

6.8  Nồi đun cách thủy

6.9  Micropipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl

6.10  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl

6.11  Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tinh vô trùng

6.12  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U, V

6.13  Bình tam giác 100 ml, 200 ml vô trùng

6.14  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng

6.15  Bơm kim tiêm một lần 1 ml, 5 ml,10 ml

6.16  Ống ly tâm

6.17  Kính hiển vi

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu cảm quan khi lọ vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

Theo 4.1, 4.2 TCVN 8684 : 2011, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra vô trùng khi không có bất cứ tạp khuẩn hay nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

7.3  Kiểm tra thuần khiết

Kiểm tra độ thuần khiết của vắc xin bằng phương pháp Dien’s stain (xem phụ lục D).

Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra thuần khiết khi phương pháp Dien’s stain cho kết quả: chỉ có mặt duy nhất vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum.

7.4  Kiểm tra vô hoạt

Nhỏ một lượng vắc xin (khoảng 2 % thể tích môi trường) vào môi trường (A.1.1) và (A.1.2) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) từ 5 ngày đến 7 ngày.

Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra vô hoạt khi không xuất hiện vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum hay bất kỳ loại vi khuẩn nào khác trên các môi trường nuôi cấy.

7.5  Kiểm tra tính an toàn

7.5.1  Tiêm cho 10 gà (5.1), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường dưới da cổ.

7.5.2  Theo dõi gà (7.5.1) trong 21 ngày.

7.5.3  Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi tất cả gà (7.5.1) sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, chậm chạp, xù lông, kém ăn.

7.6  Kiểm tra hiệu lực

Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:

7.6.1  Phương pháp công cường độc trên gà

- Sử dụng 30 gà (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 20 gà, mỗi con tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường dưới da cổ.

+ Nhóm 2: gồm 10 gà làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.3) theo đường dưới da cổ với liều lượng như gà nhóm 1.

- Ba tuần sau khi tiêm, toàn bộ gà nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum cường độc (5.2).

- Theo dõi động vật thí nghiệm trong 14 ngày.

- Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi:

Ít nhất 80 % gà ở nhóm 2 có triệu chứng bệnh tích của bệnh Mycoplasma gallisepticum như: gà thở khò khè, chảy nước mũi, xoang mũi khí quản có nhiều dịch nhầy, túi khí đục có chấm trắng.

Và ít nhất 80 % gà ở nhóm 1 không có triệu chứng bệnh tích của bệnh Mycoplasma gallisepticum.

7.6.2  Phương pháp huyết thanh học

Sử dụng 30 gà (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 20 gà, mỗi con tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường dưới da cổ.

+ Nhóm 2: gồm 10 gà làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.3) với liều lượng và đường tiêm như gà nhóm 1.

- Ba tuần sau khi tiêm, toàn bộ gà nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu chất huyết thanh làm phản ứng huyết thanh học (phương pháp HI hoặc phương pháp ELISA) (xem phụ lục A, B, C).

- Đánh giá kết quả:

+ Phương pháp HI: Vắc xin đạt chỉ tiêu hiệu lực khi ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 1 có hiệu giá kháng thể ≥ 4 log₂ và ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 2 có hiệu giá kháng thể < 4 log₂ (xem phụ lục A,B).

+ Phương pháp ELISA: Vắc xin đạt chỉ tiêu hiệu lực khi ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 1 dương tính và ít nhất 80% mẫu huyết thanh của gà nhóm 2 âm tính (tham khảo phụ lục C).

8  Kết luận

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, vô trùng, thuần khiết, vô hoạt, an toàn và hiệu lực như đã nêu ở mục 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 và 7.6.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)

A.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

A.1.1  Môi trường Frey: Mycoplasma broth và Mycoplasma agar được chuẩn bị theo quy định

A.1.2  Mycoplasma broth được chia ra ống nghiệm

A.1.3  Mycoplasma agar được đổ ra đĩa thạch

A.1.4  Nước muối sinh lý 0,9 % được pha theo công thức sau

Natri clorua (NaCl) 9 g

Nước cất 1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min (6.6). Bảo quản ở tủ lạnh (6.2).

A.2  Chuẩn bị kháng nguyên

A.2.1  Cấy 0.5 ml vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum cường độc (5.2) vào môi trường Mycoplasma broth (A.1), ủ ở tủ ấm (6.1) từ 5 ngày đến 7 ngày.

A.2.2  Kiểm tra thuần khiết đảm bảo không có nấm và tạp khuẩn.

A.2.3  Kiểm tra độ pH đạt từ 5 - 6, nồng độ kháng nguyên khoảng 10⁹ CFU/ml

A.3  Chuẩn bị hồng cầu gà 1 %

A.3.1  Dùng bơm kim tiêm 1 lần (6.15) để hút 1 ml dung dịch chống đông (5.6) cho vào ống ly tâm (6.16), thêm 9 ml máu gà trống (5.4).

A.3.2  Ly tâm ống (A.3.1) bằng máy ly tâm (6.5) với gia tốc 300 g trong 15 min, gạn bỏ phần dung dịch nổi bên trên, thêm 10 ml nước muối sinh lý (5.3) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm lặp lại từ 3 lần đến 4 lần để rửa hồng cầu, dùng Micropipet (6 9) hút bỏ dung dịch ở trên sau lần ly tâm cuối.

A.3.3  Chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 1 % bằng cách dùng Micropipet (6.9) chuyển 1 ml hồng cầu (A.3.2) vào cốc có mỏ có chứa 99 ml nước muối sinh lý (5.3).

A.3.4  Bảo quản dung dịch hồng cầu 1 % (A.3.3) ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4 ngày đến 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ).

A.4  Cách tiến hành

A.4.1  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 50 μl nước muối sinh lý (5,3) vào đĩa nhựa 96 giếng chữ U (6.12) từ giếng thứ 1 đến giếng 12.

A.4.2  Dùng Micropipet (6.9) nhỏ 50 μl kháng nguyên MG (A.2.3) vào giếng 1.

A.4.3  Sử dụng Micropipet (6.10) trộn đều kháng nguyên với nước muối sinh lý (5.3) ở giếng 1, hút 50 μl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 50 μl chuyển sang giếng 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 rồi bỏ đi 50 μl.

A.4.4  Giếng 12 làm đối chứng hồng cầu: cho 50 μl nước muối sinh lý (5.3) và 50 μl hồng cầu gà 1 % (A.3.3).

A.4.5  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 50 μl hồng cầu gà 1 % (A.3.3) vào các giếng của đĩa phản ứng. A.4.6 Lắc nhẹ bằng tay và ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng 30 min, đọc kết quả.

A.5  Đọc kết quả

- Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn.

- Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm đều đáy giếng.

- Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

Bảng A.1 - Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)

Nguyên liệu	Giếng
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Nước muối sinh lý, μl	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
Kháng nguyên kiểm tra, μl	25	Trộn đều, chuyển 25 μl lần lượt từ giếng 1 đến giếng 11 rồi hút bỏ 25 μl										0
Hồng cầu gà 1 %, μl	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
Độ pha loãng kháng nguyên												-

 

Phụ lục B

(Quy định)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)

B.1  Chuẩn độ kháng nguyên 4 đơn vị HA

B1.1  Kháng nguyên được pha 4 đơn vị HA cần phải chuẩn để phản ứng HI cho kết quả chính xác. Ví dụ: HA bằng 1/256, 4 HA bằng 1/64 (Pha 4 HA: gồm 1 phần kháng nguyên và 63 phần nước muối sinh lý).

B1.2  Kiểm tra kháng nguyên 4 HA đã pha: tiến hành phản ứng HA (xem phụ lục A), nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên là kháng nguyên pha loãng.

B.2  Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra

Lấy máu động vật (7.6.2.1), chắt lấy huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi đun cách thủy (6.8) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

B.3  Cách tiến hành

B.3.1  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl nước muối sinh lý (5.3) vào đĩa nhựa 96 giếng chữ V (6.12).

B.3.2  Dùng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl huyết thanh cần kiểm tra (B.2) vào giếng 1.

B.3.3  Pha loãng huyết thanh: sử dụng Micropipet (6.10) trộn đều huyết thanh với nước muối sinh lý ở giếng 1, rồi hút 25 μl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 μl chuyển sang giếng 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 rồi bỏ đi 25 μl.

B.3.4  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl dung dịch kháng nguyên 4 HA vào các giếng từ 1 đến 11. Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng.

B.3.5  Giếng 12 làm đối chứng hồng cầu: 50 μl nước muối sinh lý (5.2) và 50 μl hồng cầu gà 1 % (A.3.3).

B.3.6  Sử dụng Micropipet (6.10) nhỏ 25 μl hồng cầu gà 1 % (A.3.3) vào các giếng của đĩa phản ứng. B.2.7 Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. ù đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng 30 min, đọc kết quả.

B.3  Đọc kết quả

- Phản ứng âm tính: có hạt ngưng kết lấm tấm.

- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng xuống đáy tạo chấm tròn.

Bảng B.1 - Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)

Các bước	Nguyên liệu	Giếng
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Pha loãng huyết thanh	Nước muối sinh lý, μl	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
	Huyết thanh kiểm tra	25	Chuyển 25 μl từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều, chuyển tiếp tục đến giếng 11 rồi hút bỏ 25 μl										0
Cho kháng nguyên	Kháng nguyên 4 HA, μl	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	0
Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng
	Hồng cầu gà 1 %, μl	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
	Độ pha loãng kháng thể												-

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

C.1  Vật liệu thử

- Huyết thanh gà cần kiểm tra

- Nước cất 2 lần

- Kit ELISA phát hiện kháng thể Mycoplasma gallisepticum

VÍ DỤ: Dùng Kit ELISA của hãng IDEXX ( Mycoplasma gallisepticum Antibody Test Kit ,)[1].

C.2  Cách tiến hành

C.2.1  Pha loãng huyết thanh bằng dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1/500.

C.2.2  Cho 100 μl đối chứng dương vào giếng A1 và A2 của đĩa có phủ kháng nguyên Mycoplasma gallisepticum.

C.2.3  Cho 100 μl đối chứng âm vào giếng B1 và B2 của đĩa có phủ kháng nguyên Mycoplasma gallisepticum.

C.2.4  Cho huyết thanh đã pha loãng (A.2.1) vào các giếng còn lại (từ giếng A5 đến giếng H12) của đĩa có phủ kháng nguyên Mycoplasma gallisepticum.

C.2.5  Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

C.2.6  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của đĩa bằng nước cất 2 lần, mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

C.2.7  Cho Conjugate Solution vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

C.2.8  Loại bỏ dung dịch trong đĩa, rửa các giếng của dĩa bằng nước cất 2 lần, mỗi giếng 350 μl nước cất, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vỗ đĩa vào giấy thẩm cho khô nước.

C.2.9  Cho TMB substrate vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min (nhiệt độ từ 18 °C đến 25 °C).

C.2.10  Cho Stop Solution vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, mỗi giếng 100 μl, sau đó đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.7) ở bước sóng 650 nm để ra các giá trị Optical Density (OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

Bảng C.1 - Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NC

NC

S7

S7

S15

S15

S23

S23

S31

S31

S39

S39

B

PC

PC

S8

S8

S16

S16

S24

S24

S32

S32

S40

S40

C

S1

S1

S9

S9

S17

S17

S25

S25

S33

S33

S41

S41

D

S2

S2

S10

S10

S18

S18

S26

S26

S34

S34

S42

S42

E

S3

S3

S11

S11

S19

S19

S27

S27

S35

S35

S43

S43

F

S4

S4

S12

S12

S20

S20

S28

S28

S36

S36

S44

S44

G

S5

S5

S13

S13

S21

S21

S29

S29

S37

S37

S45

S45

H

S6

S6

S14

S14

S22

S22

S30

S30

S38

S38

S46

S46

CHÚ THÍCH:

NC (negative control): đối chứng âm;

PC (positive control): đối chứng dương;

S (sample): mẫu.

C.3  Công thức tính kết quả

- Đối chứng dương trung bình (PCx) =

- Đối chứng âm trung bình (NCx) =

- Giá trị S/P =

- Hiệu giá S/P (ở độ pha loãng 1 : 500): log₁₀ Titer = 1,09 (log₁₀S/P) + 3,36

C.4  Điều kiện kết quả

Giá trị OD của đối chứng đạt điều kiện như sau thì phản ứng đạt

- OD đối chứng dương - OD đối chứng âm > 0,075 (PCx - NCx > 0,075)

- OD đối chứng âm < 0,150 (NCx ≤ 0,150)

C.5  Diễn giải kết quả

- Giá trị S/P < 0,50 mẫu kiểm tra âm tính (S/P < 0,50 : N)

- Giá trị S/P > 0,50 mẫu kiểm tra dương tính (S/P > 0,50 : P).

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp nhuộm Dien’s stain

D.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

D.1.1  Môi trường Diene

D. 1.1.1  Xanh methylen 2,5 mg

D.1.1.2  Azure 1,25 mg

D. 1.1.3  Maltose 10 mg

D. 1.1.4  Natri cacbonat (Na2CO3) 0,25 mg

Nước cất 1000ml

Dung dịch xử lý vết bẩn của Diene được chuẩn bị bằng cách pha loãng một phần dung dịch gốc 1 : 3 với nước cất.

D.1.2  Ethanol 95 %

D.2  Cách tiến hành

D.2.1  Làm ngập môi trường chứa thạch Mycoplasma gallisepticum trong 1 ml Diene (D.1.1)

D.2.2  Rửa ngay lập tức bề mặt thạch bằng nước cất

D.2.3  Làm mất màu môi trường bằng cách thêm 1 ml ethanol 95 % (D.1.2) trong 1 min và rửa bằng nước cất.

D.2.4  Rửa sạch môi trường bằng nước cất và để khô.

D.2.5  Quan sát dưới kính hiển vi (6.17).

D.3  Đọc kết quả:

Mycoplasma gallisepticum với hình thái khuẩn lạc hình trứng, trung tâm bắt màu xanh đậm và ngoại vi màu xanh nhạt.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCCS 17VT- 2015/KNI : Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Mycolasma Gallisepticum

[2] ASEAN Standards for Animal Vaccine: Asean standard Requirements for Mycolasma Gallisepticum Bacterin.

[3] OIE Terrestrial Manual 2008- Chapter 2.3.5 Avian Mycoplasmosis.