Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-28:2019 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở lợn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-28 : 2019

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 28: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở LỢN

Vaccine testing procedure - Part 28: Swine Pasteurella Multocida Bacterin

Lời nói đầu

TCVN 8685-28 : 2019 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương 1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

- TCVN 8685-3 : 2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;

- TCVN 8685 4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-13 : 2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18 : 2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8685-20 : 2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21 : 2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22 : 2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

- TCVN 8685-23 : 2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella enteritidis ở gà;

- TCVN 8685-24 : 2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

-TCVN 8685-25 : 2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8685-26 : 2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27 : 2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-28 : 2019, Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng ở lợn;

- TCVN 8685-29 : 2019, Phần 29: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) ở gà;

- TCVN 8685-30 : 2019, Phần 30: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm não tủy truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-31 : 2019, Phần 31: Vắc xin phòng bệnh Dại ở chó;

- TCVN 8685-32 : 2019, Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma gallisepticum ở gia cầm;

- TCVN 8685-33 : 2019, Phần 33: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm.

 

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 28: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở LỢN

Vaccine testing procedure - Part 28: Swine Pasteurella Multocida Bacterin

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt được sản xuất từ chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phòng bệnh tụ huyết trùng ở lợn.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684 : 2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.

3  Ký hiệu và chữ viết tắt

CFU : Colony Forming Unit

MLD : Minimum Lethal Dose

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu tính an toàn và tính hiệu lực được đánh giá trên các động vật thí nghiệm.

5  Vật liệu và thuốc thử

5.1  Lợn từ 2 tháng tuổi đến 3 tháng tuổi, khỏe mạnh không có kháng thể kháng Pasteurella multocida

5.2  Thỏ từ 1,8 kg đến 2,0 kg, khỏe mạnh không có kháng thể kháng Pasteurella multocida

5.3  Chuột bạch từ 18 g đến 22 g, khỏe mạnh không có kháng thể kháng Pasteurella multocida

5.4  Vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc, serotype B

5.5  Nước muối sinh lý, đã được hấp tiệt trùng, nồng độ 0,9 %

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường cụ thể như sau:

6.1  Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C

6.2  Tủ lạnh có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

6.3  Tủ lạnh sâu có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C

6.4  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm

6.5  Máy ly tâm ly tâm với gia tốc 3000 g

6.6  Nồi hấp có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15 min, 20 min

6.7  Cân điện tử có dải đo từ 0 g đến 200 g

6.8  Nồi đun cách thủy

6.9  Micropipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl

6.10  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl

6.11  Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tinh vô trùng

6.12  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U

6.13  Bình tam giác 100 ml, 200 ml vô trùng

6.14  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng

6.15  Bơm kim tiêm một lần 1 ml, 5 ml,10 ml

6.16  Phiến kính

6.17  Kính hiển vi

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu cảm quan khi lọ vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

Theo 4.1, 4.2 TCVN 8684 : 2011, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra vô trùng khi không có bất cứ tạp khuẩn hay nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

7.3  Kiểm tra thuần khiết

Kiểm tra độ thuần khiết của vắc xin bằng phương pháp nhuộm Gram (xem phụ lục C).

Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra thuần khiết khi nhuộm Gram cho kết quả: chỉ có mặt duy nhất vi khuẩn Pasteurella multocida.

7.4  Kiểm tra vô hoạt

Nhỏ một lượng vắc xin (khoảng 2 % thể tích môi trường) vào môi trường (A.1.1) và (A.1.2) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h đến 48 h.

Vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra vô hoạt khi không xuất hiện vi khuẩn Pasteurella multocida hay bất kỳ loại vi khuẩn nào khác trên các môi trường nuôi cấy.

7.5  Kiểm tra tính an toàn

7.5.1  Kiểm tra tính an toàn trên lợn

7.5.1.1  Tiêm bắp cho 03 lợn (5.1), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn.

7.5.1.2  Theo dõi lợn (7.5.1.1) trong 14 ngày.

7.5.1.3  Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi tất cả lợn (7.5.1.1) sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, lợn mệt mỏi, sốt, bỏ ăn.

7.5.2  Kiểm tra tính an toàn trên thỏ

7.5.2.1  Tiêm dưới da cho 02 thỏ (5.2), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn.

7.5.2.2  Theo dõi thỏ (7.5.2.1) trong 14 ngày.

7.5.2.3  Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi tất cả thỏ (7.5.2.1) sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, thỏ chậm chạp, lông xù, chán ăn.

7.5.3  Kiểm tra tính an toàn trên chuột bạch

7.5.3.1  Tiêm dưới da cho 10 chuột bạch (5.3), mỗi con 0,5 ml vắc xin.

7.5.3.2  Theo dõi chuột bạch (7.5.3.1) trong 14 ngày.

7.5.3.3  Đánh giá kết quả: vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi tất cả chuột bạch (7.5.3.1) sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, mệt mỏi, lông xù, kém ăn.

7.6  Kiểm tra hiệu lực

Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:

7.6.1  Phương pháp công cường độc

7.6.1.1  Phương pháp công cường độc trên lợn

- Sử dụng 08 lợn (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 lợn, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường bắp thịt.

+ Nhóm 2: gồm 03 lợn làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.5) với liều lượng và đường tiêm như lợn nhóm 1.

- Ba tun sau khi tiêm, toàn bộ lợn nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc (5.4) mỗi con 1 MLD theo đường tiêm bắp.

- Theo dõi toàn bộ lợn thí nghiệm trong 7 ngày đến 10 ngày.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi:

+ Lợn nhóm 2 chết hết, lợn nhóm 1 sống ≥ 3 con;

+ Hoặc lợn nhóm 2 chết ≥ 2 con, lợn nhóm 1 sống 5 con.

7.6.1.2  Phương pháp công cường độc trên thỏ

- Sử dụng 06 thỏ (5.2), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 04 thỏ, mỗi con được tiêm 2/5 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường dưới da cổ.

+ Nhóm 2: gồm 02 thỏ làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.5) với liều lượng và đường tiêm như thỏ nhóm 1.

- Ba tuần sau khi tiêm, toàn bộ thỏ nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc (5.4) mỗi con 1 MLD theo đường tiêm dưới da.

- Theo dõi toàn bộ thỏ thí nghiệm trong 7 ngày đến 10 ngày.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi thỏ nhóm 2 chết 100 %, thỏ nhóm 1 sống ít nhất 50 %.

7.6.1.3  Phương pháp công cường độc trên chuột bạch

- Sử dụng 100 chuột bạch (5.3), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 50 chuột bạch, mỗi con được tiêm 0,2 ml liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường phúc xoang;

+ Nhóm 2: gồm 50 chuột bạch dùng làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.5) với liều lượng và đường tiêm như chuột bạch nhóm 1.

- Ba tuần sau khi tiêm tất cả chuột bạch ở nhóm 1 và nhóm 2 được chia thành 10 nhóm mỗi nhóm 5 chuột bạch được thử thách với 0,1 ml vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc (5.4) có độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-10.Theo dõi toàn bộ chuột bạch thí nghiệm trong 7 ngày.

- Tính LD₅₀ ở mỗi nhóm theo phương pháp Reed - Muench (xem phụ lục B).

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi LD₅₀ ở nhóm 1 > LD₅₀ ở nhóm 2 ít nhất 10².

7.6.2  Phương pháp huyết thanh học

Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau

7.6.2.1  Đánh giá hiệu giá kháng thể trên lợn bằng phản ứng ngưng kết chậm

Sử dụng 08 lợn (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 lợn, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường bắp thịt.

+ Nhóm 2: gồm 03 lợn làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.5) với liều lượng và đường tiêm như lợn nhóm 1.

- Ba tuần sau khi tiêm, toàn bộ lợn nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu thu huyết thanh làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục A).

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của lợn nhóm 1 có hiệu giá kháng thể ≥ 4 log₂ và 100 % huyết thanh của lợn nhóm 2 có hiệu giá kháng thể < 4 log₂.

7.6.2.2  Đánh giá hiệu giá kháng thể trên thỏ bằng phản ứng ngưng kết chậm

- Sử dụng 06 thỏ (5.2), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 04 thỏ, mỗi con được tiêm 2/5 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường dưới da cổ.

+ Nhóm 2: gồm 02 thỏ làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý (5.5) với liều lượng và đường tiêm như thỏ nhóm 1.

- Ba tuần sau khi tiêm, toàn bộ thỏ nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu thu huyết thanh làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục A)

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi ít nhất 80% mẫu huyết thanh của thỏ nhóm 1 có hiệu giá kháng thể ≥ 4 log₂ và 100 % huyết thanh của thỏ nhóm 2 có hiệu giá kháng thể < 4 log₂.

8  Kết luận

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, vô trùng, thuần khiết, vô hoạt, an toàn và hiệu lực như đã nêu ở mục 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 và 7.6.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Kiểm tra hiệu giá kháng thể Pasteurella multocida bằng phản ứng ngưng kết chậm

A.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

A.1.1  Blood Agar Base (BAB), được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau đó đem hấp vô trùng ở nồi hấp (6.6), để nguội đến 45 °C bổ sung 5 - 8 % máu thỏ vô trùng vào thạch BAB và đồ ra đĩa lồng (6.11).

A.1.2  Canh thang Brain heart infusion (BHI) được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất chia 4 ml/ ống, đem hấp vô trùng (6.6).

A.1.3  Acid Chlohydric 1N (HCl 1N).

A.1.4  Sodium hydroxide 1N (NaOH 1N).

A.1.5  Formaldehyde solution 37 % (HCHO 37 %).

A.1.6 Dung dịch PBS được pha theo công thức sau:

Natri clorua (NaCl)	8 g
Kali clorua (KCl)	2 g
Natri hidro photphat (Na2HPO4)	1,15 g
Mono kali photphat (KH2PO4)	0,2 g
Nước cất	1000ml

Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min ở nồi hấp (6.6). Bảo quản ở tủ lạnh (6.2).

A.1.7  Nước muối sinh lý 0,9 % được pha theo công thức sau:

Natri clorua (NaCl) 9 g

Nước cất 1000 ml

Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min ở nồi hấp (6.7). Bảo quản ở tủ lạnh (6.2).

A.2  Chuẩn bị kháng nguyên thân (Kháng nguyên O - Somatic antigen - Kháng nguyên xử lý acid HCl 1N).

A.2.1  Ria cấy 0,01 ml vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc (5.4) vào môi trường thạch máu thỏ (A.1.1), ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h.

A.2.2  Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch máu thỏ (A.2.1) cấy vào môi trường canh thang BHl (A.1.2), rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h.

A.2.3  Láng 4 ml canh trùng (A.2.2) lên 2 đĩa thạch máu thỏ (A.1.1) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h.

A.2.4  Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch máu thỏ (A.2.3) bằng cách dùng 5 ml PBS (A. 1.8) rửa bề mặt hai dĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm.

A.2.5  Nhỏ 0,02 ml dung dịch Formaldehyde 37 % (A.1.5) vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn bằng cách ria trên thạch máu thỏ (A. 1.1) ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h.

A.2.6  Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt chỉ tiêu vô trùng (không có vi khuẩn mọc trên đĩa thạch) sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm (6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4 °C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 20 ml HCl 1N (A.1.3), lắc đều rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 24 h.

A.2.7  Sau đó tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.6) bằng máy ly tâm (6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4 °C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS (A. 1.6) có bổ sung 0,3 % dung dịch Formaldehyde 37 % (A. 1.5).

A.2.8  Lặp lại bước (A.2.7) 2 lần.

A.2.9  Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.8) bằng máy ly tâm (6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4 °C, cặn thu được sẽ được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS (A. 1.6) để thu hoạch kháng nguyên.

A.2.10  Kiểm tra kháng nguyên (A.2.9) xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên lắng tròn nhỏ đáy giếng.

A.3  Chuẩn bị huyết thanh

A.3.1  Huyết thanh thí nghiệm

Lấy máu động vật (7.6.2), chắt lấy huyết thanh, sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy (6.8) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

A.3.2  Huyết thanh tối miễn dịch

A.3.2.1  Từ canh trùng (A.2.4) pha thành canh trùng có mật độ 2 tỷ CFU/ml.

A.3.2.2  Tiêm 2 ml canh trùng (A.3.2.1) vào dưới da cho thỏ (5.4).

A.3.2.3  Sau 7 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.2) 0.2 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.4  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.3) 0.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.5  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.4) 1 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.6  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.5) 1.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.7  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.6) 2 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.8  Sau 3 ngày 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.7) 2.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.9  Sau 3 ngày 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.8) 3 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.10  Sau 3 ngày 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.9) 3.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.11  Sau 3 ngày 4 ngày tiêm tiếp cho thỏ (A.3.2.10) 4 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.12  Sau 1 tuần tiêm mũi cuối cùng tiến hành lấy máu thỏ thu hoạch huyết thanh tối miễn dịch.

A.3.3  Cách pha canh trùng 2 tỷ

A.3.3.1 Sử dụng 7 ống nghiệm vô trùng (6.11), đánh số từ 1 đến 7, cho vào mỗi ống 9 ml nước muối sinh lý vô trùng (A.1.5).

A.3.3 2  Cho 1 ml canh trùng đếm số vào ống thứ 1 trộn đều chuyển 1ml sang ống thứ 2 cứ như vậy đến ống thứ 7 (pha loãng 1/10).

A.3.3.3  Hút 0,01 ml ở ống thứ 7 nhỏ lên đĩa thạch BAB (A.1.1) rồi ria đều (mỗi nồng độ 2 đĩa), để ở tủ ấm (6.1).

A.3.3.4  Hút 0,01 ml ở ống thứ 6 nhỏ lên đĩa thạch BAB (A.1.1) rồi ria đều (mỗi nồng độ 2 đĩa), để ở tủ ấm (6.1)

A.3.3.5  Sau 18 h đến 20 h, đọc kết quả: đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa.

Cách tính kết quả

Số lượng vi khuẩn (N) trong 1 ml được tính theo công thức sau:

Trong đó: C: Là số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa có nồng độ liền nhau.

V: Thể tích cấy ở mỗi đĩa.

n1: Số đĩa của độ pha loãng ban đầu 10^-7 (2 đĩa)

n2: Số đĩa của độ pha loãng tiếp theo 10^-6 (2 dĩa)

d: Độ pha loãng ban đầu (nhân nghịch đảo): 10 ⁶

Pha canh trùng 2 tỷ:

Canh trùng 2 × 10⁹ CFU/ml = 1 ml canh trùng (A.2.4) + (N/2*10⁹ - 1) ml NaCl.

A.4  Cách tiến hành

Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm thực hiện trên đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U (6.12).

- Bố trí thí nghiệm.

+ Giếng thí nghiệm: A1 đến H8.

+ Giếng đối chứng âm: A9 đến H10.

+ Giếng đối chứng dương: A11 đến H12.

Bảng A.1 - Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên.

- Đối với các giếng thí nghiệm:

+ Cho 50 μl dung dịch PBS (A.1.4) vào mỗi giếng thí nghiệm (A1 đến H8).

+ Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết thanh (A.3.1) và pha loãng theo cơ số 2 bằng cách chộn đều rồi chuyển 50 μl sang giếng thứ 2, cứ như vậy đến giếng số 8 trộn đều rồi hút bỏ đi 50 μl.

+ Nhỏ 50 μl kháng nguyên (A.2.7) vào các giếng,

- Đối với các giếng đối chứng:

+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS (A.1.4) + 50 μl kháng nguyên (A.2.7).

+ Đối chứng dương: 50 μl huyết thanh tối miễn dịch (A.3.2.12) + 50 μl kháng nguyên (A.2.7).

- Lắc nhẹ cho đều rồi đậy nắp để ở tủ ấm (6.1) qua đêm.

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: kháng nguyên lắng tròn đáy giếng.

+ Phản ứng dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm đều dưới đáy giếng.

+ Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Công thức tính LD₅₀ theo phương pháp Reed-Muench

Trong đó:

A: Độ pha loãng của giống gây chết chuột ngay sát dưới 50 %

a: % chuột chết ngay sát dưới 50 %

b: % chuột chết ngay sát trên 50 %

k: log bậc pha loãng

 

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

C.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

C.1.1  Dung dịch tím genxian

C.1.2  Dung dịch lugol

C.1.3  Dung dịch axeton

C. 1.4  Dung dịch fucsin

C.2  Chuẩn bị tiêu bản

Nhỏ một giọt vắc xin lên phiến kính (6.16) rồi dàn mỏng sau đó để tự khô ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.

C.3  Cách tiến hành

C.3.1  Nhỏ dung dịch tím genxian (C. 1.1) lên tiêu bản 1 - 2 min

C.3.2  Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

C.3.3  Nhỏ dung dịch lugol (C.1.2) để 1 min

C.3.4  Lặp lại bước 2

C.3.5  Nhỏ cồn axeton (C.1.3) từ đầu phiến kính, nghiêng phiến kính cho cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn.

C.3.6  Lặp lại bước 2

C.3.7 Nhỏ dung dịch fucsin (C1.4) để 1 min

C.3.8 Lặp lại bước 2

C.3.9 Thấm khô - Xem dưới kính hiển vi (6.17).

C.4  Đọc kết quả: Vi khuẩn bắt màu hồng (Gram âm), có dạng cầu trực khuẩn, không sinh nha bào.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCCS 02VT- 92/KNI : Quy trình kiểm tra vắc xin Tụ huyết trùng lợn

[2] ASEAN Standards for Animal Vaccine : Asean standard Requirements for Swine Pastuerella Multocida Bacterin.

[3] OIE Terrestrial Manual 2008- Chapter 2.4.12-.Haemorrhagic septicaemia.