Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-57:2024 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 57: Bệnh Glasser ở lợn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-57:2024

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 57: BỆNH GLASSER Ở LỢN

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 57: Glasser disease in pig

Lời nói đầu

TCVN 8400-57:2024 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật- Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8400-1:2019, Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2:2010, Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3:2010, Phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4:2010, Phần 4: Bệnh Niu cát xơn;

- TCVN 8400-5:2011, Phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6:2011, Phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7:2011, Phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8:2011, Phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9:2011, Phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10:2022, Phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11:2019, Phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12:2011, Phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13:2019, Phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-15:2019, Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16:2011, Phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli;

- TCVN 8400-17:2011, Phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18:2014, Phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19:2014, Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20:2014, Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21:2014, Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22:2014, Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23:2014, Phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24:2014, Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25:2014, Phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26:2014, Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27:2014, Phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28:2014, Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29:2015, Phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30:2015, Phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-32:2015, Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33:2015, Phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34:2015, Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35:2015, Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36:2015, Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo vi rút typ 2;

- TCVN 8400-37:2015, Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38:2015, Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona vi rút;

- TCVN 8400-39:2016, Phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mạn tính ở gà;

- TCVN 8400-40:2016, Phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;

TCVN 8400-41:2019, Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

TCVN 8400-42:2019, Phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

TCVN 8400-43:2019, Phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

TCVN 8400-44:2019, Phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

TCVN 8400-45:2019, Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

TCVN 8400-46:2019, Phần 46: Bệnh dại;

TCVN 8400-47:2019, Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

TCVN 8400-48:2020, Phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

TCVN 8400-49:2020, Phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

TCVN 8400-50:2020, Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

TCVN 8400-51:2020, Phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

TCVN 8400-52:2022, Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc;

TCVN 8400-53:2022, Phần 53: Bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale ở gà;

TCVN 8400-54:2022, Phần 54: Bệnh tỵ thư ở gia súc;

TCVN 8400-55:2022, Phần 55: Bệnh u nhày ở thỏ;

TCVN 8400-56:2023, Phần 56: Bệnh tụ huyết trùng ở lợn, trâu, bò, gia cầm;

TCVN 8400-57:2024, Phần 57: Bệnh Glasser ở lợn.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 57: BỆNH GLASSER Ở LỢN

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 57: Glasser disease in pig

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Glasser ở lợn do vi khuẩn Glaesserella parasuis gây ra.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8128:2015 Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

TCVN 8402:2010. Bệnh động vật-Quy trình mổ khám.

3  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1.1

Bệnh Glasser ở lợn

Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Glaesserella parasuis gây ra ở mọi lứa tuổi của lợn nhưng phổ biến từ 3 tuần đến 16 tuần tuổi. Đặc trưng của bệnh là viêm màng thanh dịch, viêm đa khớp, viêm phổi, viêm não.

Từ năm 2020, vi khuẩn gây bệnh Glasser ở lợn được gọi tên là Glasserella parasuis (Tên trước đây là Haemophilus parasuis).

3.1.2

Glaesserella parasuis (G. parasuis)

Vi khuẩn G. parasuis thuộc chi Haemophilus, họ Pasteurellaceae, gram âm, thường đứng đơn lẻ, không di động, không hình thành nha bào, đa hình thái, hiếu khí, chiều rộng có kích thước nhỏ hơn 1 μm và chiều dài có kích thước từ 1 μm đến 3 μm.

CHÚ THÍCH: Vi khuẩn G. parasuis có thể được tìm thấy ở đường hô hấp trên của lợn và có nhiều typ huyết thanh. Hiện nay xác định được vi khuẩn G. parasuis có trên 21 typ huyết thanh, trong đó phổ biến là 15 typ huyết thanh (từ 1 đến 15) và typ huyết thanh 1, 5, 10,12, 13, 14 được xác định là có độc lực cao và gây chết lợn nhanh.

Vi khuẩn phát triển cần yếu tổ NAD (Nicotiamide Adenine Dinucleotide), không gây dung huyết. Điều kiện môi trường thích hợp để vi khuẩn phát triển là ở nhiệt độ 37 °C, pH 7,4 và có 5 % CO₂.

3.2  Các từ viết tắt

- ADN	Acid Deoxyribonucleic	Axit Deoxyribonucleic
- CFU	Colony Forming Unit	Đơn vị hình thành khuẩn lạc
- EDTA	Ethylene Diamin Tetraacetic Acid	Axit Ethylene Diamin Tetraacetic
- Ct	Cycle threshold	Ngưỡng chu kỳ, là thời điểm máy đọc Realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền
- G. parasuis	Glaesserella parasuis	Vi khuẩn Glaesserella parasuis
- PCR	Polymerase Chain Reaction	Phản ứng chuỗi trùng hợp
- mPCR	Multiμlex Polymerase Chain Reaction	Phản ứng chuỗi trùng đa hợp
- NAD	Nicotiamide Adenine Dinucleotide
- TAE	Tris - Acetate - Ethylenediaminetetraacetic acid	Axit Tris - Axetate - Ethylenediaminetetraaxetic
- TBE	Tris - Borate - Ethylenediaminetetraacetic acid	Axit Tris - Borate - Ethylenediaminetetraaxetic
- TE	Tris - Ethylendiamintetraacetic acid	Axit Tris - Ethylendiamintetraaxetic

4  Thuốc thử, vật liệu thử và môi trường nuôi cấy

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ các trường hợp có quy định khác.

4.1  Bộ thuốc nhuộm Gram (Xem Phụ lục A.1)

4.2  Môi trường thạch máu (Xem Phụ lục B.1)

4.3  Máu, là máu cừu hoặc máu bê hoặc máu thỏ, vô trùng.

4.4  Môi trường thạch sô-cô-la (Xem Phụ lục B.2)

4.5  Huyết thanh, là huyết thanh bê hoặc huyết thanh ngựa, vô trùng

4.6  NAD 1 %, là NAD được pha trong nước thành dung dịch 1 %, sau đó được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm để đảm bảo vô trùng.

4.7  Chất chiết nấm men (Yeast extract) 25%

4.8  Thuốc thử hydro peroxide (H₂O₂) 3 %

4.9  Thuốc thử oxidase hoặc giấy lọc tẩm 1 % tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride

4.10  Dung dịch urê 40 %, cân 4 g urê rồi hòa tan vào 100 ml nước cất thành dung dịch 40 %, sau đó được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm để đảm bảo vô trùng.

4.11  Nước muối sinh lý, là dung dịch NaCI 0,9 %, vô trùng.

4.12  Môi trường Amies hoặc Stuart, là môi trường vận chuyển và bảo quản mẫu.

4.13  Các môi trường xác định các đặc tính sinh hóa (Xem Phụ lục C)

4.14  Nguyên liệu cho PCR (Xem Phụ lục D)

4.15  Nguyên liệu cho Realtime PCR (Xem Phụ lục E)

4.16  Vi khuẩn Staphylococcus aureus, là tụ cầu Gram dương, hiếu khí, phần lớn các chủng vi khuẩn này gây dung huyết rõ trên thạch máu.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

5.1  Tủ ấm, duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C và có bổ sung từ 5 % đến 10 % CO_2.

5.2  Kính hiển vi, có vật kính với độ phóng đại 10 lần, 40 lần, 100 lần.

5.3  Nồi hấp, có thể duy trì ở nhiệt độ 110 °C, 121 °C.

5.4  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 1 500 g, 6 000 g, 12 000 g.

5.5  Máy Realtime PCR

5.6  Máy PCR

5.7  Bộ điện di, gồm bộ nguồn điện di, bể điện di, khay điện di.

5.8  Máy đọc gel

5.9  Panh, kéo, vô trùng.

5.10  Cân phân tích, có độ chính xác từ 0,001g.

5.11  Bơm và kim tiêm, có dung tích 5 ml, 10 ml, vô trùng.

5.12  Micropipet và đầu tip các loại, 100 μl, 200 μl, 1000 μl

5.13  Ống nghiệm, có dung tích từ 10 ml đến 15 ml, sạch và vô trùng.

5.14  Đĩa petri (hộp lồng), có đường kính từ 90 mm đến 100 mm, sạch và vô trùng.

5.15  Que cấy.

5.16  Bông cồn, bông cot-ton đã được tẩm cồn 70 %

5.17  Tăm bông, vô trùng.

5.18  Phiến kính, sạch.

5.19  Đèn cồn hoặc thiết bị để vô trùng que cấy như đèn khí ga, đèn đốt bunsen

5.20  Cối chày sứ nghiền mẫu, vô trùng. Có thể sử dụng máy nghiền mẫu hoặc máy dập mẫu để thay thế cối chày sứ.

5.21  Ống ly tâm (hay ống eppendori), có dung tích 0,2 ml, 1,5 ml, vô trùng.

5.22  Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

5.23  Buồng cấy an toàn sinh học cấp II

5.24  Lọ hoặc túi nilon, sạch và không bị rò rỉ.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh Glasser là bệnh truyền nhiễm ở lợn, không lây sang người, do vi khuẩn G. parasuis gây ra.

- Lợn mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng mắc phổ biến từ 3 tuần đến 16 tuần tuổi;

- Bệnh Glasser thường xảy ra khi lợn có những thay đổi hoặc stress như: miễn dịch chủ động giảm (kháng thể từ mẹ sang con), chế độ dinh dưỡng, quản lý nuôi nhốt chung các lứa tuổi lợn khác nhau, thời tiết thay đổi (nhiệt độ, độ ẩm), ...

- Bệnh lây trực tiếp từ lợn ốm hoặc lợn mang trùng sang lợn khỏe qua tiếp xúc, qua đường hô hấp,...

- Lợn mắc bệnh ở thể cấp tính thường chết sau 2 ngày đến 5 ngày có biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ chết có thể lên tới 40%; ở thể mạn tính tỷ lệ mắc từ 10 % đến 15 %.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng lâm sàng của bệnh có thể thấy ở 2 thể sau:

- Thể cấp tính:

Lợn có triệu chứng của viêm phổi: sốt cao từ 40 °C đến 41 °C, khó thở, thở nhanh và có ho.

Lợn bị sưng khớp, đi lại khó khăn.

Ngoài ra còn có các triệu chứng rối loạn thần kinh do viêm não.

- Thể mạn tính:

Là những lợn sống sót sau thể cấp tính của bệnh.

Lợn còi cọc, chậm lớn, lông dựng, đi lại khó khăn, thường ho, thở khó sau khi vận động.

Trường hợp viêm ngoại tâm mạc kéo dài có thể gây chết lợn đột ngột.

6.3  Bệnh tích

- Thể cấp tính:

Trên da có những đám màu xanh hoặc hồng trên da, đặc biệt là da tai. Tổ chức liên kết dưới da phù thũng.

Xoang ngực, xoang bụng, xoang bao tim tích nước vàng

Màng phổi có viêm thanh dịch và viêm tơ huyết. Đây là bệnh tích phổ biến thường gặp của bệnh. Màng ngoài tim (ngoại tâm mạc) viêm tơ huyết.

Các khớp bị viêm sưng to, đặc biệt là khớp cổ chân,

Não có thể có viêm màng não, có dịch màu vàng, viêm tơ huyết.

- Thể mạn tính:

Màng ngoài tim viêm tơ huyết. Tim, phổi, gan to hơn bình thường, phổi thủy thũng, xoang bụng chứa nhiều dịch.

6.4  Chẩn đoán phân biệt

- Bệnh viêm phổi địa phương:

Do vi khuẩn Mycoμlasma hyopneumoniae gây ra. Lợn không sốt cao (dưới 40 °C). Lợn ho khan, ho kéo dài, ho giật từng cơn, ngồi như chó ngồi cho dễ thở. Phổi viêm có tính chất đối xứng, có giới hạn rõ rệt giữa vùng phổi viêm và phổi lành. Phổi viêm từ thùy tim sang thủy đỉnh ở phía trước và thùy hoành ở phía sau. Khớp không viêm, không sưng.

- Bệnh viêm phổi màng phổi:

Do vi khuẩn Actinobacillus μleuropneumoniae gây ra. Lợn sốt cao (40,5 °C - 41 °C). Lợn ít ho. Màng phổi viêm có nhiều sợi tơ huyết (fibrin), có thể viêm dính vào phần sườn. Phổi viêm thành từng mảng, có tính chất đối xứng và có ranh giới rõ ràng. Khớp không viêm, không sưng.

- Bệnh tụ huyết trùng:

Do vi khuẩn Pasteurella multocida gây nên. Ở thể cấp tính lợn sốt cao (lên tới 42 °C). Phổi viêm, có tụ huyết, xuất huyết, có nhiều tổ chức bị gan hóa. Khớp không viêm, không sưng

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Động vật nghi mắc bệnh còn sống lấy mẫu là dịch tiết đường hô hấp.

- Lấy mẫu dịch tiết đường hô hấp: Dùng tăm bông (5.17) ngoáy lấy dịch mũi hoặc dịch hầu họng, cho tăm bông vào ống nghiệm (5.13) có chứa dung dịch muối sinh lý (4.11) hoặc ống nghiệm có môi trường vận chuyển và bảo quản mẫu (4.12).

Trường hợp mổ khám động vật nghi mắc bệnh để kiểm tra bệnh tích, lấy mẫu bệnh phẩm được thực hiện theo TCVN 8402:2010. Bệnh phẩm là não, phổi, dịch xoang bao tim, dịch xoang ngực, dịch khớp.

- Lấy mẫu não, phổi: Dùng panh, kéo (5.9) cắt từ 10 g đến 100 g não, phổi, để riêng vào từng lọ (5.24), đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Lấy mẫu dịch xoang bao tim, dịch xoang ngực: Dùng bơm và kim tiêm (5.11) hoặc pipet để hút lấy dịch xoang bao tim, dịch xoang ngực. Để mẫu trong bơm tiêm hoặc chuyển mẫu vào từng lọ (5.24), đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Lấy dịch khớp: Sát trùng bên ngoài khớp bằng cồn 70 %. Dùng bơm và kim tiêm (5.11) để hút lấy dịch khớp. Để mẫu trong bơm tiêm hoặc chuyển mẫu vào từng lọ (5.24), đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

CHÚ THÍCH: Các mẫu bệnh phẩm phải được đựng trong dụng cụ sạch, không rò rỉ, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong thùng bảo ôn, vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm.

7.2  Chuẩn bị mẫu, nuôi cấy, phân lập và xác định hình thái G. parasuis

7.2.1  Chuẩn bị mẫu, nuôi cấy G. parasuis

- Mẫu bệnh phẩm là dịch đường hô hấp: Lấy tăm bông có dịch đường hô hấp phết lên bề mặt môi trường thạch sô-cô-la (4.4) hoặc thạch máu (4.2). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên môi trường thạch. Với môi trường thạch máu đã ria cấy bệnh phẩm, dùng que cấy (5.15) lấy vi khuẩn Staphylococcus aureus cấy một đường ở giữa chỗ đã ria cấy bệnh phẩm;

- Mẫu bệnh phẩm là não, phổi: Sát trùng bề mặt ngoài của mẫu bằng bông cồn (5.16), rồi dùng panh, kéo (5.9) cắt sâu vào tổ chức bên trong lấy một mẫu nhỏ. Dùng panh (5.9) kẹp lấy mẫu bệnh phẩm vừa cắt phết lên bề mặt môi trường thạch sô-cô-la (4.4) hoặc thạch máu (4.2). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên môi trường thạch. Với môi trường thạch máu đã ria cấy bệnh phẩm, dùng que cấy (5.15) lấy vi khuẩn Staphylococcus aureus cấy một đường ở giữa chỗ đã ria cấy bệnh phẩm;

- Mẫu bệnh phẩm là dịch xoang bao tim, xoang ngực, dịch khớp: Nhỏ 1 giọt dịch mẫu lên bề mặt môi trường thạch sô-cô-la (4.4) hoặc thạch máu (4.2). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên môi trường thạch. Với môi trường thạch máu đã ria cấy bệnh phẩm, dùng que cấy (5.15) lấy vi khuẩn Staphylococcus aureus cấy một đường ở giữa chỗ đã ria cấy bệnh phẩm;

CHÚ THÍCH: Nếu không có thạch sô-cô-la thì sử dụng thạch máu (4.2) để cấy bệnh phẩm và cấy kèm một đường vi khuẩn Staphylococcus aureus (4.16) ở giữa. Bệnh phẩm (xem 7.1) được phết lên bề mặt thạch máu (4.2), dùng que cấy (5.15) ria cấy bệnh phẩm lên môi trường thạch; sau đó dùng que cấy (5.15) lấy vi khuẩn Staphylococcus aureus (4.16) cấy một đường trên bề mặt thạch máu đã ria cấy bệnh phẩm.

Sau đó ủ các đĩa và ống môi trường đã cấy mẫu vào trong tủ ẩm (5.1). Kiểm tra kết quả nuôi cấy sau 24 h đến 48 h.

7.2.2  Phân lập G. parasuis

Tính chất mọc của G. parasuis trên các môi trường sau 24 h đến 48 h nuôi cấy:

- Môi trường thạch sô-cô-la: Khuẩn lạc G. parasuis tròn, trắng xám, kích thước nhỏ (khoảng 0,3 mm), không gây dung huyết.

- Trên thạch máu: Khuẩn lạc G. parasuis mọc xung quanh đường cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus, Khuẩn lạc G. parasuis tròn, trong suốt, kích thước nhỏ (khoảng 0,3 mm), không gây dung huyết.

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ là G. parasuis sau khi nuôi cấy (xem 7.2.1) và cấy vào môi trường thạch sô-cô-la (4.4) hoặc thạch máu (4.2), nuôi trong tủ ấm (xem 5.1) để xác định vi khuẩn bằng phương pháp xác định hình thái, các đặc tính sinh hóa, bằng phản ứng PCR hoặc Realtime PCR.

CHÚ THÍCH: Nếu không có thạch sô-cô-la thì sử dụng thạch máu (4.2) để cấy vi khuẩn nghi ngờ là G. parasuis và cấy kèm một đường vi khuẩn Staphylococcus aureus (4.16) ở giữa.

7.2.3  Xác định hình thái của G. parasuis

Làm tiêu bản vi khuẩn: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (4.11) lên phiến kính (5.18), dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ là G. parasuis (xem 7.2.2) hòa vào giọt nước muối sinh lý.

Tiêu bản được để khô và cố định trên ngọn lửa đèn cồn (5.19) khoảng từ 3 giây đến 5 giây (5.19);

Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A);

Đọc kết quả nhuộm Gram: Vi khuẩn G. parasuis bắt màu hồng (màu của vi khuẩn Gram âm), đa hình thái.

CHÚ THÍCH: Việc xác định hình thái của vi khuẩn bằng kính hiển vi chỉ là nhận định ban đầu, chưa thể xác định được vi khuẩn. Cần xác định vi khuẩn bằng các phương pháp khác như các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn, phương pháp PCR, Realtime PCR.

7.3 Xác định G. parasuis bằng phương pháp sinh hóa

Từ canh khuẩn hoặc khuẩn lạc thuần khiết nghi là G. parasuis (xem 7.2.2) tiến hành xác định một số đặc tính sinh hóa đặc trưng được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 - Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng của G. parasuis

Chỉ tiêu	Đặc tính sinh hóa của G. parasuis
Phản ứng catalase	Dương tính
Phản ứng oxidase	Âm tính
Sinh indol	Âm tính
Phân giải urease	Âm tính
Lên men đường glucose	Dương tính
Lên men đường sucrose	Dương tính
Lên men đường D - Xylose	Âm tính
Lên men đường mannitol	Âm tính

Môi trường xác định các đặc tính sinh hóa của G. parasuis và cách tiến hành các phản ứng được nêu trong Phụ lục C.

CHÚ THÍCH: Xác định đặc tính sinh hóa của G. parasuis có thể sử dụng kít thương mại hoặc sử dụng máy định danh. Quy trình tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

7.4  Xác định G. parasuis bằng phương pháp PCR

Theo phụ lục D.

7.5  Xác định G. parasuis bằng phương pháp Realtime PCR

Theo phụ lục E.

7.6  Xác định typ huyết thanh của G. parasuis bằng phương pháp mPCR

Phương pháp mPCR thường sử dụng để xác định typ huyết thanh của vi khuẩn sau khi xác định được vi khuẩn kiểm tra là G. parasuis bằng phương pháp sinh hóa, PCR hoặc Realtime PCR; hoặc được tiến hành từ khuẩn lạc nghi ngờ là G. parasuis.

Xác định typ huyết thanh của G. parasuis bằng phương pháp mPCR được quy định tại Phụ lục F.

8  Kết luận

Lợn được kết luận mắc bệnh Glasser khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và một trong số các kết quả sau đây:

- Phân lập và xác định được vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa (xem 7.3);

- Kết quả PCR dương tính với G. parasuis (xem 7.4):

Kết quả Realtime PCR dương tính với G. parasuis (xem 7.5):

Kết quả mPCR dương tính với 1 trong 15 typ huyết thanh của G. parasuis (xem F.6).

 

Phụ lục A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

A.1  Thuốc thử

A.1.1  Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C25H30N3Cl)	2,0 g
Etanol 95 % (thể tích)	20,0 ml
Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O]	0,8 g
Nước cất	80,0 ml

Hoà tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước.

Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2  Dung dịch fuchsin đậm đặc

Fuchsin basic (C20H20ClN3)	1g
Etanol 95 % (thể tích)	10 ml
Phenol (C6H6O)	5g
Nước cất	100 ml

Hòa các thành phần trong nước và lắc đều cho tan hết.

Khi dùng sẽ pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỷ lệ 1 : 10 (thể tích)

A.1.3  Dung dịch lugol

Kali iodua (KI)	2 g
lốt (l2) tinh thể	1 g
Nước cất	200 ml

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể. Sau đó cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4  Cồn axeton

Etanol 95 % (thể tích)	3 phần
Axeton (C2H6O)	1 phần

Trộn dung dịch Etanol 95 % với Axeton theo tỷ lệ 3 : 1 phần thể tích.

A.2  Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tỉnh thể lên tiêu bản (xem 7.2.3), để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đỏ rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa tiêu bản thật nhanh bằng nước và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô.

A.3  Soi tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và soi tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (5.2).

A.4  Đọc kết quả

Vi khuẩn G. parasuis bắt màu hồng (màu của vi khuẩn Gram âm), đa hình thái (dạng cầu khuẩn đến dạng sợi mảnh).

 

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy G. parasuis

B.1  Môi trường thạch máu

B.1.1  Nguyên liệu

Thành phần:

VÍ DỤ: (*) dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886)[1], thành phần cho môi trường thạch máu bổ sung được nêu ở mục B.1.1.

B.1.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản (*) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường thạch máu ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 5.3).

Đợi nhiệt độ của môi trường thạch máu cơ bản xuống khoảng 40 °C thì bổ sung 5 ml máu (4.3).

Lắc đều và chia ra đĩa petri (5.14) khoảng 20 ml / đĩa.

Môi trường nuôi cấy được bảo quản ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

Bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy được thực hiện theo TCVN 8125:2015.

B.2  Môi trường thạch sô-cô-la

B.2.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Thành phần môi trường thạch sô-cô-la;

VÍ DỤ: (*) dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886)²⁾, thành phần cho môi trường thạch sô-cô-la bổ sung được nêu ở mục B.2.1.

VÍ DỤ: (**) dùng chất chiết nấm men (Yeast extract) của hãng Merck (Cat. No. 70161)²⁾, thành phần cho môi trường thạch sô-cô-la bổ sung được nêu ở mục B.2.1

B.2.2  Cách tiến hành

Sử dụng cân phân tích (5.10) để cân môi trường thạch máu cơ bàn và chất chiết nấm men hòa tan vào 89 ml nước cất.

Vô trùng môi trường ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (xem 5.3).

Để nhiệt độ môi trường giảm xuống khoảng 70 °C thì bổ sung máu (xem 4.3), lắc đều. Duy trì nhiệt độ của môi trường này bằng bể ủ nhiệt ở 70 °C trong 20 min và có lắc đều.

Để môi trường nguội xuống khoảng 40 °C bổ sung huyết thanh (4.5) và NAD (4.6). Lắc trộn đều các thành phần và phân phối vào các đĩa petri (5.14) khoảng 20 ml / đĩa.

Môi trường nuôi cấy được bảo quản ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

Bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy được thực hiện theo TCVN 8125:2015

 

Phụ lục C

(Quy định)

Xác định các đặc tính sinh hóa của G. parasuis

C.1  Phản ứng catalase

Thuốc thử: Dung dịch H₂O₂ 3 % (4.8)

Cách tiến hành:

Nhỏ một giọt thuốc thử H₂O₂ 3 % lên phiến kính (5.18).

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào giọt thuốc thử H₂O₂ đã nhỏ trên phiến kính.

Đọc kết quả sau 5 s:

- Phản ứng dương tính: Có hiện tượng sủi bọt;

- Phản ứng âm tính: Không có hiện tượng sủi bọt.

C.2  Phản ứng oxidase

Thuốc thử: Dung dịch oxidase hoặc giấy lọc tẩm 1 % tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride

Cách tiến hành:

Dùng giấy lọc đã tẩm 1 % tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride hoặc nhỏ một giọt thuốc thử oxidase lên giấy lọc.

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết vào phần giấy lọc đã có thuốc thử.

Đọc kết quả sau 20 s:

- Phản ứng dương tính: Chỗ phết khuẩn lạc trên giấy lọc có màu tím;

- Phản ứng âm tính: Chỗ phết khuẩn lạc trên giấy lọc không chuyển màu.

C.3  Kiểm tra khả năng sinh indol

C.3.1  Môi trường nước pepton

Thành phần môi trường:

VÍ DỤ: (**) dùng môi trường Peptone của hãng Merck (Cat. No. 107228)[2]

Cách pha chế môi trường:

Chuẩn bị môi trường nước pepton theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường nước pepton ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Để môi trường nguội khoảng 40 °C sẽ được bổ sung 5 ml huyết thanh, 5 ml chất chiết nấm men 25 %, 1 ml NAD 1%. Lắc đều và chia ra ống nghiệm (5,13) khoảng 5 ml / ống.

Môi trường nuôi cấy được bảo quản ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

Bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy được thực hiện theo TCVN 8125:2015.

C.3.2  Thuốc thử Kovacs'

Thành phần:

Paradimetyl aminobenzaldehyt	5g
Cồn amylic (C5H11OH)	75 ml
Axit clohydric đặc	25 ml

Cách pha chế:

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 °C. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml HCl, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục bổ sung HCl.

Bảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4 °C.

CHÚ THÍCH: có thể sử dụng thuốc thử Kovacs' thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng thuốc thử Kovacs' của hãng Merck (Cat. No. 109293)

C.3.3  Cách tiến hành

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường nước pepton (xem điều C.3.1) và nuôi trong tủ ẩm (5.1).

Sau 24 h nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovacs’ vào môi trường, lắc nhẹ.

Đọc kết quả:

- Phản ứng dương tính (sinh indol); Xuất hiện vòng màu đỏ phía trên môi trường.

- Phản ứng âm tính (không sinh indol): Không xuất hiện vòng màu đỏ.

C.4  Kiểm tra khả năng phân giải urê

C.4.1  Môi trường thạch urê

Thành phần môi trường:

VÍ DỤ: (***) dùng môi trường thạch Ure cơ bản (Ure agar base) của hãng Merck (Cat. No. 108492)[3]. Pha chế môi trưởng và bổ sung urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cách pha chế môi trường:

Pha môi trường thạch urê cơ bàn: dùng cân phân tích (5.10) cân 2,1 g môi trường thạch urê cơ bản. Hòa tan môi trường vào trong 100 ml nước cất rồi đun sôi cho môi trường tan hoàn toàn. Sau đó hấp vô trùng trong nồi hấp (5.3) ở 115 °C trong 20 min.

Môi trường thạch urê cơ bản đã vô trùng, để nguội khoảng 40 °C sẽ được bổ sung với 5 ml dung dịch urê 40% (xem 4.10), 5 ml huyết thanh (xem 4.5), 5 ml chất chiết nấm men 25 % (xem 4.7), 1 ml NAD 1% (xem 4.6).

Lắc đều, chia ra các ống nghiệm (5.13), khoảng 6 ml /1 ống nghiệm. Đặt nghiêng các ống môi trường một góc khoảng 45 °.

Môi trường nuôi cấy được bảo quản ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

Bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy được thực hiện theo TCVN 8125:2015.

C.4.2  Cách tiến hành

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch urê (xem điều C.4.1),

Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h:

- Phản ứng dương tính: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển sang màu hồng;

- Phản ứng âm tính: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn không chuyển màu.

C.5  Phản ứng lên men đường

C.5.1  Chuẩn bị dung dịch đường 10 %

Từng loại đường (Glucose, sucrose, D-xylose, mannitol) được pha trong nước cất thành dung dịch đường 10 %.

Vô trùng dung dịch đường bằng cách hấp ở 110 °C từ 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

C.5.2  Môi trường peptone đường

Thành phần môi trường:

VÍ DỤ: (**) dùng môi trường Peptone của hãng Merck (Cat. No. 107228)[4]

Cách pha chế môi trường:

Pha môi trường nước pepton theo hướng dẫn của nhà sản xuất, bổ sung 1 ml chỉ thị đỏ phenol 0,2 %.

Vô trùng môi trường nước pepton ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Để môi trường nguội khoảng 40 °C sẽ được bổ sung 5 ml huyết thanh, 5 ml chất chiết nấm men 25 %, 1 ml NAD 1%. Lắc đều và chia ra ống nghiệm (5.13) khoảng 5 ml / ống.

Bổ sung 0,5 ml dung dịch đường 10 % (xem C.5.1) vào mỗi ống môi trường peptone (xem C.5.2) và ghi nhãn tên loại đường lên ống môi trường.

Môi trường nuôi cấy được bảo quản ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

Bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy được thực hiện theo TCVN 8125:2015.

C.5.3  Cách tiến hành

Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào các ống môi trường peptone đường.

Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h:

- Phản ứng dương tính: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển sang màu vàng;

- Phản ứng âm tính: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn không chuyển màu.

 

Phụ lục D

(Quy định)

Xác định G. parasuis bằng phương pháp PCR

D.1  Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phẩm gồm: não, phổi, dịch xoang bao tim, dịch xoang ngực, dịch khớp hoặc khuẩn lạc, vi khuẩn nghi ngờ là G. parasuis.

- Với mẫu bệnh phẩm là não, phổi: Đồng nhất mẫu bằng cách dùng panh kéo (5.9) cắt nhỏ và nghiền mẫu bệnh phẩm với nước muối sinh lý (4.11) theo tỷ lệ 1 : 9 (phần thể tích) bằng cối chày sứ (5.20) hoặc bằng máy nghiền mẫu, máy dập mẫu. Chuyển huyễn dịch bệnh phẩm vừa đồng nhất vào ống ly tâm và ly tâm với gia tốc 1.500 g trong 10 min, loại bỏ cặn thu lấy dịch nồi phía trên vào ống 2 ml để làm xét nghiệm;

- Với mẫu bệnh phẩm là dịch xoang bao tim, dịch xoang ngực, dịch khớp: chuyển mẫu dịch bệnh phẩm vào ống 2 ml để làm xét nghiệm;

- Với mẫu bệnh phẩm nghi ngờ là khuẩn lạc G. parasuis: lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu đối chứng dương: Là chủng vi khuẩn đã được xác định là G. parasuis hoặc sử dụng các chủng G. parasuis chuẩn.

D.2  Tách chiết ADN

- Tách chiết ADN từ bệnh phẩm hoặc vi khuẩn nghi ngờ bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink ^TM Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002).

- Vi khuẩn có thể tách chiết AND bằng phương pháp sốc nhiệt. Quy trình tách chiết ADN của vi khuẩn G. parasuis bằng phương pháp sốc nhiệt như sau: lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước tinh khiết không có nuclease. Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (5.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

D.3  Nguyên liệu cho PCR

D.3.1  Taq PCR Master Mix Kit;

VÍ DỤ: Dùng kít nhân gen Taq PCR Mastermix kit Qiagen (Cat. No. 201443); Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat. No. K1071)

D.3.2 Cặp mồi: mồi xuôi (HPS-forward) và mồi ngược (HPS-reverse) (Bảng D.1);

Bảng D.1 - Cặp mồi xác định G. parasuis

Gen đích	Tên mồi	Trình tự từ đầu 5’ tới 3’	Kích thước sản phẩm (bp)
16S	HPS-forward	GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT	821
	HPS-reverse	GGC TTC GTC ACC CTC TGT

Mồi được chuẩn bị như sau:

Chuẩn bị mồi gốc: Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (D.3.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μm /μl làm mồi gốc;

Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (D.3.3).

VÍ DỤ: lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 80 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μm /μl.

D.3.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

D.3.4  Dung dịch đệm điện di: Có thể dùng dung dịch đệm TAE hoặc TBE;

D.3.5  Chất nhuộm màu ADN;

VÍ DỤ: Chất nhuộm màu SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen; hoặc chất nhuộm màu Gel Red của hãng Biotium.

KHUYẾN CÁO: Chất nhuộm màu Ethidi bromua có thể gây ung thư nên khuyến cáo không sử dụng.

D.3.6  Loading dye (Đệm tải mẫu);

D.3.7  ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker), thang 100 bp;

D.3.8  Dung dịch đệm TE;

D.3.9  Agarose.

D.4  Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat. No. K1071)[5], thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng D.2.

Bảng D.2- Thành phần của phản ứng PCR

Thành phần	Thể tích cho 1 phản ứng (μl)
Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X)	12,5
Nước không có nuclease	6,5
Mồi xuôi 20 μM	0,5
Mồi ngược 20 μM	0,5
Tổng thể tích	20,0

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml (5.21). Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương; Cho 5 μl mẫu ADN của G. parasuis vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tính khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm tra: Cho 5 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Phản ứng được tiến hành bằng máy PCR (5.6) với chu trình nhiệt như nêu trong bảng D.3.

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
95 °C	2 min	1 chu kỳ
95 °C	30 s	35 chu kỳ
55 °C	30 s
72 °C	1 min
72 °C	7 min	1 chu kỳ
CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

D.5  Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE có bổ sung chất nhuộm màu (D.3.5). Cách pha chế thạch agarose và bổ sung chất nhuộm màu, sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 10 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được chạy điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) ở bộ điện di (5.7), trong thời gian từ 20 min đến 30 min, ở 100 V.

D.6  Đọc kết quả

Phản ứng PCR được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương tính có vạch đúng kích thước sản phẩm (sản phẩm 821 bp); mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm;

Mẫu kiểm tra dương tính với G. parasuis khi có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (kích thước sản phẩm 821 bp);

Mẫu kiểm tra âm tính với G. parasuis khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương.

 

Phụ lục E

(Quy định)

Xác định G. parasuis bằng phương pháp Realtime PCR

E.1  Chuẩn bị mẫu

Xem Phụ lục D.1.

E.2  Tách chiết ADN

Xem Phụ lục D.2.

E.3  Nguyên liệu cho Realtime PCR

E.3.1  Realtime Master Mix kit;

VÍ DỤ: QuantiTect Probe PCR kit (Cat. No. 204343), Platinum™ Quantitative PCR SuperMix-UDG (Cat. No. 11730025);

E.3.2  Cặp mồi (primers) và mẫu dò: (xem bảng E.1);

Bảng E.1 - Cặp mồi và mẫu dò xác định G. parasuis

Tên mồi	Trình tự từ đầu 5’ tới 3’
CTinfF1	CGACTTACTTGAAGCCATTCTTCTT
CTinfR1	CCGCTTGCCATACCCTCTT
CTintP	6FAM-ATCGGAAGTATTAGAATTAAGTGC -TAMRA

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

Mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô được ly tâm nhanh (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (E.3.4) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 μm làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μm, mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10 μm được pha loãng từ mồi gốc, mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (E.3.3).

VÍ DỤ: lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μm và thêm 80 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μM / μl.

VÍ DỤ: lấy 6 μl mẫu dò gốc có nồng độ 100 μm và thêm 94 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 6 μm / μl.

E.3.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

E.3.4  Dung dịch đệm TE

E.4  Tiến hành phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (xem E.3.2).

Phản ứng Realtime PCR sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen QuantiTect Probe PCR kit, code: 204343

Bảng E.2 - Thành phần của phản ứng Realtime PCR

Thành phần	Thể tích cho 1 phản ứng (μl)
QuantiTect Probe PCR kit	12,5
Nước không có nuclease	6,0
Probe 6 μM	0.5
Mồi xuôi 20 μM	0,5
Mồi ngược 20 μM	0,5
Tổng thể tích	20,0

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN của G. parasuis vào ống phản ứng.

Mẫu đối chứng âm; Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

Mẫu kiểm tra: Cho 5 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy Realtime PCR (5.5) theo đặt chu trình nhiệt nêu trong Bảng E.3.

Bảng E.3 - Chu trình nhiệt phản ứng Realtime PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C	2 min	1 chu kỳ
95 °C	15 min	1 chu kỳ
95 °C	15 s	40 chu kỳ
60 °C	60 s
(*) Thời điểm ghi nhận tín hiệu huỳnh quang. CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

E.5  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 giá trị Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct;

- Mẫu kiểm tra dương tính khi giá trị Ct ≤ 35;

- Mẫu kiểm tra âm tính khi không có giá trị Ct;

- Mẫu kiểm tra nghi ngờ khi có giá trị 35 < Ct ≤ 40.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

 

Phụ lục F

(Quy định)

Xác định typ huyết thanh của G. parasuis bằng phương pháp mPCR

F.1  Chuẩn bị mẫu

Xem Phụ lục D.1.

F.2  Tách chiết ADN

Xem Phụ lục D.2.

F.3  Nguyên liệu cho PCR

Xem Phụ lục D.3.

Các cặp mồi xác định typ huyết thanh của vi khuẩn G. parasuis: Xem bảng F.1.

Bảng F.1 - Các cặp mồi xác định typ huyết thanh của G. parasuis

Typ huyết thanh	Gen đích	Trình tự từ đầu 5’ tới 3’	Kích thước sản phẩm (bp)
1	funB	CTGTGTATAATCTATCCCCGATCATCAGC	180
		GTCCAACAGAATTTGGACCAATTCCTG
2	WZX	CTAACAAGTTAGGTATGGAGGGTTTTGGTG	295
		GGCACTGAATAAGGGATAATTGTACTG
3	glyC	CATGGTGTTTATCCTGACTTGGCTGT	650
		TCCACATGAGGCCGCTTCTAATATACT
4	wciP	GGTTAAGAGGTAGAGCTAAG AATAGAGG	320
		CTTTCCACAACAGCTCTAGAAACC
5 và 12	wcwK	CCACTGGATAGAGAGTGGCAGG	450
		CCATACATCTGAATTCCTAAGC
6	gltl	GATTCTGATGATTTTTGGCTGACGGAACG	360
		CCTATTCTGTCTATAAGCATAGACAGGAC
7	funQ	CTCCGATTTCATCTTTTCTATGTGG	490
		CGATAAACCATAACAATTCCTGGCAC
8	scdA	GGAAGGGGATTACTACTACCTGAAAG	650
		CTCCATAGAACCTGCTGCTTGAG
9	funV	AGCCACATCAATTTTAGCCTCATCA	710
		CCTTAAATAGCCTATGTCTGTACC
10	funX	GGTGACATTTATGGGCGAGTAAGTC	790
		GCACTGTCATCAATAACAATCTTAAGACG
11	amtA	CCATCT CTTTAACTAATGGGACTG	890
		GGACGCCAAGGAGTATTATCAAATG
13	gltP	GCTGG AGGAGTTGAAAGAGTTGTTAC	840
		CAATCAAATGAAACAACAGGAAGC
14	funAB	GCTGGTTATGACTATTTCTTTCGCG	730
		GCTCCCAAGATTAAACCACAAGCAAG
15	funl	CAAGTTCGGATTGGGAGCATATATC	550
		CCTATATCATTTGTTGGATGTACG
Tất cả các typ	HPS_219690793	ACAACCTGCAAGTACTTATCGGGAT	275
		TAGCCTCCTGTCTGATATTCCCACG

Hỗn hợp mồi được chuẩn bị từ mỗi mồi (xem bảng F.1) có nồng độ 20 μm theo tỷ lệ 1 : 1 về thể tích.

F.4  Tiến hành phản ứng mPCR

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat. No. K1071)[6], thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng F.2.

Bảng F.2 - Thành phần của phản ứng mPCR

Thành phần	Thể tích cho 1 phản ứng (μl)
Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X)	12,5
Hỗn hợp các mồi ở nồng độ 20 μm (xem F.3)	4
Nước không có nuclease	6,5
Tổng thể tích	23,0

Chuyển 23 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 2 μl mẫu ADN của G. parasuis vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 2 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm tra: Cho 2 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng,

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phàn ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy PCR (5.6) với chu trình nhiệt như nêu trong bảng F.3.

Bảng F.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
95 °C	2 min	1 chu kỳ
95 °C	30 s	35 chu kỳ
55 °C	30 s
72 °C	1 min
72 °C	7 min	1 chu kỳ
CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kit khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

F.5  Chạy điện di

Sản phẩm mPCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE có bổ sung chất nhuộm màu (D.3.5). Cách pha chế thạch agarose và bổ sung chất nhuộm màu, sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 10 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được chạy điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) ở bộ điện di (5.7), trong thời gian từ 20 min đến 30 min, ở 100 V.

F.6  Đọc kết quả

Phản ứng mPCR được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương có vạch sản phẩm 275 bp và mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm;

Mẫu kiểm tra có một vạch sản phẩm 275 bp và một vạch sản phẩm khác (đối chiếu kích thước sản phẩm ở bảng F.1): Mẫu kiểm tra là G. parasuis và tương ứng thuộc một trong 15 typ huyết thanh kiểm tra.

Mẫu kiểm tra chỉ có một vạch sản phẩm 275 bp: Mẫu Kiểm tra là G. parasuis và không thuộc typ huyết thanh từ 1 đến 15.

Mẫu kiểm tra không có vạch sản phẩm 275 bp: Mẫu kiểm tra không phải là G. parasuis.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCCS16:2018/VT-CĐ Tiêu chuẩn cơ sở về phân lập, giám định vi khuẩn Haemophilus parasuis gây bệnh Glasser ở lợn.

[2] P. J. Quinn, M. E. Carter , B. Markey, G. R. Cater, 2004. Clinical Veterinary Microbiology. Chapter 26: Haemophilus species. Elsevier Publish, the 5th Edition, p.273-277.

[3] V. J. Rapp-Gabrielson, S. R. Oliveira, C. Pijoan, 2008. Diseases of swine, Chapter 40: Haemophilus parasuis. 12th Edition, Blackwell Publishing, p. 681 -692.

[4] Simone Oliveira, Lucina Galia, Carlos Pijoan, 2001. Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infection. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 13, p. 495 - 501.

[5] C. Turni, M. Pyke and P.J. Blackall, 2010. Validation of a real-time PCR for Haemophilus parasuis. Journal of Apμlied Microbiology ISSN 1364-5072.

[6] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thủy, Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Chu Thị Thanh Hương, 2020. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y, Phần 4.14 Bệnh do Haemophilus parasuis, trang 350 - 355.

[7] K.J. Howell, S.E. Peters, J. Wang, J. Hernandez-Garcia, L.A. Weinert, 2015. Development of a multiμlex PCR assay for rapid molecular serotyping of Haemophilus parasuis. J. Clin. Microbiol. 53, 3812-3821.

[8] QCVN 01-83:2011/BNNPTNT Quy chuẩn Quốc gia: Bệnh động vật - Yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển.