Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44: Bệnh roi trùng (Trichomonosis)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-44 : 2019

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 44: BỆNH ROI TRÙNG (TRICHOMONOSIS)

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 44: Trichomonosis

Lời nói đầu

TCVN 8400-44 : 2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo tài liệu của tổ chức Thú y tế giới (OIE).

TCVN 8400-44 : 2019 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

- TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

- TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

- TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus;

- TCVN 8400-39 : 2016, phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà và gà tây;

- TCVN 8400-40 : 2016, phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;

- TCVN 8400-41 : 2019, phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

- TCVN 8400-42 : 2019, phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại;

- TCVN 8400-43 : 2019, phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44 : 2019, phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45 : 2019, phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46 : 2019, phần 46: Bệnh Dại;

- TCVN 8400-47 : 2019, phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 44: BỆNH ROI TRÙNG (TRICHOMONOSIS)

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 44: Trichomonosis

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Roi trùng do Tritrichomonas foetus ở bò.

2  Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt sau:

2.1

Bệnh Roi trùng (Trichomonosis)

Bệnh gây ra bởi roi trùng đơn bào Tritrichomonas foetus thường ký sinh ở âm đạo, tử cung, đầu dương nang của bò. Bệnh thường gây sảy thai, sinh non, rối loạn chu kỳ động dục, hoặc chết thai ở bò cái. Ký sinh trùng dài từ 8 µm đến 18 µm và rộng từ 4 µm đến 9 µm, hình lê, có nhân lớn, có 3 roi phía trước và roi thứ 4 cong uốn khúc về phía sau nối với thân bằng màng rung động, sau màng là phần roi tự do, dọc thân có trụ giữa hình đũa.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có nuclease, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp soi tươi, nhuộm Giemsa kiểm tra hình thái Tritrichomonas foetus

3.1.1  Dung dịch PBS (phosphate buffered saline) 0,01 M (pH = 7,0) (xem điều A.1 phụ lục A).

3.1.2  Dung dịch Giemsa 10% (xem điều A.2 phụ lục A).

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp PCR (polymerase chain reaction), Realtime PCR phát hiện Trichomonas foetus

3.2.1  Kít tách chiết DNA (acid deoxyribonucleic) cho mẫu máu hoặc mẫu mô.

3.2.2  Kít nhân gen.

3.2.3  Cặp mồi (primers), gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.4  Cặp primer và probe, gồm mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò.

3.2.5  Agarose.

3.2.6  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (dung dịch đệm borat ethylenediamine tetra-acetic acid), (xem phụ lục C).

3.2.7  Sybr safe hoặc ethidium bromide.

3.2.8  Loading dye 6X (chất đệm tải mẫu).

3.2.9  Dung dịch đệm TE.

3.2.10  Thang chuẩn DNA (Ladder, marker).

3.2.11  Nước tinh khiết không có nuclease.

3.3  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nuôi cấy phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus trong môi trường Modified Diamonds Medium, Kít thương mại Inpouch _TMTF

Hiện nay có thể tham khảo các kít nuôi cấy thương mại có sẵn trên thị trường dùng để nuôi cấy phát hiện Tritrichomonas foetus, tuy nhiên rất tốn kém. Khi sử dụng kít này cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

4.1.2  Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ 2 °C đến 8 °C.

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp soi tươi, nhuộm Giemsa kiểm tra hình thái Tritrichomonas foetus

4.2.1  Phiến kính, vô trùng.

4.2.2  Lamen, vô trùng.

4.2.3  Kính hiển vi quang học, vật kính dầu 100 X.

4.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp PCR, Realtime PCR phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus

4.3.1  Máy nhân gen PCR, Realtime PCR.

4.3.2  Máy ly tâm, có thể đạt gia tốc ly tâm 900 g; 6 000 g và 20 000 g.

4.3.3  Máy lắc trộn vortex.

4.3.4  Máy spindown.

4.3.5  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.3.6  Máy đọc gel (blue light transilluminator hoặc uv light).

4.4  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp nuôi cấy phát hiện Tritrichomonas foetus trong môi trường Modified Diamond’s medium, kít thương mại Inpouch _TM TF

4.4.1  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 °C.

4.4.2  Mấy hấp.

4.4.3  Buồng cấy.

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh roi trùng do Tritrichomonas foetus ở bò thường gặp ở vùng chăn nuôi theo hình thức bầy đàn và không sử dụng kỹ thuật thụ tinh nhân tạo;

- Bò đực thường là những con mang trùng;

- Bệnh lây lan chủ yếu qua con đường giao phối tự nhiên, tuy nhiên cũng có thể truyền cơ học qua các dụng cụ nhiễm bẩn khi thụ tinh nhân tạo, khám phụ khoa ở con cái;

- Bệnh thường được phát hiện ở bò dưới 3 năm tuổi. Đối với bò trên 3 năm tuổi khi bị nhiễm bệnh thì khả năng khỏi bệnh rất thấp nên chúng là những con mang trùng.

5.2  Triệu chứng

- Bò cái thường bị viêm đường sinh dục, suy giảm khả năng sinh sản như: rối loạn chu kỳ động dục, sảy thai liên tục, hoặc sinh non, hoặc thai chết lưu;

- Bò đực bị bệnh mạn tính không biểu hiện bệnh rõ. Tritrichomonas foetus có mặt với số lượng nhỏ trong khoang bao quy đầu của bò đực, một số tập trung trong vòm dương vật và xung quanh dương vật;

5.3  Bệnh tích

- Bò cái nhiễm bệnh, bị viêm âm đạo, cổ tử cung và tử cung. Trường hợp nặng có thể dẫn đến viêm nhau thai, sảy thai sớm từ 1 tuần đến 16 tuần, chảy dịch mủ ở tử cung, xuất huyết tử cung;

- Bò đực thường bị bệnh ở thể mạn tính, không có bệnh tích đại thể.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

6.1.1  Lấy mẫu

- Lấy mẫu bằng bàn chải chuyên dụng;

- Trước khi lấy mẫu cần vệ sinh sạch sẽ cơ quan lấy mẫu và vùng xung quanh, không dùng chất sát trùng để tránh làm giảm độ nhạy khi chẩn đoán;

- Mẫu bệnh phẩm từ bò cái: Thụt rửa âm đạo bằng dung dịch PBS (xem phụ lục B) hoặc nước muối sinh lý 0.9 % (vô trùng), dịch âm đạo hoặc cạo cổ tử cung bằng pipet thụ tinh nhân tạo hoặc bàn chải chuyên dụng;

- Mẫu bệnh phẩm từ bò đực: Dịch dương vật, cạo niêm mạc dương vật hoặc bao quy đầu bằng cách dùng pipet thụ tinh nhân tạo, bàn chải chuyên dụng;

- Mẫu bệnh phẩm từ bào thai bò: Nhau thai, dịch thai.

6.1.2  Bảo quản mẫu

- Trường hợp phải gửi mẫu tới phòng thí nghiệm và không thể vận chuyển trong vòng 24 giờ, nên sử dụng môi trường vận chuyển chứa kháng sinh (Ví dụ: thioglycollate broth media với kháng sinh, hoặc túi nhựa thực địa. Trong quá trình vận chuyển, nên tránh tiếp xúc với ánh sáng và bảo quản ở 5 °C - 37 °C.

CHÚ THÍCH: đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiêm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2  Phương pháp soi tươi, nhuộm Giemsa phát hiện Tritrichomonas foetus

6.2.1  Lấy mẫu

Xem 6.1.1

6.2.2  Bảo quản mẫu

Xem 6.1.2

6.2.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, niêm mạc dương vật bò đực, nhau thai.

6.2.4  Cách tiến hành 1)

6.2.4.1  Phương pháp soi tươi

- Nhỏ 1 giọt dịch mẫu từ âm đạo hoặc dương vật (tương đương 5 µl đến 10 µl) lên một đầu của phiến kính (4.2.1);

- Đậy lamen lên giọt mẫu rồi tiến hành soi;

CHÚ Ý: Phương pháp này thường được áp dụng sau khi mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy nhân lên trong môi trường vì Tritrichomonas foetus thường có ít đối với mẫu bệnh phẩm vừa thu thập từ con vật.

6.2.4.2  Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản

6.2.4.2.1  Chuẩn bị tiêu bản

- Nhỏ 1 giọt dịch mẫu từ âm đạo hoặc dương vật (tương đương 5 µl đến 10 µl) lên một đầu của phiến kính (4.2.1);

- Dàn mỏng dịch mẫu bằng lamen (4.2.2) hoặc một phiến kính khác (4.2.1);

- Tiêu bản đã để khô tự nhiên sau đó cố định bằng methanol tuyệt đối trong 1 min. Để khô.

6.2.4.2.2  Nhuộm tiêu bản

- Đặt tiêu bản vào cốc đựng dung dịch giemsa 10 % (xem mục A2 phụ lục A) trong 30 min;

- Rửa tiêu bản bằng nước sạch từ 3 lần đến 4 lần;

- Để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng.

6.2.5  Xem hình thái Tritrichomonas foetus

- Dùng kính hiển vi có vật kính có độ phóng đại 100 lần hoặc 400 lần đối với phương pháp soi tươi, vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần đối với phương pháp nhuộm Giemsa;

- Ký sinh trùng dài từ 8 µm đến 18 µm và rộng từ 4 µm đến 9 µm, hình lê, có nhân lớn, có 3 roi phía trước và roi thứ 4 cong uốn khúc về phía sau, nối với thân bằng màng rung động, sau màng này là phần roi tự do, dọc thân có trụ giữa hình đũa.

6.3  Phương pháp nuôi cấy phát hiện Tritrichomonas foetus

6.3.1  Lấy mẫu

Xem 6.1.1

6.3.2  Bảo quản mẫu

Xem 6.1.2

6.3.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, hoặc niêm mạc dương vật bò đực.

Đối với mẫu thu thập bằng cách rửa âm đạo cần xử lý mẫu bằng phương pháp ly tâm. Phần lắng cặn được cấy vào môi trường.

Mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập cần đưa ngay vào môi trường nuôi cấy, ở 30 °C - 37 °C, trong 48 h - 72 h hoặc lâu hơn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy.

6.3.4  Cách tiến hành 2)

6.3.4.1  Môi trường Modified Diamond’s medium

Dụng cụ nuôi cấy: dùng đũa thủy tinh rửa bằng nước cất, không dùng các hóa chất tẩy rửa.

Chuẩn bị môi trường gồm:

Bảng 1 Thành phần môi trường

Môi trường trên được hấp chín trong 10 min ở 121 °C, để nguội đến 49 °C, sau đó thêm 10 ml huyết thanh bò vô hoạt (vô hoạt ở 56 °C, trong 30 min), 100 000 đơn vị Penicilin C tinh thể và 0,1 g Streptocmycin sulphat vô trùng được thêm vào. Môi trường được chia vào lọ kín (16 mm x 125 mm) vô trùng, mỗi lọ 10 ml và để ở tủ lạnh 4 °C tới khi sử dụng. Các môi trường nên được nuôi cấy ở 37 °C trong khoảng 7 ngày, các mẫu môi trường nên được kiểm tra ở nhiều thời điểm hàng ngày. Khi pha môi trường, chia môi trường cần hạn chế tối đa sự tạp nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài.

6.2.4.2  Nuôi cấy bằng kít thương mại InPouch _TM TF

Cách sử dụng và nuôi cấy thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.3.5  Đọc kết quả

- Sử dụng kính hiển vi quang học độ phóng đại 40 lần hoặc 100 lần quan sát thấy hình thái Tritrichomonas foetus như sau:

Ký sinh trùng dài từ 8 µm đến 18 µm và rộng từ 4 µm đến 9 µm, hình quả lê, có nhân lớn, có 3 roi phía trước và roi thứ 4 cong uốn khúc về phía sau, nối với thân bằng màng rung động, sau màng này là phần roi tự do, dọc thân có trụ giữa hình đũa.

CHÚ Ý: Có thể dùng kính hiển vi soi trực tiếp đối với kít thương mại InPouch _TM TF

6.4  Phương pháp PCR phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus

6.4.1  Lấy mẫu

Xem 6.1.1

6.4.2  Bảo quản mẫu

Xem 6.1.2

6.4.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, hoặc niêm mạc dương vật bò đực, nhau thai.

6.4.4  Cách tiến hành

6.4.4.1  Tách chiết DNA

Sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ: dùng kít tách chiết DNAeasy^® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504)3) (xem phụ lục D)

6.4.4.2  Chuẩn bị cặp mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp PCR và sử dụng cặp mồi (3.2.3) được nêu trong phần E1 phụ lục E.

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM.

6.4.4.3  Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem 6.4.4.2).

Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Promega (Cat No.M7122)2

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt xem phần E2, phụ lục E

6.4.4.4  Điện di

6.4.4.4.1  Chuẩn bị bản gel

Pha thạch Agarose (3.2.5) ở nồng độ từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (xem phụ lục C) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó đun thạch đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu loading dye (3.2.8) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.3.5), đổ dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (xem phụ lục C) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain4)) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.4.4.4.2  Chạy điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.3.5), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (3.2.9) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (3.2.10) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

Bản thạch sau khi điện di xong được lấy ra và đọc kết quả trên máy đọc gel (4.3.6).

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di hút 2 µl loading dye 6X (3.2.8) vào 8 µl sản phẩm PCR ra trộn đều và cho vào từng giếng trên bản gel.

6.4.5  Đọc kết quả

Đặt bản gen lên trên máy đọc gel (4.3.6):

- Điều kiện phản ứng được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương tính có vạch sản phẩm kích thước 347 bp và mẫu đối chứng âm tính không có vạch sản phẩm;

- Mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như đối chứng dương và có kích thước 347 bp;

- Mẫu âm tính giống đối chứng âm và không có vạch sản phẩm xuất hiện;

- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp này cần lặp lại xét nghiệm.

6.5  Phương pháp Realtime PCR phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus

6.5.1  Lấy mẫu

Xem 6.1.1

6.5.2  Bảo quản mẫu

Xem 6.1.2

6.5.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, hoặc niêm mạc dương vật bò đực, nhau thai.

6.5.4  Cách tiến hành

6.5.4.1  Tách chiết DNA

Sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít tách chiết DNAeasy^® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504)5) (xem phụ lục D)

6.5.4.2  Chuẩn bị cặp mồi và mẫu dò

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp Realtime PCR và sử dụng cặp mồi và mẫu dò được nêu trong Phần F1-Phụ lục F.

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindovvn (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM, pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease.

- Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 5 µM: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease.

6.5.4.3  Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.5.4.2).

Thành phần cho một phản ứng và chu trình nhiệt được nêu trong phần F2 phụ lục F.

6.5.4  Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy nhân gen realtime PCR dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền);

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính có giá trị Ct biết trước và mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại quy trình xét nghiệm hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác để khẳng định.

7  Kết luận

Bò được kết luận là mắc bệnh roi trùng do Tritrichomonas foetus khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm dương tính với một trong các phương pháp sau:

- Nuôi cấy;

- Soi tươi hoặc nhuộm Giemsa;

- PCR, realtime PCR.

Phụ lục A

(Quy định)

Thuốc thử cho phương pháp nhuộm Giemsa

A.1  Dung dịch PBS 0,01 M (pH = 7,0)

Natri hydrophotphat (Na₂HPO₄) 9,47 g

Kali dihydrophotphat (KH₂PO₄) 9,08 g

Nước cất 900 ml

Hòa tan natri hydrophotphat, kali dihydrophotphat trong nước và lắc cho tan hết.

CHÚ Ý: có thể sử dụng PBS thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch Giemsa 10 %

Dung dịch Giemsa azur-Eosin-Methylene blue 1 phần

Dung dịch PBS 0,01 M (pH = 7,0) 9 phần

CHÚ Ý: nồng độ dung dịch giemsa có thể thay đổi theo các phòng thí nghiệm.

Phụ lục B

(Quy định)

Dung dịch PBS pH 7,2

Thành phần

Natri clorua (NaCl) 8 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Dinatri hidrophosphat (Na₂HPO₄) 1,15 g

Kali dihidrophosphat (KH₂PO₄) 0,2 g

Nước cất 1 000 ml

Hòa tan các thành phần trong nước, bảo quản ở 4 °C.

Phụ lục C

(Quy định)

Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

C.1  Thành phần

Dung dịch TBE 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TBE 1X

C.2  Tiến hành

Lấy 100 ml dung dịch TAE hoặc TBE 10X với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết DNA

Tách chiết DNA của Tritrichomonas foetus bằng kit thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ dùng kit tách chiết DNAeasy ^® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504) như sau:

Pha dung dịch

- Dung dịch rửa 1: thêm 25 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào 19 ml dung dịch rửa AW1 đậm đặc;

- Dung dịch rửa 2: thêm 30 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào 13 ml dung dịch rửa AW2 đậm đặc.

Cách tiến hành

- Bước 1: ly giải mẫu

• Với mẫu niêm mạc âm đạo, dương vật: nhỏ 180 ml dung dịch ATL vào ống 1.5 ml; nhỏ 20 µl protease K vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3), ủ ở 56 °C trong 10 phút đến khi kết thúc quá trình ly giải, và trộn lại bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) 15 s trước khi chuyển sang bước 2;

- Bước 2: nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống; trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 10 min;

- Bước 3: nhỏ 200 µl etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3).

- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 3 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml sạch Dnase/Rnase;

- Bước 8: nhỏ 200 µl dung dịch AE vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min

- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa DNA;

Bảo quản DNA trong tủ lạnh (4.1.2) nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.

Phụ lục E

(Tham khảo)

Trình tự cặp mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phương pháp PCR phát hiện Tritrichomonas foetus ở bò ^[3]

E.1  Trình tự cặp mồi

E.2  Thành phần phản ứng, chu trình nhiệt

Thành phần cho một phản ứng được nêu trong dưới đây:

Chuyển 23 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 2 µl mẫu DNA có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 2 µl nước vào ống phản ứng;

Mẫu bệnh phẩm: cho 2 µl mẫu DNA bệnh phẩm vào ống phản ứng.

CHÚ Ý: phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kit nhân gen. Khi sử dụng bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chu trình nhiệt cài đặt cho máy nhân gen (4.3.1) được trình bày trong Bảng dưới đây:

Bảng - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Phụ lục F

(Tham khảo)

Trình tự cặp mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phương pháp Realtime PCR phát hiện Tritrichomonas foetus ở bò ^[3]

F 1. Trình tự cặp mồi và mẫu dò

F 2. Thành phần phản ứng, chu trình nhiệt

Thành phần phản ứng bao gồm 25 µl gồm mastermix , 900 nM mồi xuôi TFF2 và mồi ngược TFR2 và 80 nM mẫu dò Trich P2.

Chu trình nhiệt cài đặt cho máy nhân gen Realtime PCR được trình bày trong Bảng dưới đây:

Bảng - Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR

CHÚ Ý: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kit nhân gen. Khi sử dụng bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Trichomonosis OIE Terrestrial Manual 2018. Chapter 2.4.16.

[2] Phan Lục, nhà xuất bản Nông nghiệp, 1997. Giáo trình ký sinh trùng và Bệnh ký sinh trùng thú y

[3] BONDURANT R.H., CAMPERO C.M. ANDERSON M.L. & HOOSEAR K.A. (2003). Detection of Tritrichomonas foetus by polymerase chain reaction in culture isolates, cervicovaginal mucus, and formalin-fixed tissues from infected heifers and fetuses. J. Vet. Diagn. Invest., 15, 579-584.