Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8127:2018 (ISO 10273:2017) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh

TI�U CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8127:2018

ISO 10273:2017

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PH�P PH�T HIỆN YERSINIA ENTERROCOLITICA G�Y BỆNH

Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica

Lời n�i đầu

TCVN 8127:2018 thay thế TCVN 8127:2009;

TCVN 8127:2018 ho�n to�n tương đương với ISO 10273:2017;

TCVN 8127:2018 do Ban kỹ thuật ti�u chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương ph�p ph�n t�ch v� lấy mẫu bi�n soạn, Tổng cục Ti�u chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học v� C�ng nghệ c�ng bố.

Lời giới thiệu

Ti�u chuẩn n�y quy định phương ph�p ph�t hiện Yersinia enterocolitica g�y bệnh cho con người. Do t�nh đa dạng của thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i n�n phương ph�p n�y c� thể kh�ng th�ch hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể v� đối với một số sản phẩm kh�c cần sử dụng c�c phương ph�p kh�c nhau. Trong trường hợp n�y, c� thể sử dụng c�c phương ph�p kh�c đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu ho�n to�n chỉ v� l� do kỹ thuật. Tuy nhi�n, cần cố gắng �p dụng phương ph�p n�y khi c� thể.

Việc h�i h�a c�c phương ph�p thử c� thể kh�ng thực hiện được ngay v� đối với một v�i nh�m sản phẩm c� thể tồn tại c�c ti�u chuẩn quốc tế v�/hoặc ti�u chuẩn quốc gia m� kh�ng ph� hợp với ti�u chuẩn n�y. Th�ng thường khi c�c ti�u chuẩn như thế được so�t x�t th� ch�ng phải được sửa đổi để ph� hợp với ti�u chuẩn n�y, sao cho chỉ giữ lại c�c phần của phương ph�p n�y cần cho c�c l� do kỹ thuật được thừa nhận.

VI SINH VẬT CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PH�P PH�T HIỆN YERSINIA ENTEROCOLITICA G�Y BỆNH

Microbiology of food chain - Horizontal method for the detection of pathogenic Yersinia enterocolitica

CẢNH B�O - Để bảo vệ sức khỏe của nh�n vi�n ph�ng thử nghiệm, điều cần thiết l� c�c ph�p thử ph�t hiện Yersinia enterocolitica g�y bệnh chỉ được thực hiện trong c�c ph�ng thử nghiệm được trang bị đầy đủ, dưới sự kiểm so�t của nh� vi sinh vật học c� kỹ năng v� cẩn thận khi thải bỏ tất cả c�c vật liệu đ� ủ. Người sử dụng ti�u chuẩn n�y phải c� kinh nghiệm với thực h�nh ph�ng thử nghiệm th�ng thường. Ti�u chuẩn n�y kh�ng đề cập đến tất cả c�c kh�a cạnh an to�n, nếu c�, chỉ li�n quan đến việc sử dụng ti�u chuẩn. Người sử dụng c� tr�ch nhiệm thiết lập c�c vấn đề an to�n v� sức khỏe ph� hợp v� đảm bảo tu�n thủ c�c quy định hiện h�nh.

1 �Phạm vi �p dụng

Ti�u chuẩn n�y quy định phương ph�p ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh cho con người. Ti�u chuẩn n�y c� thể �p dụng cho:

- c�c sản phẩm thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i; v�

- c�c mẫu m�i trường trong khu vực sản xuất v� chế biến thực phẩm.

2 �T�i liệu viện dẫn

C�c t�i liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc �p dụng ti�u chuẩn n�y. Đối với c�c t�i liệu viện dẫn ghi năm c�ng bố th� �p dụng phi�n bản được n�u. Đối với c�c t�i liệu viện dẫn kh�ng ghi năm c�ng bố th� �p dụng phi�n bản mới nhất, bao gồm cả c�c sửa đổi, bổ sung (nếu c�).

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i - Y�u cầu chung v� hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả c�c phần), Vi sinh vật trong thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i - Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền ph� ban đầu v� c�c dung dịch pha lo�ng thập ph�n để kiểm tra vi sinh vật

TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nu�i v� nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản v� thử hiệu năng của m�i trường nu�i cấy

3 �Thuật ngữ v� định nghĩa

Trong ti�u chuẩn n�y sử dụng c�c thuật ngữ v� định nghĩa sau đ�y:

3.1

Yersinia enterocolitica g�y bệnh (pathogenic Yersinia enterocolitica)

Vi khuẩn ưa lạnh tạo th�nh c�c khuẩn lạc đặc trưng tr�n m�i trường đặc chọn lọc v� c� c�c đặc t�nh sinh h�a v� ph�n tử đ�p ứng c�c ti�u ch� về t�nh g�y bệnh như m� tả, khi tiến h�nh ph�p thử khẳng định theo ti�u chuẩn n�y.

3.2

Ph�t hiện Yersinia enterocolitica g�y bệnh (detection of pathogenic Yersinia enterocolitica)

X�c định sự c� mặt hay kh�ng c� mặt vi khuẩn Yersinia enterocolitica (3.1) trong một lượng hoặc một thể t�ch x�c định của sản phẩm hoặc bề mặt quy định, khi tiến h�nh thử theo ti�u chuẩn n�y.

4 �Từ viết tắt

Trong ti�u chuẩn n�y sử dụng c�c từ viết tắt sau đ�y:

5 �Nguy�n tắc

5.1 �Y�u cầu chung

Việc ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh bao gồm bốn giai đoạn li�n tiếp (xem Phụ lục A về sơ đồ quy tr�nh v� khẳng định). Ngo�i c�c quy tr�nh chung, v� dụ trong điều tra dịch bệnh, c� thể sử dụng quy tr�nh tăng sinh lạnh t�y chọn như trong Phụ lục D.

5.2 �Nu�i cấy trực tiếp từ m�i trường tăng sinh lỏng

Mẫu đ� được đồng nhất, cho v�o m�i trường tăng sinh lỏng (canh thang PSB), sau đ� cấy một lượng quy định v�o hai đến bốn thạch đĩa CIN^[15]. Ủ c�c đĩa đ� nu�i cấy ở 30 �C trong 24 h.

CH� TH�CH: Cũng c� thể sử dụng th�m c�c đĩa m�i trường thạch sinh m�u để ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh ^[9,13,18].

5.3 �Tăng sinh trong m�i trường tăng sinh lỏng chọn lọc v� m�i trường tăng sinh lỏng

Chuyển một lượng quy định của mẫu thử được nu�i cấy trong m�i trường tăng sinh PSB (5.2) v�o canh thang tăng sinh chọn lọc ITC ^[17]. Canh thang ITC v� huyền ph� PSB ban đầu được ủ ở 25 �C trong 44 h.

5.4 �Cấy đĩa sau khi tăng sinh v� nhận dạng

Từ dịch cấy tăng sinh thu được trong 5.3, cấy l�n bề mặt thạch đĩa CIN bằng c�ch đầu ti�n chuyển một lượng quy định dịch cấy tăng sinh (5.3, xem Điều 10 về c�ch tiến h�nh) v�o dung dịch KOH 0,5 % v� sau khi trộn đều trong một khoảng thời gian x�c định (xử l� bằng KOH hoặc kiềm), cấy l�n đĩa CIN. C�c đĩa ria cấy được ủ ở 30 �C trong 24 h. Nhận biết c�c khuẩn lạc điển h�nh của Y. enterocolitica g�y bệnh (xem 10.5) v� x�c nhận h�nh th�i khuẩn lạc như l� Y. enterocolitica giả định tr�n đĩa thạch chọn lọc (xem 10.5).

CH� TH�CH: Cũng c� thể sử dụng th�m c�c đĩa như m�i trường thạch sinh m�u để ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh ^[9,13,18].

5.5 �Khẳng định

Từ c�c khuẩn lạc Yersinia enterocolitica g�y bệnh giả định (5.2 v� 5.4), khẳng định Y. enterocolitica g�y bệnh bằng c�c ph�p thử khẳng định ph�n tử hoặc/v� c�c ph�p thử sinh h�a th�ch hợp (xem 10.6 v� H�nh A.2).

6 �Thuốc thử v� m�i trường nu�i cấy

Về thực h�nh trong ph�ng thử nghiệm hiện h�nh, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Về c�c y�u cầu cụ thể về đảm bảo chất lượng v� hiệu năng của m�i trường, xem Phụ lục B của TCVN 8128 (ISO 11133).

Th�nh phần của m�i trường nu�i cấy, thuốc thử v� quy tr�nh chuẩn bị được n�u trong Phụ lục B. Ngo�i ra, cũng c� thể sử dụng c�c m�i trường ho�n chỉnh kh�, c�c dịch pha lo�ng hoặc m�i trường chuẩn bị c� sẵn tu�n thủ theo hướng dẫn của nh� sản xuất.

7 �Thiết bị, dụng cụ v� vật tư

C� thể d�ng dụng cụ sử dụng một lần thay thế cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần, nếu c� c�c quy định th�ch hợp. Sử dụng c�c thiết bị, dụng cụ của ph�ng thử nghiệm vi sinh th�ng thường [TCVN 6404 (ISO 7218)] v� cụ thể như sau:

7.1 �Thiết bị khử tr�ng kh� (tủ sấy) hoặc thiết bị khử tr�ng ướt (nồi hấp �p lực)

Theo quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218).

7.2 �Tủ ấm, theo quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218), c� thể duy tr� nhiệt độ ở 4 �C � 2 �C, 25 �C � 1 �C, 30 �C � 1 �C v� 37 �C � 1 �C.

7.3 �T�i trộn, ống nghiệm, chai v�/hoặc b�nh cầu v� tr�ng, c� dung t�ch th�ch hợp.

7.4 �Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo, c� đường k�nh 90 mm v� k�ch thước lớn (đường k�nh khoảng 140 mm (t�y chọn).

7.5 �Pipet chia vạch hoặc tự động, c� miệng rộng, dung t�ch danh định 1 ml v� 10 ml v� được chia vạch tương ứng 0,1 ml v� 0,5 ml v� pipet Pasteur.

7.6 �Que cấy v�ng v� bộ d�n mẫu. V�ng cấy v� tr�ng đường k�nh khoảng 6 mm (thể t�ch 10 �l), que cấy thẳng hoặc d�y kim loại. Bộ d�n mẫu chữ T hoặc chữ L d�ng một lần. Tăm b�ng (xem Phụ lục D).

7.7 �K�nh hiển vi soi nổi, được trang bị đ�n chiếu s�ng truyền qua trường tối hoặc chếch một g�c (g�c 45�).

7.8 �M�y trộn nhu động.

8 �Lấy mẫu

Việc lấy mẫu kh�ng quy định trong ti�u chuẩn n�y, xem ti�u chuẩn cụ thể ph� hợp cho sản phẩm c� li�n quan. Nếu kh�ng c� ti�u chuẩn cụ thể th� c�c b�n li�n quan cần thỏa thuận về vấn đề n�y.

N�n sử dụng c�c kỹ thuật lấy mẫu quy định trong c�c ti�u chuẩn sau:

- TCVN 11923 (ISO/TS 17728) đối với thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i;

- TCVN 10782 (ISO 13307) đối với giai đoạn sản xuất ban đầu;

- TCVN 7925 (ISO 17604) đối với th�n thịt;

- TCVN 8129 (ISO 18593) đối với c�c mẫu m�i trường.

Điều quan trọng l� ph�ng thử nghiệm nhận được đ�ng mẫu đại diện v� kh�ng bị hư hỏng hoặc biến đổi trong qu� tr�nh vận chuyển v� bảo quản.

9 �Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử từ mẫu ph�ng thử nghiệm theo ti�u chuẩn cụ thể c� li�n quan đến sản phẩm. Nếu kh�ng c� ti�u chuẩn cụ thể th� c�c b�n c� li�n quan cần thỏa thuận về vấn đề n�y.

10 �C�ch tiến h�nh (xem Phụ lục A)

10.1 �Phần mẫu thử v� huyền ph� ban đầu

10.1.1 �Xem phần c� li�n quan của bộ TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả c�c phần) hoặc ti�u chuẩn th�ch hợp đối với sản phẩm c� li�n quan.

10.1.2 �Trong trường hợp chung, để chuẩn bị huyền ph� ban đầu, sử dụng m�i trường tiền tăng sinh l�m dịch pha lo�ng như quy định trong B.2 (canh thang PSB). L�m ấm trước canh thang PSB đến nhiệt độ ph�ng trước khi sử dụng.

Th�ng thường, một lượng mẫu thử (khối lượng hoặc thể t�ch) được cho v�o một lượng PSB (khối lượng hoặc thể t�ch) để tạo ra dung dịch pha lo�ng mười lần. Thường l� 25 g mẫu thử được trộn với 225 ml PSB.

Đồng h�a huyền ph� n�y bằng c�ch sử dụng m�y trộn nhu động (7.8) trong 1 min.

Ti�u chuẩn n�y đ� được x�c nhận gi� trị sử dụng cho c�c phần mẫu thử 25 g hoặc 25 ml. C� thể sử dụng một phần thử nhỏ hơn, m� kh�ng cần x�c nhận gi� trị sử dụng/kiểm tra bổ sung, với điều kiện l� duy tr� được c�ng tỷ lệ giữa canh thang tăng sinh với phần mẫu thử. C� thể sử dụng phần mẫu thử lớn hơn so với lượng được x�c nhận ban đầu, nếu nghi�n cứu x�c nhận gi� trị sử dụng/kiểm tra cho thấy kh�ng ảnh hưởng đến việc ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh.

CH� TH�CH: Việc x�c nhận gi� trị sử dụng phải được thực hiện theo c�c phần th�ch hợp của TCVN (ISO 16140) (tất cả c�c phần). Việc kiểm tra x�c nhận c�c mẫu tổng hợp c� thể được thực hiện theo quy tr�nh n�u trong TCVN 6707-1 (ISO 6887-1), Phụ lục D (quy tr�nh kiểm tra x�c nhận đối với mẫu tổng hợp về thử nghiệm định t�nh).

10.1.3 �Chuẩn bị dung dịch huyền ph� ITC tăng sinh chọn lọc bằng c�ch chuyển 10 ml huyền ph� PSB (10.1.2) v�o 90 ml canh thang ITC (B.3) v� trộn.

10.2 �Cấy trực tiếp l�n đĩa thạch chọn lọc

Lấy 1 ml huyền ph� PSB ban đầu chưa tăng sinh thu được (10.1.2) v�o hai đến bốn thạch đĩa CIN (B.6) v� d�n đều tr�n c�c đĩa, sử dụng bộ d�n mẫu (7.6).

Lật ngược c�c đĩa CIN v� đặt ch�ng v�o tủ ấm ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

CH� TH�CH 1: Trước khi ủ, c� thể cần l�m kh� c�c thạch đĩa CIN (v� dụ: trong tủ cấy tho�ng kh�) trong nửa giờ để hấp thụ ho�n to�n dịch cấy v�o thạch.

CH� TH�CH 2: Số lượng thạch đĩa CIN cần sử dụng phụ thuộc v�o mức dự kiến về hệ vi khuẩn nền trong mẫu.

10.3 �Tăng sinh

Ủ huyền ph� ban đầu trong PSB (10.1.2) v� canh thang tăng sinh chọn lọc ITC (10.1.3) ở 25 �C (7.2) trong 44 h � 4 h (kh�ng khuấy trộn).

10.4 �Cấy đĩa v� ủ ấm

10.4.1 �Cấy l�n thạch đĩa CIN m�i trường tăng sinh PSB v� ITC đ� xử l� bằng KOH

D�ng pipet v� tr�ng (7.5) chuyển 0,5 ml m�i trường tăng sinh PSB (10.3) v�o 4,5 ml dung dịch kali hydroxit (B.5) (được chuẩn bị trong ng�y sử dụng) trộn đều^[7]. Sau 20 s � 5 s bổ sung m�i trường tăng sinh PSB v�o dung dịch KOH, d�ng v�ng cấy (7.6) ria cấy l�n bề mặt thạch đĩa CIN (B.6) sao cho thu được c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ. Lặp lại quy tr�nh với m�i trường tăng sinh ITC (10.3).

CH� TH�CH 1: Điều quan trọng đối với hiệu năng của phương ph�p l� chuẩn bị KOH trong ng�y, trước khi sử dụng, xem Phụ lục B v� Phụ lục C.

Lật �p c�c đĩa CIN v� đặt v�o tủ ấm ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

CH� TH�CH 2: Ngo�i ra, c� thể ria cấy [d�ng v�ng cấy (7.6)] c�c thạch đĩa CIN với PSB v� ITC chưa xử l� (kh�ng xử l� với KOH).

CH� TH�CH 3: Trong qu� tr�nh xử l� KOH, m�i trường tăng sinh được pha lo�ng 10 lần. Ngo�i ra, việc xử l� c� thể l�m giảm số lượng vi khuẩn g�y bệnh Y. enterocolitica trong dung dịch. Do đ�, trong một số trường hợp, c� thể ria cấy đĩa thạch CIN bổ sung 0,1 ml dịch cấy.

10.4.2 �Cấy l�n thạch sinh m�u m�i trường tăng sinh PSB v� ITC xử l� bằng KOH (t�y chọn)

Lặp lại quy tr�nh trong 10.4.1 v� nu�i cấy, sau khi xử l� KOH, sử dụng v�ng cấy (7.6), ria cấy l�n bề mặt của đĩa thạch sinh m�u ^[9,13,18] sao cho thu được c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ.

Ủ c�c đĩa thạch sinh m�u theo hướng dẫn của nh� sản xuất.

10.5 �Nhận biết c�c khuẩn lạc điển h�nh

Sau khi ủ 24 h � 2 h, kiểm tra c�c đĩa CIN để ph�t hiện sự c� mặt c�c khuẩn lạc điển h�nh của Y. enterocolitica. N�n sử dụng k�nh hiển vi soi nổi (7.7) được trang bị đ�n chiếu s�ng truyền qua trường tối hoặc chếch một g�c 45�.

Tr�n thạch CIN, Y. enterocolitica g�y bệnh c� khuẩn lạc nhỏ (khoảng 1 mm hoặc nhỏ hơn), h�nh tr�n, bờ đều trơn nhẵn. C�c khuẩn lạc c� viền nhỏ m�u đỏ đậm, sắc n�t (�mắt b�) bao quanh. Viền bao quanh mờ hoặc đục v� khi kiểm tra với �nh s�ng truyền ch�o, c�c hạt nhỏ mịn v� kh�ng �ng �nh.

CH� TH�CH 1: �nh s�ng truyền qua trường tối hoặc xi�n g�c gi�p ph�n biệt c�c khuẩn lạc Yersinia enterocolitica điển h�nh so với c�c khuẩn lạc tương tự của c�c lo�i Yersinia kh�c ^[12] v� một số lo�i kh�ng phải Yersinia.

CH� TH�CH 2: Trong trường hợp hệ vi khuẩn nền mọc d�y đặc tr�n đĩa CIN, k�ch thước khuẩn lạc Y. enterocolitica g�y bệnh c� thể nhỏ hơn v� t�m đỏ điển h�nh c� thể kh�ng r� r�ng hoặc kh�ng c�.

10.6 �Khẳng định

10.6.1 �Y�u cầu chung

Cần sử dụng c�c chủng kiểm chứng của c�c lo�i Yersinia đặc biệt l� để ph�n biệt giữa Yersinia enterocolitica g�y bệnh v� c�c lo�i Yersinia kh�c tr�n thạch CIN. Cần sử dụng c�c chủng kiểm chứng �m v� kiểm chứng dương th�ch hợp cho mỗi ph�p thử khẳng định. C�c v� dụ th�ch hợp về c�c chủng kiểm chứng được n�u trong c�c phần li�n quan với c�c ph�p kiểm chứng n�y. Sơ đồ khẳng định được n�u trong H�nh A.2.

10.6.2 �Chọn c�c khuẩn lạc để khẳng định

Để khẳng định, lấy từ mỗi đĩa c�c m�i trường chọn lọc (xem 10.3), năm khuẩn lạc được coi l� điển h�nh của Y. enterocolitica g�y bệnh nếu c� sẵn (xem 10.5).

Ria cấy c�c khuẩn lạc đ� chọn l�n bề mặt thạch đĩa CIN (B.6) sao cho c� c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ. Đồng thời ria cấy c�c chủng Y. enterocolitica kiểm chứng typ huyết thanh sinh học (typ huyết thanh sinh học) 4/0:3; 2/0:9, typ sinh học 1A v� c�c lo�i Yersinia kh�c để so s�nh h�nh th�i khuẩn lạc.

Ngo�i ra, n�n ria cấy c�c khuẩn lạc điển h�nh để khẳng định v� c�c chủng kiểm chứng th�ch hợp tr�n thạch sinh m�u song song với ria cấy tr�n thạch CIN. Để nhận dạng c�c khuẩn lạc điển h�nh tr�n thạch sinh m�u, tiến h�nh theo hướng dẫn của nh� sản xuất về đ�nh gi� h�nh th�i điển h�nh của khuẩn lạc.

V� DỤ: C�c chủng Y. enterocolitica kiểm chứng ph� hợp l� WDCM 00216 (typ huyết thanh sinh học 4/0:3), WDCM 00215 (typ huyết thanh sinh học 2/0:9) v� WDCM 00160 (typ huyết thanh sinh học 1B/0:8).

Lật �p c�c đĩa v� đặt v�o tủ ấm c�i đặt ở nhiệt độ 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

Kiểm tra c�c đĩa đ� ủ c�c khuẩn lạc đặc trưng (xem 10.5) v� độ thuần khiết của chủng cấy. Điều n�y được thực hiện với sự trợ gi�p của k�nh hiển soi vi nổi (7.7). So s�nh h�nh th�i của c�c khuẩn lạc nghi ngờ với c�c khuẩn lạc của c�c chủng kiểm chứng để ph�n biệt r� hơn giữa c�c khuẩn lạc điển h�nh v� kh�ng điển h�nh. Loại bỏ c�c đĩa c� c�c khuẩn lạc kh�ng điển h�nh. Nếu tr�n đĩa c� khuẩn lạc điển h�nh v� kh�ng điển h�nh th� cấy truyền c�c khuẩn lạc điển h�nh l�n c�c thạch đĩa CIN (B.6) v� ủ như tr�n.

Tiến h�nh với một đĩa cấy thuần đại diện cho c�c khuẩn lạc điển h�nh ban đầu tr�n đĩa gốc. Giữ lại đĩa cấy c�c khuẩn lạc thuần điển h�nh kh�c (đến năm đĩa khuẩn lạc, nếu c�) để khẳng định trong trường hợp đĩa cấy đầu ti�n kh�ng khẳng định được. Ria cấy c�c khuẩn lạc đ� chọn l�n bề mặt thạch kh�ng chọn lọc (v� dụ: thạch dinh dưỡng (B.7), thạch m�u hoặc thạch trypton đậu tương) sao cho thu được c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ.

Lật �p c�c đĩa đ� cấy v� đặt v�o tủ ấm ở 30 �C (7.2) trong 18 h đến 24 h hoặc cho đến khi khuẩn lạc ph�t triển tốt.

Sử dụng c�c chủng cấy thuần để khẳng định sinh h�a v� để thử nghiệm t�nh g�y bệnh.

CH� TH�CH 1: Kh�ng bắt buộc phải khẳng định từ tất cả c�c bước tăng sinh tiếp theo nếu Y. enterocolitica g�y bệnh đ� được khẳng định ngay từ bước đầu.

CH� TH�CH 2: Đối với c�c mục đ�ch dịch tễ học hoặc trong qu� tr�nh điều tra dịch bệnh th� việc khẳng định c�c khuẩn lạc bổ sung, v� dụ: năm khuẩn lạc điển h�nh hoặc nghi ngờ từ mỗi m�i trường tăng sinh chọn lọc/kết hợp m�i trường ph�n lập, c� thể c� �ch.

10.6.3 �X�c định c�c lo�i Yersinia g�y bệnh

10.6.3.1 �Ph�t hiện urease

Ria cấy c�c khuẩn lạc l�n bề mặt nghi�ng của thạch (B.10). Nới lỏng nắp ống nghiệm sao cho kh�ng kh� c� thể đi v�o v� tạo điều kiện ph�t triển hiếu kh�.

Ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

M�u hồng t�m hoặc đỏ hồng l� phản ứng urease dương t�nh.

V� dụ: Chủng kiểm chứng dương t�nh ph� hợp l� WDCM 00216 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 4/0:3) hoặc WDCM 00160 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 1B/0:8).

M�u v�ng-cam l� phản ứng urease �m t�nh.

Giữ lại tất cả c�c khuẩn lạc urease dương t�nh v� c� h�nh th�i khuẩn lạc điển h�nh để khẳng định th�m.

CH� TH�CH 1: C�c chủng Y. enterocolitica g�y bệnh được cấy tr�n một số loại thạch ur� c� b�n sẵn c� thể cần th�m thời gian (l�n đến 7 ng�y) để cho phản dương t�nh.

CH� TH�CH 2: Cũng c� c�c chủng Y. enterocolitica g�y bệnh cho phản ứng urease �m t�nh, nhưng rất hiếm (0,01 %).

10.6.3.2 �Thủy ph�n esculin

Ria cấy vi khuẩn tr�n bề mặt thạch nghi�ng (B.12).

Ủ ấm ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

Sau khi ủ thấy c� quầng đen quanh c�c khuẩn lạc chứng tỏ phản ứng dương t�nh.

V� DỤ: Chủng kiểm chứng �m th�ch hợp l� WDCM 00216 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 4/0:3) hoặc WDCM 000160 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 1B/0:8) v� chủng kiểm chứng dương l� bất kỳ chủng Y. enterocolitica n�o c� typ sinh học 1A điển h�nh hoặc Y. intermedia WDCM 00217.

CH� TH�CH: Ph�p thử thủy ph�n esculin n�y tương đương với ph�p thử l�n men salicin trong việc x�c định khả năng g�y bệnh.

10.6.3.3 �Ph�t hiện plasmid độc lực (pYV) bằng ph�p thử tr�n thạch CR-MOX

Y.enterocolitica g�y bệnh li�n kết với đỏ Congo để h�nh th�nh c�c khuẩn lạc nhỏ như đầu đinh ghim (pin-point) điển h�nh ở 37 �C. Plasmid độc lực (pYV) x�c định c�c đặc điểm li�n quan đến khả năng g�y bệnh của Yersinia v� nhiều trong số đ�, kể cả sự ph�t triển phụ thuộc v�o canxi chỉ ở 37 �C.

Plasmid độc lực (pYV) c� thể tự m�t đi trong qu� tr�nh bảo quản tại ph�ng thử nghiệm, khi nu�i cấy l�u d�i v� c�c bước lặp lại. Do đ�, ph�p thử kiểm tra plasmid độc (thử nghiệm CR-MOX) phải được thực hiện ở giai đoạn khẳng định sớm.

Sử dụng v�ng cấy (7.6) lấy v�i khuẩn lạc của chủng cấy thuần đ� chọn để khẳng định tiếp (urease dương t�nh, h�nh th�i của khuẩn lạc điển h�nh). Cấy v�o bề mặt thạch CR-MOX (B.11) sao cho thu được c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ.

Ủ ấm ở 37 �C (7.2) trong khoảng từ 24 h đến 48 h.

Nếu cần, kiểm tra c�c đĩa dương t�nh c� chứa khuẩn lạc pYV sau 24 h v� ủ tiếp 24 h nữa, nếu chưa thấy c� khuẩn lạc dương t�nh.

Đĩa cho phản ứng dương t�nh c� chứa c�c khuẩn lạc nhỏ như đầu đinh ghim (li�n kết đỏ congo) sắc tố cam đỏ r� n�t (ph�t triển phụ thuộc v�o canxi ở 37 �C) v� c� thể l� c�c khuẩn lạc lớn hơn kh�ng m�u. Đĩa cho phản ứng �m t�nh chỉ chứa c�c khuẩn lạc kh�ng m�u.

CH� TH�CH 1: Trong dịch cấy thuần, th�ng thường một số khuẩn lạc c� chứa c�c tế b�o mang plasmid độc lực pYV, trong khi c�c khuẩn lạc kh�c trong c�ng mẻ cấy lại chứa c�c tế b�o kh�ng mang plasmid. Khi chuẩn bị dịch cấy cho thử nghiệm n�y, d�ng que cấy lấy v�i khuẩn lạc để tr�nh chỉ chọn phải c�c tế b�o vi khuẩn kh�ng mang plasmid.

CH� TH�CH 2: Để ph�n biệt r� hơn giữa c�c phản ứng dương t�nh v� �m t�nh, tốt nhất l� cấy song song hai đĩa CR-MOX từ c�ng một chủng cấy thử nghiệm v� ủ một đĩa ở 37 �C (7.2) v� một đĩa ở 25 �C (7.2 ). Đĩa ủ ở 25 �C (7.2) lu�n cho phản ứng �m t�nh (ngay cả khi ch�ng đ� c� chứa pYV). Do đ�, c� thể quan s�t r� sự kh�c nhau giữa kết quả dương t�nh được chứng nhận ở 37 �C (7.2) v� phản ứng �m t�nh ở 25 �C (7.2).

Kiểm chứng dương th�ch hợp l� bất kỳ chủng Y. enterocolitica g�y bệnh n�o đ� được kiểm tra x�c nhận mang plasmid độc, trước khi sử dụng.

V� DỤ: Chủng kiểm chứng dương th�ch hợp l� WDCM 00216 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 4/0:3) v� chủng kiểm chứng �m l� WDCM 00160 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 1B/0:8, plasmid tự do) hoặc WDCM 00217 (Y. intermedia).

V� plasmid độc lực (pYV) c� thể bị mất đi trong qu� tr�nh nu�i cấy truyền trong ph�ng thử nghiệm, n�n cần tiếp tục khẳng định với c�c chủng cho phản ứng �m t�nh trong ph�p thử.

Ngo�i ra, cần bảo quản c�c chủng dương bằng c�ch đ�ng lạnh chủng cấy gốc ở giai đoạn đầu của qu� tr�nh khẳng định [tốt nhất l� sau khi c� phản ứng urease dương t�nh (10.6.3.1) v� ph�p thử CR-MOX (10.6.3.3)].

V� dụ về bảo quản c�c chủng được n�u dưới đ�y (c� thể d�ng c�c phương ph�p bảo quản dịch cấy th�ch hợp kh�c):

- cấy truyền ngay từng dịch cấy thuần v�o TSB (B.8):

- ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h;

- th�m một thể t�ch tương đương của glycerol 40 % v� tr�ng (B.9) để c� được nồng độ glycerol cuối c�ng l� 20 %;

- trộn đều v� cấp đ�ng, tốt nhất ở -70 �C.

10.6.3.4 �Ph�t hiện pyrazinamidase

Cấy một v�ng cấy (7.6) đầy c�c khuẩn lạc l�n hết mặt thạch nghi�ng (B.13) của m�i trường. Ủ ở 30 �C (7.2) trong 48 h � 4 h.

Th�m 1 ml dung dịch sắt(II) amoni sulfat 1 % (B.14) mới chuẩn bị (trong ng�y sử dụng).

Nếu phản ứng dương t�nh, xuất hiện m�u n�u hồng trong v�ng 15 min cho thấy sự c� mặt axit pyrazinoic được h�nh th�nh do enzym pyrazinamidase.

V� DỤ: Chủng kiểm chứng �m th�ch hợp l� WDCM 00216 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 4/0:3) hoặc WDCM 000160 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 1B/0:8) v� chủng kiểm chứng dương l� bất kỳ chủng Y. enterocolitica c� typ sinh học 1A điển h�nh n�o hoặc Y. intermedia WDCM 00217.

CH� TH�CH: Khả năng c�c phản ứng dương t�nh giả tăng nếu sử dụng dung dịch sắt(II) amoni sulfat 1 % đ� chuẩn bị l�u ng�y.

10.6.3.5 �Ph�t hiện pyrazinamidase

Chủng cấy Yersinia g�y bệnh nếu cho phản ứng urease dương t�nh, esculin v� pyrazinamidase �m t�nh. Ngo�i ra, sự c� mặt của plasmid độc lực pYV (10.6.3.3) l� một dấu hiệu chắc chắn về khả năng g�y bệnh ^[10,14]. Để khẳng định Y. enterocolitica g�y bệnh, tiến h�nh theo 10.6.4.

10.6.4 �Khẳng định Y. enterocolitica g�y bệnh

10.6.4.1 �Y�u cầu chung

Sau khi x�c định Yersinia g�y bệnh tiến h�nh khẳng định Y. enterocolitica. Điều n�y chỉ cần nếu ph�p thử trong 10.6.3 cho thấy sự c� mặt của lo�i Yersinia g�y bệnh.

10.6.4.2 �Lysin decarboxylase v� arginin dihydrolase

D�ng que cấy (7.6) cấy vi khuẩn v�o từng m�i trường lỏng ở ngay dưới bề mặt (B.15). Nếu ống kh�ng đầy m�i trường v� kh�ng k�n kh� th� phủ bề mặt bằng dầu Vaselin^�2) n�ng chảy (được gia nhiệt sau đ� l�m nguội ngay sao cho vẫn giữ ở dạng lỏng) hoặc paraffin dạng lỏng v� tr�ng.

Ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

M�i trường c� m�u t�m sau khi ủ l� phản ứng dương t�nh.

M�i trường c� m�u v�ng l� phản ứng �m t�nh.

10.6.4.3 �Phenylalanin (tryptophan) deaminase

Cấy vi khuẩn l�n một khoảng rộng của bề mặt thạch nghi�ng (B.16) của m�i trường.

Ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

Nhỏ 2 giọt đến 3 giọt dung dịch sắt (III) clorua 10 % (B.17) l�n khuẩn lạc mọc tr�n bề mặt thạch nghi�ng.

Nếu thấy c� m�u xanh l� phản ứng dương t�nh.

10.6.4.4 �L�n men sucrose, sorbitol, rhamnose v� melibiose

Cấy vi khuẩn v�o từng m�i trường (B.18) ngay dưới bề mặt chất lỏng.

Ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

M�i trường c� m�u v�ng sau khi ủ l� phản ứng dương t�nh.

M�i trường c� m�u đỏ l� phản ứng �m t�nh.

10.6.4.5 �Sử dụng citrat (Simmon's citrate) (t�y chọn)

D�ng que cấy (7.6) lấy một khuẩn lạc ri�ng rẽ của một chủng được thử nghiệm v� trộn kỹ với một giọt dung dịch muối (B.4).

CH� TH�CH 1: Bước rửa bằng muối loại bỏ chất dinh dưỡng dư thừa từ m�i trường cấy v� hỗ trợ để tr�nh cho kết quả dương t�nh giả v� giải quyết sự cố. Việc ủ qu� l�u c� thể cũng g�y ra phản ứng dương t�nh giả.

CH� TH�CH 2: Ph�p thử c� thể cho phản ứng dương t�nh giả trong một số k�t thử nhận biết sinh h�a c� b�n sẵn.

Cấy huyền ph� l�n thạch (B.19) v� ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 � 2 h.

Phản ứng dương t�nh nếu c� vi khuẩn mọc v� m�i trường chuyển m�u xanh. Phản ứng c� m�u xanh mờ cũng được coi l� dương t�nh.

V� DỤ: Chủng kiểm chứng dương ph� hợp l� Y. intermedia WDCM 00217 (kiểm chứng dương) v� Y. enterocolitica WDCM 00216 (typ huyết thanh sinh học 4/0:3, kiểm chứng �m) hoặc WDCM 000160 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 1B/0:8, kiểm chứng �m).

CH� TH�CH 3: Ph�p thử n�y c� �ch trong việc ph�n biệt giữa Y. enterocolitica (phản ứng �m t�nh) v� nhiều lo�i c� li�n quan như Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. rohdei v� Y. aldovae (phản ứng dương t�nh v� phản ứng thay đổi).

10.6.4.6 �C�c ph�p thử khẳng định thay thế

Trong ph�p thử khẳng định khả năng g�y bệnh của Y. enterocolitica, c� thể thay c�c ph�p thử sinh h�a 10.6.3 v� 10.6.4 bằng ph�p thử PCR real-time nhằm v�o gen-ail theo TCVN 11924 (ISO/TS 18867) (xem H�nh A.2 v� T�i liệu tham khảo [6]). Tuy nhi�n, trong trường hợp phản ứng PCR real-time dương t�nh th� bắt buộc phải tiến h�nh ph�t hiện pyrazinamidase (10.6.3.4) để thu được kết quả thử nghiệm theo ti�u chuẩn n�y.

Nếu được chứng minh l� đ�ng tin cậy, c� thể sử dụng c�c bộ sưu tập thu nhỏ để nhận dạng sinh h�a của Y. enterocolitica [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. C�c bộ sưu tập n�y tối thiểu phải bao gồm c�c ph�p thử sinh h�a được quy định trong ti�u chuẩn n�y.

CH� TH�CH 1: C� thể d�ng c�c quy tr�nh thay thế để khẳng định chủng ph�n lập l� Y. enterocolitica, cung cấp t�nh ph� hợp của c�c quy tr�nh thay thế đ� được kiểm tra x�c nhận [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

CH� TH�CH 2: Một số quy tr�nh nhận biết thay thế c� thể x�c định kh�ng ch�nh x�c lo�i gần nhất của c�c lo�i Yersinia l� Y. enterocolitica.

10.6.5 �Diễn giải kết quả của c�c ph�p thử khẳng định Y. enterocolitica

Y. enterocolitica cho c�c kết quả theo Bảng 1.

Bảng 1 - Diễn giải kết quả c�c ph�p thử khẳng định đối với Yersinia enterocolitica

10.6.6 �Diễn giải c�c kết quả thử khẳng định đối với Y. enterocolitica g�y bệnh

Y. enterocolitica g�y bệnh được ph�t hiện nếu c� �t nhất một khuẩn lạc urease dương t�nh v� esculin v� pyrazinamidase �m t�nh (10.6.3.5) v� thể hiện c�c đặc t�nh của Y. enterocolitica n�u trong Bảng 1 (10.6.5).

Đối với việc diễn giải kết quả của PCR real-time (khẳng định lựa chọn thay thế), xem Phụ lục A, H�nh A.2 v� TCVN 11924 (ISO/TS 18867).

10.7 �Đ�nh gl� typ sinh học của Y. enterocolitica (t�y chọn)

10.7.1 �Y�u cầu chung

Ngo�i c�c ph�p thử esculin (10.6.3.2) v� pyrazinamidase (10.6.3.4), qu� tr�nh đ�nh gi� typ sinh học ho�n chỉnh bao gồm c�c ph�p thử xylose, tween-esterase/lipase, salicin (t�y chọn), trehalose v� indole.

Sử dụng c�c chủng kiểm chứng th�ch hợp cho mỗi lần thử trong đ�nh gi� typ sinh học.

V� DỤ: Chủng kiểm chứng dương t�nh th�ch hợp cho tất cả c�c ph�p thử l� bất kỳ chủng Y. enterocolitica n�o c� typ sinh học 1A điển h�nh. Y. enterocolitica WDCM 000160 (typ sinh học 1B/0:8) ph� hợp cho kiểm chứng dương đối với tất cả c�c ph�p thử kh�c (10.7.1 đến 10.7.4) trừ ph�p thử salicin (10.7.3). Y. intermedia WDCM 00217 th�ch hợp l�m kiểm chứng dương t�nh cho tất cả c�c ph�p thử kh�c (10.7.1 đến 10.7.4) trừ ph�p thử tween-esterase (10.7.2). Một v� dụ kh�c về chủng kiểm chứng �m th�ch hợp cho c�c ph�p thử xylose (10.7.1), tween-esterase (10.7.2), salicin (10.7.3) v� indole (10.7.4) l� WDCM 00216 (Y. enterocolitica, typ huyết thanh sinh học 4/0:3).

10.7.2 �L�n men xylose

Cấy vi khuẩn v�o m�i trường (B.18) ngay dưới bề mặt của chất lỏng.

Ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

M�i trường c� m�u v�ng sau khi ủ l� phản ứng dương t�nh.

M�i trường c� m�u đỏ l� phản ứng �m t�nh.

10.7.3 �Ph�p thử tween-esterase

Ria cấy vi khuẩn l�n bề mặt của đĩa thạch (B.20).

Ủ ở 25 �C (7.2) trong 44 h � 4 h.

Phản ứng l� dương t�nh nếu xuất hiện quầng mờ đục kết tủa (do c�c tinh thể canxi oleate).

CH� TH�CH: Một số chủng Y. enterocolitica c� khả năng g�y bệnh điển h�nh typ sinh học 1B c� thể cho phản ứng dương t�nh chậm hoặc yếu trong thử nghiệm tween-esterase. Phản ứng dương t�nh của ch�ng c� thể quan s�t tốt hơn trong m�i trường thạch l�ng đỏ trứng (ph�p thử lipase) ^[11].

10.7.4 �L�n men salicin (t�y chọn) v� trehalose

Cấy vi khuẩn v�o từng m�i trường (B.18) ngay dưới bề mặt của chất lỏng.

Ủ ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

M�i trường c� m�u v�ng sau khi ủ l� phản ứng dương t�nh.

M�i trường c� m�u đỏ l� phản ứng �m t�nh.

10.7.5 �H�nh th�nh indole

Cấy vi khuẩn v�o ống m�i trường trypton/tryptophan (B.21). Sử dụng �t nhất năm khuẩn lạc để nu�i cấy.

Ủ ở 30 �C (7.2) trong 48 h � 4 h.

Nhỏ 1 ml thuốc thử Kovac (B.22) v� để ở nhiệt độ ph�ng từ 10 min đến 15 min.

M�i trường c� m�u đỏ l� phản ứng dương t�nh.

M�i trường c� m�u v�ng/n�u l� phản ứng �m t�nh.

10.7.6 �Diễn giải thử nghiệm typ sinh học

Dựa v�o ph�p thử esculin (10.6.3.2), pyrazinamidase (10.6.3.4) v� c�c ph�p thử xylose, tween-esterase (lipase), trehalose v� indole (10.7.2 đến 10.7.5). C�c chủng Y. enterocolitica c� thể được chia th�nh c�c typ sinh học (Bảng 2). Theo c�c phản ứng của ph�p thử, c�c chủng Y. enterocolitica được coi l� g�y bệnh nếu ch�ng thuộc c�c typ sinh học 1B, 2, 3, 4 hoặc 5. C� thể thực hiện c�c ph�p thử sinh h�a bổ sung.

Đối với mục đ�ch dịch tễ học, cần x�c định c�c kh�ng nguy�n somatic của Y. enterocolitica. C�c chủng g�y bệnh c� typ huyết thanh thường gặp l� c�c typ huyết thanh 0:3, 0:8, 0:9 hoặc 0:5,27 khi sử dụng kh�ng huyết thanh th�ch hợp.

Nếu c�c ph�p thử esculin, xylose v� pyrazinamidase cho phản ứng �m t�nh th� kết quả cho thấy typ sinh học 4. Điều n�y c� thể được khẳng định bằng c�ch x�c định typ huyết thanh v� typ huyết thanh sinh học 4/0:3 chiếm tỷ lệ cao nhất ở nhiều quốc gia ^[8].

Bảng 2 - C�c typ huyết thanh của Yersinia enterocolitica

11 �Biểu thị kết quả

Theo diễn giải kết quả cho thấy Yersinia enterocolitica g�y bệnh được ph�t hiện hoặc kh�ng ph�t hiện c� trong phần mẫu thử x g hoặc x ml sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)], hoặc tr�n một diện t�ch bề mặt hoặc trong tăm b�ng.

12 �Đặc t�nh hiệu năng của phương ph�p

12.1 �Nghi�n cứu li�n ph�ng

C�c đặc t�nh hiệu năng của phương ph�p được x�c định trong một nghi�n cứu li�n ph�ng (hoặc c�c nghi�n cứu) để x�c định độ đặc hiệu, độ đ�p ứng v� LOD₅₀ của phương ph�p. Dữ liệu được thống k� trong Phụ lục C. C�c gi� trị thu được từ nghi�n cứu li�n ph�ng n�y c� thể kh�ng �p dụng được cho c�c loại thực phẩm kh�c với c�c loại thực phẩm n�u trong Phụ lục C.

12.2 �Độ đ�p ứng

Độ đ�p ứng được x�c định l� số mẫu dương t�nh t�m thấy được chia cho số mẫu dương t�nh thực được thử nghiệm ở mức nhiễm đ� n�u. Do đ�, c�c kết quả phụ thuộc v�o mức nhiễm của mẫu.

12.3 �Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu được x�c định l� số mẫu �m t�nh t�m thấy được chia cho số lượng mẫu �m t�nh thực (hoặc mẫu trắng) được thử nghiệm.

12.4 �LOD₅₀

LOD₅₀ l� nồng độ (cfu/mẫu) m� x�c suất ph�t hiện l� 50 %.

13 �B�o c�o kết quả thử nghiệm

B�o c�o thử nghiệm phải ghi r�:

- phương ph�p thử đ� sử dụng, viện dẫn ti�u chuẩn n�y;

- phương ph�p lấy mẫu đ� sử dụng, nếu biết;

- cỡ phần mẫu thử v�/hoặc bản chất của mẫu được kiểm tra;

- mọi chi tiết thao t�c kh�ng quy định trong ti�u chuẩn n�y, hoặc t�y chọn c�ng với c�c chi tiết bất thường kh�c c� thể ảnh hưởng tới kết quả;

- mọi thay đổi về m�i trường hoặc điều kiện ủ được sử dụng;

- mọi th�ng tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- c�c kết quả thử nghiệm thu được;

- ng�y thử nghiệm.

B�o c�o kết quả cũng phải n�u r� nếu c�c ph�p thử tiếp theo phải được hoặc đ� được thực hiện trong ph�ng thử nghiệm chuẩn, nếu sẵn c� th� n�u c�c kết quả thu được.

14 �Bảo đảm chất lượng

Ph�ng thử nghiệm phải c� một hệ thống kiểm so�t chất lượng được x�c định r� r�ng để đảm bảo rằng thiết bị, thuốc thử v� kỹ thuật th�ch hợp cho c�c ph�p thử. Việc sử dụng c�c kiểm chứng dương t�nh, kiểm chứng �m t�nh v� mẫu trắng l� một phần của ph�p thử. Việc kiểm tra hiệu năng của m�i trường nu�i cấy được quy định trong B.23 v� trong TCVN 8128 (ISO 11133)].

Phụ lục A

(Quy định)

Sơ đồ quy tr�nh

H�nh A.1 - Sơ đồ quy tr�nh ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh trong c�c mẫu thực phẩm, thức ăn chăn nu�i v� m�i trường

CH� TH�CH: PCR real-time gen đu�i đ�ch c� thể được sử dụng để s�ng lọc mẫu dương trong canh thang PSB sau khi ủ 24 h � 2h ở 25 �C (7.2). Xem TCVN 11924 (ISO/TS 18867) về quy tr�nh chi tiết.

H�nh A.2 - Sơ đồ khẳng định Y. enterocolitica g�y bệnh

Phụ lục B

(Quy định)

Th�nh phần v� c�ch chuẩn bị m�i trường nu�i cấy v� thuốc thử

B.1 �Y�u cầu chung

C�c quy định chung của TCVN 8128 (ISO 11133) c� thể �p dụng để chuẩn bị v� kiểm tra hiệu năng của m�i trường nu�i cấy n�u trong phụ lục n�y. Nếu m�i trường nu�i cấy hoặc thuốc thử được chuẩn bị từ c�c m�i trường/thuốc thử ho�n chỉnh kh� hoặc sử dụng c�c m�i trường/thuốc thử b�n sẵn để sử dụng, th� thực hiện theo hướng dẫn của nh� sản xuất về việc chuẩn bị, điều kiện bảo quản, hạn sử dụng v� c�ch sử dụng.

Thời hạn sử dụng của c�c m�i trường được n�u trong phụ lục n�y đ� được n�u trong một số nghi�n cứu. Người sử dụng phải x�c nhận lại hạn sử dụng trong điều kiện bảo quản của m�nh [xem TCVN 8128 (ISO 11133)].

Thử nghiệm hiệu năng về đảm bảo chất lượng của m�i trường nu�i cấy được n�u trong B.23.

B.2 �Canh thang pepton, sorbitol v� muối mật (PSB)

B.2.1 �Th�nh phần

B.2.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng nếu cần. Chỉnh pH để sau khi khử tr�ng, pH l� 7,6 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường v�o c�c ống nghiệm hoặc b�nh (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp cho c�c mẫu thử (xem 10.1.2).

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.3 �Canh thang Irgasan�, ticarcillin v� kali clorat (ITC); canh thang triclosan, ticarcillin clorat (TTC)

B.3.1 �M�i trường cơ bản

B.3.1.1 �Th�nh phần

B.3.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường cơ bản kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 6,9 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường cơ bản v�o c�c b�nh cầu (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp để thu được c�c lượng cần thiết (v� dụ: 988 ml đối với 1 l m�i trường ho�n chỉnh).

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.3.2 �Dung dịch Ticarcillin (1 mg/ml)

B.2.2.1 �Th�nh phần

B.3.2.2 �Chuẩn bị

H�a tan ticarcillin trong nước. Lọc để khử tr�ng.

B.3.3 �Dung dịch triclosan (Irasan�) [5-clo-2-(2,4-diclorophenoxy)phenol] trong etanol (1 mg/ml)

B.3.3.1 �Th�nh phần

B.3.3.2 �Chuẩn bị

H�a tan triclosan trong etanol khi cần d�ng hoặc dung dịch n�y được bảo quản ở khoảng -20 �C trong kh�ng qu� 4 tuần.

B.3.4 �Dung dịch kali clorat (100 mg/ml)

B.3.4.1 �Th�nh phần

B.3.4.2 �Chuẩn bị

H�a tan kali clorat trong nước. Lọc để khử tr�ng.

B.3.5 �M�i trường ho�n chỉnh

B.3.5.1 �Th�nh phần

B.3.5.2 �Chuẩn bị

Cho ticarcillin, triclosan v� dung dịch kali clorat một c�ch v� tr�ng v�o m�i trường cơ bản đ� được l�m nguội đến 47 �C v� trộn đều.

Ph�n phối 90 ml m�i trường n�y một c�ch v� tr�ng v�o c�c b�nh cầu c� dung t�ch th�ch hợp (xem 10.1.3), sao cho thu được tỷ lệ diện t�ch/thể t�ch l� tối thiểu (kỵ kh� tương đối).

B.4 �Dung dịch muối

B.4.1 �Th�nh phần

B.4.2 �Chuẩn bị

H�a tan natri clorua trong nước.

Ph�n phối dung dịch v�o c�c b�nh cầu (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.5 �Kali hydroxit (KOH) trong dung dịch muối

B.5.1 �Th�nh phần

B.5.2 �Chuẩn bị

H�a tan kali hydroxit trong dung dịch muối v� tr�ng.

Ph�n phối dung dịch v�o c�c b�nh cầu (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Chuẩn bị dung dịch KOH trong ng�y sử dụng.

B.6 �Thạch cefsulodin, Irgasan� (triclosan) v� novobioxin (CIN)

B.6.1 �M�i trường cơ bản

B.6.1.1 �Th�nh phần

B.6.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường cơ bản kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 7,4 � 0,2 ở 25 �C nếu cần.

Ph�n phối m�i trường v�o c�c b�nh cầu (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp để thu được c�c phần cần thiết (v� dụ: 997 ml cho 1 l�t m�i trường ho�n chỉnh).

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.6.2 �Dung dịch cefsulodin (15 mg/ml)

B.6.2.1 �Th�nh phần

B.6.2.2 �Chuẩn bị

H�a tan cefsulodin trong nước. Lọc để khử tr�ng.

B.6.3 �Dung dịch Triclosan (Igrasan�) [5-cloro-2-(2,4-diclorophenoxy)phenol] trong etanol (4 mg/ml)

B.6.3.1 �Th�nh phần

B.6.3.2 �Chuẩn bị

H�a tan triclosan trong etanol khi cần d�ng hoặc dung dịch n�y được bảo quản ở khoảng - 20 �C trong kh�ng qu� 4 tuần.

B.6.4 �Dung dịch novobiocin (2,5 mg/ml)

B.6.4.1 �Th�nh phần

B.6.4.2 �Chuẩn bị

H�a tan novobiocin trong nước. Lọc để khử tr�ng.

B.6.5 �M�i trường ho�n chỉnh

B.6.5.1 �Th�nh phần

B.6.5.2 �Chuẩn bị

Cho từng dung dịch kh�ng sinh n�y một c�ch v� tr�ng v�o m�i trường cơ bản đ� được l�m nguội đến khoảng 45 �C v� trộn đều.

B.6.5.3 �Chuẩn bị c�c thạch đĩa CIN

R�t khoảng 15 ml m�i trường ho�n chỉnh v�o c�c đĩa Petri v� tr�ng (7.4). Để y�n c�c đĩa.

B.7 �Thạch dinh dưỡng (v� dụ về m�i trường kh�ng chọn lọc)

B.7.1 �Th�nh phần

^a T�y thuộc v�o sức đ�ng của thạch.

B.7.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun s�i.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 7,0 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường v�o c�c b�nh cầu (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.7.3 �Chuẩn bị c�c đĩa thạch dinh dưỡng

R�t khoảng 15 ml m�i trường đ� l�m nguội đến khoảng 45 �C v�o c�c đĩa Petri v� tr�ng (7.3). Để y�n c�c dĩa.

B.8 �Canh thang đậu tương tryptic (TSB) (canh thang đậu tương trypton, m�i trường thủy ph�n casein đậu tương)

B.8.1 �Th�nh phần

B.8.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun s�i, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 7,3 + 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường với c�c lượng 10 ml v�o c�c ống nghiệm (7.3).

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực ở nhiệt độ 121 � C.

B.9 �Glycerol v� tr�ng

Ph�n phối 100 ml glycerol v�o c�c ống nghiệm hoặc b�nh cầu (7.3) v� khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.10 �Thạch ure (Christensen)

B.10.1 �M�i trường cơ bản

B.10.1.1 �Th�nh phần

B.10.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 6,8 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.10.2 �Dung dịch ure

B.10.2.1 �Th�nh phần

B.10.2.2 �Chuẩn bị

H�a tan ure trong nước. Lọc để khử tr�ng.

B.10.3 �M�i trường ho�n chỉnh

B.10.3.1 �Th�nh phần

B.10.3.2 �Chuẩn bị

Cho dung dịch ure một c�ch v� tr�ng v�o m�i trường cơ bản đ� được l�m nguội đến khoảng 44 �C đến 47 �C.

Ph�n phối c�c lượng 10 ml m�i trường ho�n chỉnh v�o c�c ống nghiệm (7.3) v� tr�ng.

Để c�c ống ở tư thế nghi�ng.

B.11� Thạch đỏ congo magie oxalat (CR-MOX)

B.11.1 �M�i trường cơ bản

B.11.1.1 �Th�nh phần

B.11.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường cơ bản kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH của m�i trường ho�n chỉnh l� 7,3 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

B.11.2 �Dung dịch đỏ congo (25 mg/ml)

B.11.2.1 �Th�nh phần

B.11.2.2 �Chuẩn bị

H�a tan đỏ congo trong nước.

CH� TH�CH: Dung dịch đỏ congo c� thể được bảo quản trong chai thủy tinh tối m�u đến 1 năm.

B.11.3 �M�i trường ho�n chỉnh

B.11.3.1 �Th�nh phần

B.11.3.2 �Chuẩn bị

Cho dung dịch đỏ congo v�o m�i trường cơ bản v� trộn.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.11.3.3 �Chuẩn bị c�c đĩa thạch CR-MOX

R�t khoảng 25 ml m�i trường ho�n chỉnh đ� l�m nguội đến khoảng 47 �C v�o c�c đĩa Petri (7.4) v� tr�ng. Để y�n c�c đĩa.

B.12 �Thạch mật b� v� esculin

B.12.1 �Th�nh phần

B.12.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun s�i nhẹ.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng l� 6,6 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường với c�c lượng 10 ml v�o c�c ống nghiệm (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

Để nghi�ng ống nghiệm sao cho thu được phần mặt thạch nghi�ng d�i 2,5 cm.

B.13 �Thạch casein-đậu tương để ph�t hiện pyrazinamidase

B.13.1 �Th�nh phần

B.13.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun s�i.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng l� 7,3 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường với c�c lượng 10 ml v�o c�c b�nh (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) c�i đặt ở nhiệt độ 121 �C.

Sau khi khử tr�ng, để nghi�ng ống nghiệm sao cho thu được phần mặt thạch nghi�ng d�i nhất.

B.14 �Dung dịch amoni sắt(II) sulfat để ph�t hiện pyrazinamidase

B.14.1 �Th�nh phần

B.14.2 �Chuẩn bị

Ngay trước khi sử dụng, h�a tan amoni sắt (II) sulfat trong nước.

B.15 �M�i trường decarboxylase (lyzin hoặc arginin)

B.15.1 �Th�nh phần

B.15.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 6,8 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường n�y với c�c lượng từ 2 ml đến 5 ml v�o c�c ống nghiệm (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.16 �Thạch phenylalanin (tryptophan) deaminase

B.16.1 �Th�nh phần

B.16.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần tr�n trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 7,3 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường n�y với c�c lượng 5 ml v�o c�c ống nghiệm (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

Để y�n ở vị tr� nghi�ng.

B.17 �Sắt (III) clorua, 10 %

B.17.1 �Th�nh phần

B.17.2 �Chuẩn bị

H�a tan sắt(III) clorua trong nước.

B.18 �M�i trường l�n men cacbohydrat (nước pepton với đỏ phenol v� cacbohydrat)

B.18.1 �M�i trường cơ bản

B.18.1.1 �Th�nh phần

B.18.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường cơ bản kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng l� 6,8 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường cơ bản n�y v�o c�c b�nh cầu (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 10 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.18.2 �Dung dịch cacbohydrat (melibiose, rhamnose, salicin, sorbitol, sucrose, trehalose hoặc xylose, 100 mg/ml)

B.18.2.1 �Th�nh phần

B.18.2.2 �Chuẩn bị

Chuẩn bị ri�ng rẽ từng dung dịch cacbohydrat bằng c�ch cho từng chất v�o nước cất.

Lọc để khử tr�ng.

B.18.3 �M�i trường ho�n chỉnh

B.18.3.1 �Th�nh phần

B.18.3.2 �Chuẩn bị

Đối với từng cacbon hydrat, th�m một c�ch v� tr�ng dung dịch cacbohydrat v�o m�i trường cơ bản đ� l�m nguội đến khoảng 45 �C v� trộn đều.

Ph�n phối m�i trường ho�n chỉnh một c�ch v� tr�ng với c�c lượng 10 ml v�o c�c ống nghiệm hoặc chai (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

B.19 �M�i trường Simmon xitrat

B.19.1 �Th�nh phần

B.19.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun s�i.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 6,8 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.19.3 �Chuẩn bị c�c đĩa Simmon xitrat

R�t khoảng 15 ml m�i trường đ� để nguội đến khoảng 45 �C v�o c�c đĩa Petri v� tr�ng (7.4). Để y�n c�c đĩa.

B.20 �M�i trường thử Tween-esterase

B.20.1 �M�i trường cơ bản

B.20.1.1 �Th�nh phần

B.20.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần tr�n trong nước bằng c�ch đun s�i, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 7,4 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Khử tr�ng 30 min trong nồi hấp �p lực ở nhiệt độ 121 �C.

B.20.2 �M�i trường ho�n chỉnh

B.20.2.1 �Th�nh phần

^a Tween 80� l� một v� dụ về sản phẩm th�ch hợp b�n sẵn. Th�ng tin n�y đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng ti�u chuẩn v� kh�ng ấn định phải sử dụng ch�ng.

B.20.2.2 �Chuẩn bị

Cho sorbitol mono-oleat v�o m�i trường lỏng cơ bản v� trộn đều.

Khử tr�ng 30 min trong nồi hấp �p lực c�i đặt ở nhiệt độ 110 �C.

B.20.3 �Chuẩn bị c�c đĩa tween-esterase

Ph�n phối 15 ml m�i trường ho�n chỉnh đ� l�m nguội đến 45 �C v�o c�c đĩa Petri (7.4) v� tr�ng. Để y�n đĩa.

B.21 �M�i trường trypton/tryptophan

B.21.1 �Th�nh phần

B.21.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần trong nước bằng c�ch đun s�i, nếu cần

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 7,5 � 0,2 ở 25 �C.

Ph�n phối m�i trường với c�c lượng 5 ml v�o c�c ống nghiệm hoặc chai (7.3) c� dung t�ch th�ch hợp.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

B.22 �Thuốc thử Kovac

B.22.1 �Th�nh phần

B.22.2 �Chuẩn bị

H�a tan 4-dimetylaminobenzaldehyt trong 2-metylbutan-2-ol để trong nồi c�ch thủy ở 60 �C.

L�m nguội đến nhiệt độ ph�ng rồi đặt b�nh cầu v�o bể nước đ�. Sau đ� th�m cẩn thận axit clohyric, trộn từ từ.

Bảo quản ở 3 �C � 2 �C, trong chai m�u n�u. Kh�ng sử dụng chai c� n�t đậy bằng cao su v� sẽ l�m hỏng thuốc thử.

B.23 �Thử nghiệm hiệu năng về đảm bảo chất lượng của m�i trường nu�i cấy

Xem Bảng B.1. về định nghĩa t�nh chọn lọc v� năng suất, xem TCVN 8128 (ISO 11133). Thể t�ch chất cấy phải giống lượng được sử dụng trong phương ph�p đối với m�i trường đ� v� cần chứa một lượng sinh vật đ�ch hoặc kh�ng phải sinh vật đ�ch như quy định trong 5.4 của TCVN 8128 (ISO 11133).

Bảng B.1 - Ph�p thử hiệu năng để đảm bảo chất lượng của m�i trường nu�i cấy

Phụ lục C

(Tham khảo)

C�c nghi�n cứu x�c nhận gi� trị sử dụng v� đặc t�nh hiệu năng của phương ph�p

Một nghi�n cứu li�n ph�ng gồm 13 đến 14 ph�ng thử nghiệm ở 5 quốc gia thực hiện. C�c loại thực phẩm sau đ�y đ� bao gồm trong c�c nghi�n cứu: sữa tươi, thịt xay v� rau diếp. C�c mẫu thực phẩm n�y được thử nghiệm ở hai mức nhiễm kh�c nhau, c�ng với mẫu kiểm so�t �m t�nh. Nghi�n cứu n�y được tổ chức v�o năm 2013 đến năm 2014 do Cơ quan An to�n Thực phẩm Phần Lan Evira được Ủy ban ch�u �u t�i trợ.

C�c mẫu đ� bị l�m nhiễm trong c�c v�ng nghi�n cứu kh�c nhau với chủng Y. enterocolitica typ huyết thanh sinh học 4/0:3 (c�c mẫu sữa tươi nguy�n liệu) v� hai chủng kh�c nhau của Y. enterocolitica typ huyết thanh sinh học 2/0:9 (thịt băm v� rau diếp).

Thực hiện theo quy tr�nh (xem Phụ lục A) v� tất cả c�c chi tiết thực hiện theo ti�u chuẩn n�y. C�c gi� trị của c�c đặc t�nh hiệu năng đối với từng loại mẫu, bắt nguồn từ nghi�n cứu li�n ph�ng thử nghiệm n�y được thể hiện trong c�c Bảng C.1 đến C.3. Dữ liệu thu được bởi một số cộng t�c vi�n đ� bị loại ra khỏi c�c ph�p t�nh to�n chỉ v� c�c l� do kỹ thuật đ� được x�c định r� (sai lệch so với quy tr�nh).

Trong nghi�n cứu li�n ph�ng, việc khẳng định bằng c�ch sử dụng cả hai c�ch thay thế (xem h�nh A.2) đ� được x�c nhận gi� trị sử dụng bằng c�ch so s�nh. Đối với điều n�y, c�c cộng t�c vi�n đ� sử dụng TCVN 11924:2017 (ISO/TS 18867:2015), Phụ lục B, Phương ph�p 1 hoặc Phương ph�p 2 v� thử nghiệm pyrazinamidase (10.6.3.4) song song với c�ch khẳng định bằng sinh h�a (10.6). Kết quả được thống k� trong Bảng C.4. Kết quả ph� hợp thu được từ 410 ph�p thử khẳng định song song.

Bảng C.1 - Kết quả ph�n t�ch số liệu thu được với sữa tươi nguy�n liệu

Bảng C.2 - Kết quả ph�n t�ch dữ liệu thu được với mẫu thịt băm

Bảng C.3 - Kết quả ph�n t�ch dữ liệu thu được với mẫu rau diếp

Bảng C.4 - Kết quả khẳng định Y. enterocolitica g�y bệnh sử dụng c�c phương ph�p thay thế^a

Phụ lục D

(Tham khảo)

Quy tr�nh tăng sinh lạnh

D.1 �Giới thiệu

Quy tr�nh tăng sinh lạnh n�u trong Phụ lục n�y c� thể được sử dụng để bổ sung cho quy tr�nh chung trong c�c điều tra, chẳng hạn như trong c�c vụ ngộ độc thực phẩm. C� thể sử dụng canh thang CEB (D.3.1) hoặc PSB (B.2).

H�nh D.1 - Sơ đồ quy tr�nh tăng sinh lạnh

CH� TH�CH: C� thể được sử dụng PCR Real-time nhắm v�o gen ail đ�ch để s�ng lọc c�c mẫu dương t�nh trong canh thang PSB sau khi ủ 24 h ở 25 ⁰C. Xem TCVN 11924 (ISO/TS 18867) để biết chi tiết về quy tr�nh.

D.2 �Ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh bằng tăng sinh lạnh

D.2.1 �Phần mẫu thử v� huyền ph� ban đầu

Xem phần li�n quan của TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả c�c phần) hoặc bất kỳ ti�u chuẩn cụ thể kh�c ph� hợp với sản phẩm c� li�n quan.

Để chuẩn bị huyền ph� ban đầu, trong trường hợp chung, sử dụng như dịch pha lo�ng m�i trường tiền tăng sinh trong D.3.1 (CEB) hoặc B.2 (PSB).

Nh�n chung, một lượng phần mẫu thử (khối lượng hoặc thể t�ch) được th�m v�o một lượng CEB hoặc PSB (khối lượng hoặc thể t�ch) để thu được độ pha lo�ng mười lần. Đối với điều n�y, một phần mẫu thử 25 g được trộn với 225 ml CEB hoặc PSB.

Đồng h�a huyền ph�, tốt nhất l� sử dụng m�y trộn nhu động (7.8) trong 1 min.

D.2.2 �Nu�i cấy trực tiếp tr�n thạch chọn lọc

Xem 10.2.

D.2.3 �Tăng sinh

Ủ huyền ph� ban đầu của CEB hoặc PSB (D.2.1) ở 4 �C trong 22 ng�y � 1 ng�y.

D.2.4 �Tăng sinh lần thứ hai

Sau 8 ng�y � 1 ng�y v� 22 ng�y � 1 ng�y ủ CEB hoặc PSB (D.2.1), chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh thang MRB (D.3.2) v� ủ ở 25 �C trong 4 ng�y.

D.2.5 �Nu�i cấy tr�n đĩa thạch v� ủ đĩa

D.2.5.1 �Y�u cầu chung

Sau khi ủ m�i trường tăng sinh (D.2.3 v� D.2.4), tiến h�nh như sau:

CH� TH�CH: C� thể sử dụng c�c đĩa bổ sung như m�i trường thạch sinh m�u để ph�t hiện Y. enterocolitica g�y bệnh ^[9,13,18].

D.2.5.2 �Nu�i cấy từ CEB hoặc PSB c� xử l� KOH tr�n thạch CIN

Sau 14 ng�y � 1 ng�y v� 22 ng�y � 1 ng�y ủ ở 4 �C, sử dụng pipet v� tr�ng (7.5) chuyển 0,5 ml dịch tăng sinh CEB hoặc PSB (D.2.3) v�o 4,5 ml dung dịch KOH (B.5) (chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) v� trộn đều ^[7]. Sau khi để 20 s � 5 s dịch tăng sinh CEB hoặc PSB v�o dung dịch KOH, ria cấy sử dụng v�ng cấy (7.6) l�n mặt thạch đĩa CIN (B.6) sao cho thu được c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ.

CH� TH�CH 1: C�c kết quả tốt nhất thu được bằng c�ch sử dụng dung dịch KOH đ� chuẩn bị một ng�y trước đ�.

CH� TH�CH 2: Trong qu� tr�nh xử l� kiềm, dịch tăng sinh được l�m lo�ng 10 lần. Ngo�i ra, việc xử l� n�y c� thể l�m giảm số lượng Y. enterocolitica g�y bệnh trong dịch cấy. Do đ�, trong một số trường hợp cấy th�m một đĩa CIN với 0,1 ml dịch cấy.

D.2.5.3 �Nu�i cấy từ CEB hoặc PSB kh�ng xử l� KOH

Sau 14 ng�y � 1 ng�y v� 22 ng�y � 1 ng�y ủ ở 4 �C, d�ng v�ng cấy v� tr�ng (7.6) cấy một ăng dịch tăng sinh CEB hoặc PSB (D.2.3) l�n mặt thạch đĩa CIN (B.6) sao cho thu được c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ.

D.2.5.4 �Nu�i cấy đĩa từ lần tăng sinh thứ hai (MRB)

Sau khi ủ 4 ng�y trong lần tăng sinh thứ hai MRB (D.2.4), sử dụng pipet (7.5) v� tr�ng lấy 0,1 ml dịch cấy MRB nhỏ l�n bề mặt đĩa thạch (CIN) (B.6) v� d�ng tăm b�ng hoặc bộ d�n mẫu (7.6) d�n đều dịch cấy sao cho thu được c�c khuẩn lạc ri�ng rẽ.

D.2.5.5 �Ủ c�c đĩa

Lật �p c�c đĩa (D.2.5.2 đến D.2.5.4) v� đặt v�o tủ ấm (7.2) ở 30 �C (7.2) trong 24 h � 2 h.

D.2.6 �Nhận dạng c�c khuẩn lạc điển h�nh

Xem 10.5.

D.2.7 �Khẳng định Y. enterocolitica g�y bệnh

Xem 10.6 v� H�nh A.2.

D.2.8 �X�c định typ sinh học của Y. enterocolitica

Xem 10.7.

D.3 �M�i trường nu�i cấy

D.3.1 �Canh thang tăng sinh lạnh (CEB)

D.3.1.1 �Th�nh phần

D.3.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH l� 7,6 � 0,2 ở 25 �C, nếu cần.

Ph�n phối m�i trường n�y v�o c�c vật chứa c� dung t�ch th�ch hợp để thu được c�c phần mẫu thử th�ch hợp (xem D.3.1).

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

D.3.2 �M�i trường canh thang rappaport cải biến (MRB) bằng magie clorua

D.3.2.1 �M�i trường cơ bản

D.3.2.1.1 �Th�nh phần

D.3.2.1.2 �Chuẩn bị

H�a tan c�c th�nh phần hoặc m�i trường ho�n chỉnh kh� trong nước bằng c�ch đun n�ng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử tr�ng pH của m�i trường ho�n chỉnh l� 5,8 � 0,1 ở 25 �C, nếu cần.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

D.3.2.2 �Dung dịch magie clorua (0,4 g/ml)

D.3.2.2.1 �Th�nh phần

D.3.2.2.2 �Chuẩn bị

H�a tan magie clorua trong nước.

Khử tr�ng 15 min trong nồi hấp �p lực (7.1) ở nhiệt độ 121 �C.

D.3.2.3 �M�i trường ho�n chỉnh

D.3.2.3.1 �Th�nh phần

D.3.2.3.2 �Chuẩn bị

Cho dung dịch magie clorua một c�ch v� tr�ng v�o m�i trường cơ bản v� trộn đều.

Ph�n phối 10 ml m�i trường n�y một c�ch v� tr�ng v�o c�c ống nghiệm (7.3).

C�c dung dịch phải được l�m nguội đến nhiệt độ ph�ng trước khi trộn để tr�nh tạo th�nh kết tủa.

D.3.3 �Thử nghiệm hiệu năng đảm bảo chất lượng của m�i trường tăng sinh lạnh

Về định nghĩa tinh chọn lọc v� năng suất, xem TCVN 8128 (ISO 11133). Thể t�ch dịch cấy phải giống lượng được sử dụng trong phương ph�p đối với m�i trường đ� v� cần chứa một lượng sinh vật đ�ch v� kh�ng phải đ�ch như quy định trong 5.4 của TCVN 8128 (ISO 11133).

Bảng D.1 - Thử nghiệm hiệu năng đảm bảo chất lượng của m�i trường tăng sinh lạnh

Thư mục t�i liệu tham khảo

[1] TCVN 10782 (ISO 13307) Vi sinh vật trong thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i - Giai đoạn sản xuất ban đầu - Kỹ thuật lấy mẫu

[2] TCVN 11922 (ISO 17468) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Y�u cầu v� hướng dẫn kỹ thuật để x�y dựng hoặc so�t x�t phương ph�p chuẩn

[3] TCVN 7925 (ISO 17604) Vi sinh vật trong thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i - Phương ph�p lấy mẫu th�n thịt tươi để ph�n t�ch vi sinh vật

[4] TCVN 11923 (ISO/TS 17728) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để ph�n t�ch vi sinh vật trong thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i

[5] TCVN 8129 (ISO 18593) Vi sinh vật trong thực phẩm v� thức ăn chăn nu�i - Phương ph�p lấy mẫu bề mặt sử dụng đĩa tiếp x�c v� lau bề mặt

[6] TCVN 11924 (ISO/TS 18867) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để ph�t hiện vi sinh vật g�y bệnh từ thực phẩm - Ph�t hiện Yersinia enterocolitica v� Yersinia pseudotuberculosis g�y bệnh

[7] AULISIO C.C.G., MEHLMAN I.J. and SANDERS A.C. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. Microbiol. 1980, 39 pp. 135-140

[8] BOTTONE E.J. Yersinia enterocolitica: Overview and epidemiologic correlates. Microbes Infect. 1999, 1 (4) pp. 323-333

[9] DENIS M., HOUARD E., LABB� A., FONDREVEZ M. and SALVAT G.A. A Selective Chromogenic Plate, YECA, for the Detection of Pathogenic Yersinia enterocolitica: Specificity, Sensitivity, and Capacity to Detect Pathogenic Y. enterocolitica from Pig Tonsils. Journal of Pathogens, vol. 2011, Article ID 296275, 8 pages, 2011. doi: 10.4061/2011/296275

[10] FARMER J.J. Ill, CARTER G.P., MILLER V.L., FALKOW S. and WACHSMUTH I.K. Pyrazinamidase, CR-MOX Agar, Salicin Fermentation - Esculin Hydrolysis, and D-Xylose fermentation for identifying pathogenic serotypes of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 1992, 30 pp. 2589-2594

[11] FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. Protocol in FDA. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. Chapter 8 In: Bacteriological Analytical Manual, 8th edn., Washington, DC, 1998, online version updated in 2007: www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm072633.htm

[12] HALLANVUO S., PELTOLA J., HEISKANEN T. and SIITONEN A. Simplified phenotypic scheme evaluated by 16S rRNA sequencing for differentiation between Yersinia enterocolitica and Y. enterocolitica -like species. J. Clin. Microbiol. 2006, 44 pp. 1077-1080

[13] RENAUD N., LECCI L, COURCOL R.J., SIMONET M. and GAILLOT O. CHROMagar Yersinia, a new chromogenic agar for screening of potentially pathogenic Yersinia enterocolitica isolates in stools. J. Clin. Microbiol. 2013, 51 pp. 1184-1187

[14] RILEY G. and TOMA S. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by using Congo red-magnesium oxalate agar medium. J. Clin. Microbiol. 1989, 27 pp. 213-214

[15] SCHIEMANN D A. Synthesis of selective agar medium for Yersinia enterocolitica. Can. J. Microbiol. 1979, 25 pp. 1298-1304

[16] TENNANT S.H., GRANT T.H. and ROBINS-BROWNE R.M. Pathogenicity of Yersinia enterocolitica typ huyết thanh 1A. FEMS Immun. Medical Microbiol. 2003, 38 pp. 127-137

[17] WAUTERS G., GOOSSENS V., JANSSENS M. and VANDEPITTE J. New enrichment method for isolation of pathogenic Yersinia enterocolitica serogroup O:3 from pork. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54 pp. 851-854

[18] WEAGANT S.D. A new chromogenic agar medium for detection of potentially virulent Yersinia enterocolitica. J. Microbiol. Methods. 2008, 72 pp. 185-190