Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6187-1:2019 (ISO 9308-1:2014) về Chất lượng nước - Phát hiện và đếm Escherichia coli và vi khuẩn Coliform - Phần 1: Phương pháp lọc màng áp dụng cho nước có số lượng vi khuẩn thấp

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 6187-11:2019

ISO 9308-1:2014

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM ESCHERICHIA COLI VÀ VI KHUẨN COLIFORM - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG ÁP DỤNG CHO NƯỚC CÓ SỐ LƯỢNG VI KHUẨN THẤP

Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora

Lời nói đầu

TCVN 6187-1:2019 thay thế TCVN 6187-1:2009;

TCVN 6187-1:2019 hoàn toàn tương đương với ISO 9308-1:2014;

TCVN 6187-1:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Đánh giá sự ô nhiễm và mức độ ô nhiễm phân là một yếu tố quan trọng trong đánh giá chất lượng nước và nguy cơ lây nhiễm cho con người. Kiểm tra sự có mặt Escherichia coli (E. coli) trong nước được coi là chỉ thị sự nhiễm phân vì E. coli thường cư trú trong đường ruột của người và các động vật máu nóng khác. Nếu chỉ kiểm tra vi khuẩn coliform sẽ khó giải thích kết quả hơn vì một số vi khuẩn coliform không phải lúc nào cũng ở đường ruột mà có thể sống ở đất và nước bề mặt. Vì vậy, sự có mặt của vi khuẩn coliform không phải là bằng chứng về sự nhiễm phân nhưng có thể chỉ ra những điểm không phù hợp trong xử lý bảo quản hoặc phân phối.

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM ESCHERICHIA COLI VÀ VI KHUẨN COLIFORM - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG ÁP DỤNG CHO NƯỚC CÓ SỐ LƯỢNG VI KHUẨN THẤP

Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora

CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn này phải có kỹ năng thực hành phòng thí nghiệm và có trình độ phù hợp. Tiêu chuẩn này không đề cập đến tất cả các vấn đề về an toàn có liên quan trong việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thực hành liên quan đến sức khỏe và an toàn thích hợp để đảm bảo tuân thủ mọi điều kiện quy định.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Escherichia coli (E. coli) và vi khuẩn coliform. Phương pháp này sử dụng kỹ thuật lọc màng, sau đó nuôi cấy trên môi trường thạch coliform sinh màu và tính toán số lượng vi sinh vật đích có trong mẫu thử. Vì môi trường thạch phân biệt có độ chọn lọc thấp nên hệ vi sinh vật nền có thể phát triển gây nhiễm cho số đếm E. coli và vi khuẩn coliform, ví dụ: phương pháp này không thích hợp để áp dụng với mẫu nước bề mặt hoặc nước giếng nông.

Tiêu chuẩn này đặc biệt thích hợp cho những loại nước có số lượng tổng vi khuẩn dưới 100 khuẩn lạc trên môi trường thạch coliform sinh màu (CCA) bao gồm nước uống đóng chai, nước bể bơi khử khuẩn hoặc nước đã qua xử lý làm nước uống.

Một vài chủng E. coli âm tính với β-D-glucuronidase, như Escherichia coli O157, sẽ không phát hiện được là E. coli. Vì chúng có enzym β-D-galactosidase dương tính nên sẽ giống như vi khuẩn coliform trên môi trường CCA.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy

TCVN 8880 (ISO 19458), Chất lượng nước - Lấy mẫu để phân tích vi sinh vật

TCVN 9716 (ISO 8199), Chất lượng nước - Hướng dẫn chung về đếm vi sinh vật bằng nuôi cấy

ISO 7704, Water quality - Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses (Chất lượng nước - Đánh giá màng lọc sử dụng cho phép phân tích vi sinh)

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa trong TCVN 6450 (ISO/IEC Guide 2) và các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Vi khuẩn coliform (coliform bacteria)

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae sinh enzym β-D-galactosidase.

3.2

Escherichia coli (Escherichia coli)

E. coli

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae sinh enzym β-D-galactosidase và β-D-glucuronidase.

4  Nguyên tắc

Lọc phần mẫu thử qua màng để giữ lại các vi sinh vật, sau đó đặt màng lọc lên đĩa thạch coliform sinh màu.

Ủ đĩa thạch đã đặt màng lọc ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h.

Đếm các khuẩn lạc coliform dương tính β-D-galactosidase (màu hồng đến đỏ) được giả định là vi khuẩn coliform. Để tránh kết quả dương tính giả do các vi khuẩn có oxidase dương tính như Aeromonas spp, các khuẩn lạc giả định coliform này cần được khẳng định âm tính oxidase.

Các khuẩn lạc dương tính β-D-galactosidase và β-D-glucuronidase (màu xanh đen đến màu tím) được đếm là E. coli.

Tổng số vi khuẩn coliform là tổng của các khuẩn lạc âm tính oxidase có màu hồng đến màu đỏ và tất cả các khuẩn lạc có màu xanh đậm đến màu tím.

5  Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể là:

5.1  Thiết bị tiệt trùng bằng hơi nước (nồi hấp), theo hướng dẫn của TCVN 9716 (ISO 8199).

5.2  Tủ ấm, có thể điều chỉnh được nhiệt độ (36 ± 2) °C

5.3  Máy đo pH, với độ chính xác ± 0,1 ở 20 °C và 25 °C

5.4  Thiết bị lọc màng

5.5  Màng lọc, làm bằng este xenlulô hoặc vật liệu tương đương khác, đường kính khoảng 47 mm hoặc 50 mm, đường kính lỗ lọc 0,45 μm, ưu tiên loại có kẻ ô vuông.

Màng lọc không được có yếu tố ức chế hoặc kích thích sự phát triển của vi khuẩn và mực in ô vuông không được ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Nếu màng lọc chưa được tiệt trùng thì cần tiệt trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi lô màng cần được thử theo ISO 7704 về tính thích hợp cho thử nghiệm, đặc biệt khi sử dụng các loại màng lọc khác nhau có thể cho kết quả khác nhau về độ thu hồi và sự hiện màu.

5.6  Kẹp khử trùng, dùng để kẹp màng lọc.

6  Môi trường cấy và thuốc thử

Để chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử, xem TCVN 9716 (ISO 8199) và TCVN 8128 (ISO 11133). Sử dụng các thành phần có cùng chất lượng và hóa chất tinh khiết phân tích (xem chú thích); theo hướng dẫn trong Phụ lục B. Cũng có thể sử dụng môi trường và thuốc thử thương mại nhưng chúng phải phù hợp với các thành phần nêu trong Phụ lục B và cần tuân thủ nghiêm ngặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng hóa chất có độ tinh khiết khác nếu các hóa chất này có tính năng như nhau trong phép thử.

Để chuẩn bị môi trường cấy, cần dùng nước cất hoặc nước đã loại ion không chứa các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong các điều kiện thử nghiệm và phù hợp với TCVN 4851 (ISO 3696).

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu và chuyển mẫu đến phòng thử nghiệm thực hiện theo TCVN 8880 (ISO 19458).

8  Cách tiến hành

8.1  Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu lọc và cấy trên môi trường phân lập, theo hướng dẫn TCVN 9716 (ISO 8199). Mẫu thử phải được vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ (5 ± 3) °C theo hướng dẫn TCVN 8880 (ISO 19458). Trường hợp đặc biệt mẫu có thể bảo quản ở (5 ± 3) °C đến 24 h trước khi kiểm tra. Trong trường hợp này, thời gian bảo quản mẫu phải được nêu trong báo cáo kết quả.

8.2  Lọc

Lọc 100 ml mẫu (hoặc thể tích khác, ví dụ 250 ml cho nước đóng chai) qua màng lọc (5.5). Thể tích lọc tối thiểu là 10 ml mẫu ban đầu hoặc mẫu pha loãng để đảm bảo cho sự phân bố đồng đều của vi khuẩn trên màng lọc.

8.3  Ủ và phân biệt

Sau khi lọc (8.2), đặt màng lọc trên đĩa thạch coliform sinh màu (CCA) (B.1), đảm bảo rằng không tạo bọt khí phía dưới màng, lật ngược đĩa, và ủ ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h.

Kiểm tra màng lọc và đếm tất cả các khuẩn lạc dương tính β-D-galactosidase (màu hồng đến đỏ) là vi khuẩn coliform giả định, nhưng không phải E. coli.

Đếm tất cả các khuẩn lạc dương tính β-D-galactosidase và β-D-glucuronidase (màu xanh đậm đến màu tím) là E. coli.

Để khẳng định vi khuẩn coliform giả định nhưng không phải E. coli, sử dụng phép thử oxidase. Thử tất cả các khuẩn lạc đặc trưng thu được, hoặc ít nhất 10 khuẩn lạc màu hồng đến đỏ được chọn theo TCVN 9716 (ISO 8199). Đối với phép thử khẳng định này, có thể sử dụng test thử oxidase thương mại1 phù hợp.

Nếu không sử dụng que thử oxidase thương mại, thì phép thử oxidase được thực hiện bằng cách nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxidase mới chuẩn bị (B.2) lên giấy lọc đặt trong đĩa petri. Dùng que cấy vòng bằng nhựa hoặc platin chuyển một phần khuẩn lạc lên giấy lọc đã chuẩn bị. Màu xanh đậm xuất hiện trong vòng 30 s là phản ứng dương tính. Vi khuẩn coliform âm tính oxidase nên không xuất hiện màu xanh đậm.

Nếu có nhiều khuẩn lạc phát triển trên màng lọc hoặc nếu khuẩn lạc giả định nằm sát các khuẩn lạc khác, có thể cấy truyền tiếp để chắc chắn rằng phép thử oxidase được thực hiện với các chủng cấy thuần. Nếu khuẩn lạc giả định quá nhỏ thì cũng cần cấy truyền để thực hiện phép thử oxidase. Việc cấy truyền tiến hành trên thạch không chọn lọc (ví dụ B.3) ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h.

9  Biểu thị kết quả

Dựa vào số lượng khuẩn lạc đã khẳng định được đếm trên màng lọc (8.3), tính số lượng E. coli và vi khuẩn coliform trong 100 ml mẫu (hoặc thể tích lọc lớn hơn) theo TCVN 9716 (ISO 8199). Số lượng vi khuẩn coliform là tổng số các khuẩn lạc hồng đến đỏ âm tính oxidase cộng với tất cả khuẩn lạc xanh đậm đến tím. E. coli là tất cả khuẩn lạc có màu xanh đậm đến tím.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ các thông tin dưới đây:

a) phương pháp sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) tất cả thông tin cần thiết về nhận dạng mẫu thử;

c) kết quả thử nghiệm theo Điều 9;

d) bất kì sự cố nào quan sát được trong quá trình phân tích và mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

11  Đảm bảo chất lượng

11.1  Yêu cầu chung

Sử dụng phòng thử nghiệm có hệ thống kiểm soát chất lượng để đảm bảo rằng vật liệu, thuốc thử và kỹ thuật là phù hợp với phép thử. Việc sử dụng chứng dương, chứng âm, và mẫu trắng là một phần của phép thử.

11.2  Phép thử hiệu năng của thạch coliform sinh màu (CCA)

Kiểm tra năng suất, độ chọn lọc và độ đặc hiệu theo TCVN 8128 (ISO 11133). Kiểm tra hiệu năng của CCA được thử nghiệm theo các phương pháp và tiêu chí được mô tả trong TCVN 8128 (ISO 11133).

Bảng 1 thể hiện các phép thử kiểm tra hiệu năng của CCA.

Bảng 1 - Kiểm tra hiệu năng của thạch coliform sinh màu

11.3  Kiểm tra hiệu năng của oxidase

Ví dụ về các chủng kiểm soát thích hợp là Pseudomonas aeruginosa WDCM 00024 [Z] (chứng dương), Escherichia coli WDCM 00013 [Z], hoặc WDCM 00012 [Z] (chứng âm).

Phụ lục A

(tham khảo)

Thông tin bổ sung về vi khuẩn coliform

Ngoài sinh enzym β-D-galactosidase, vi khuẩn coliform là vi khuẩn gram âm, hình que, không sinh bào tử, âm tính oxidase, có khả năng phát triển hiếu khí và kị khí tùy tiện khi có muối mật (hoặc các chất hoạt tính bề mặt có khả năng ức chế phát triển tương tự), lên men lactose sinh axit và aldehyd trong 48 h sau khi ủ ở nhiệt độ (36 ± 2) °C.

Ngoài sinh enzym β-D-glucuronidase, E. coli là vi khuẩn coliform sinh indol từ tryptophan ở (44,0 ± 0,5) °C trong (21 ± 3) h. Do đó, phép thử indol là một trong những phép thử để khẳng định E. coli. E. coli dương tính với thử nghiệm đỏ metyl và có khả năng khử nhóm cacboxyl của axit L-glutamic nhưng không sinh axetyl metyl carbinol, sử dụng xitrat như nguồn cacbon duy nhất hoặc phát triển trong môi trường KCN.

Phụ lục B

(quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

B.1  Thạch coliform sinh màu (CCA)

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng trong bể cách thủy cho đến khi các thành phần được hòa tan hết (khoảng 35 min). Nếu cần, chỉnh pH để sau khi xử lý nhiệt, giá trị pH khoảng (6,8 ± 0,2) ở 25 °C. Không hấp khử trùng, không đun quá nhiệt. Phân phối vào các đĩa petri, độ dày ít nhất là 4 mm. Nếu không dùng ngay, các đĩa được bảo quản ở (5 ± 3) °C trong tối, và bọc để môi trường không bị khô ít nhất trong một tháng. Cần kiểm tra hơi nước trên các đĩa trước khi sử dụng. Khi thấy có hơi nước trên mặt đĩa, cần hong khô trước khi cấy mẫu.

B.2  Thuốc thử oxidase

N,N,N’,N’-Tetrametyl-p-phenyllenediamin dihydroclorua (CAS No. 637-01-4)        0,1 g

Nước                                                                                                                10 ml

Thuốc thử này không ổn định. Nên chuẩn bị mới một lượng nhỏ ngay trước mỗi lần sử dụng, bảo quản tránh ánh sáng.

Cảnh báo - N,N,N’,N’-Tetrametyl-p-phenyllenediamine dihydrochloride là chất gây ung thư. Việc pha chế phải được thực hiện trong tủ hút khói. Sử dụng găng tay và tránh tiếp xúc với da.

B.3  Thạch Trypton đậu nành (TSA)

Đun sôi để hòa tan các chất. Điều chỉnh pH nếu cần sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,1 ở 25 °C. Hấp khử trùng ở (121 ± 3) °C trong 15 min. Để nguội môi trường đến 50 °C và rót vào các đĩa petri sao cho độ dày môi trường ít nhất là 4 mm. Các đĩa môi trường chưa sử dụng, có thể bảo quản ở (5 ± 3) °C trong tối và bọc để môi trường không bị khô ít nhất 8 tuần.

CHÚ THÍCH: Bất kì thạch không chọn lọc nào cũng có thể được sử dụng cho việc cấy truyền trước khi thử oxidase, chỉ cần không gây ảnh hưởng đến phản ứng oxidase.

Phụ lục C

(quy định)

Đặc tính hiệu năng

Bảng C.1 - Đặc tính hiệu năng của thạch CCA

Dữ liệu để tính toán đặc tính hiệu năng được thu thập vào năm 2012 tại IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasser Beratungs-und Entwicklungsgesellschaft mbH, ở Mülheim a. d. Ruhr, Đức. Phần lớn các phép thử được thực hiện trên nước uống phân phối ở Mülheim a. d. Ruhr, đây là loại nước được lấy từ nước bề mặt sông Ruhr. Phụ thuộc vào từng loại mẫu nước và phương pháp của mỗi phòng thử nghiệm mà phòng thử nghiệm cần thực hiện thẩm định lần hai. Tất cả dữ liệu được công bố trong bài báo “Performance validation of chromogenic coliform agar for the enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria” in “Letters in Applied Microbiology” in December 2013”, có thể truy cập trên trang http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/lam.12147/suppinfo.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

[2] BYAMUKAMA, D., KANSIIME, F., MACH R.L., FARNLEITNER A.H. Determination of Escherichia coli Contamination with Chromocult Coliform Agar Showed a High Level of Discrimination Efficiency for Differing Fecal Pollution Levels in Tropical Waters of Kampala, Uganda. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66 pp. 864-868

[3] GEISSLER K., MANAFI M., AMOROS I., ALONSO J.L. Quantitative determination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with chromogenic and fluorogenic media. J.Appl.Microbiol. 2000, 88 pp. 280-285

[4] OSSMER R., SCHMIDT W., MENDE U. Chromocult Coliform Agar-Influence of Membrane Filter Quality on Performance. Poster presentation, 1999. Congreso de la Sociedad Espanola de Microbiologia, Granada, Spain (http://www.univie.ac.at/chromogenic/OSSMER.PDF)

[5] USEPA : 40 CFR Part 141) (sec.141.21) Federal Register/Vol.67, No.209, Tuesday October 29, 2002/Rules and Regulations

[6] LANGE B., STRATHMANN M., OSSMER R. Perfomance validation of chromogenic coliform agar for the enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 2013, 57 pp.547-553 (http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/lam.12147/suppinfo)

[7] http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf (viewed 03-01-2014).