Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14189:2024 về Trứng - Xác định dư lượng nhóm Sudan bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14189:2024
TRỨNG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM SUDAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS)
Eggs - Determination of Sudan residues by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
Lời nói đầu
TCVN 14189:2024 do Trung tâm Kiểm tra vệ sinh Thú y Trung ương I - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
TRỨNG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM SUDAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS)
Eggs - Determination of Sudan residues by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng các sudan gồm: sudan I, sudan II, sudan III, sudan IV và para red có trong lòng đỏ trứng vịt bao gồm trứng vịt tươi và trứng vịt muối bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
Giới hạn định lượng của phương pháp đối với các chất: sudan I: 1 μg/kg, sudan II: 1 μg/kg, sudan III: 4 μg/kg, sudan IV: 4 μg/kg và para red: 20 μg/kg.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696: 1987), Nước được dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
3 Nguyên tắc
Dư lượng nhóm Sudan gồm sudan I, sudan II, sudan III, sudan IV, para red được chiết ra từ mẫu bằng dung dịch axetonitril. Dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn HLB. Phần dịch chiết sau khi làm sạch được phân tích bằng sắc ký lỏng hai lần khối phổ.
4 Thuốc thử
Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích trừ khi có yêu cầu khác. Nước cất được dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm ít nhất đạt loại 3 theo TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696 : 1987).
4.1 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho LC-MS.
4.2 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho HPLC.
4.3 Nước (H2O), loại dùng cho LC -MS.
4.4 Axit formic (HCOOH), loại dùng cho phân tích.
4.5 Metanol (CH3OH), loại dùng cho LC-MS.
4.6 n- hexan (C6H14), loại dùng cho phân tích
4.7 Etyl axetat (CH3COOC2H5), loại dùng cho phân tích.
4.8 Cột chiết pha rắn HLB, 60 mg, 3 ml.
4.9 Dung dịch axetonitril: nước (30:70)
Dùng ống đong (5.19) lấy 30 ml axetonitril (4.1) và 70 ml nước (4.3) cho vào lọ thủy tinh 100 ml (5.15), lắc kỹ. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.
4.10 Chất chuẩn sudan I, độ tinh khiết ≥ 99,0 %.
4.11 Chất chuẩn sudan II, độ tinh khiết ≥ 99,0 %.
4.12 Chất chuẩn sudan III, độ tinh khiết ≥ 94,0 %.
4.13 Chất chuẩn sudan IV, độ tinh khiết ≥ 99,0 %.
4.14 Chất chuẩn para red, độ tinh khiết ≥ 97,0 %.
4.15 Chất nội chuẩn sudan l-d5, độ tinh khiết ≥ 99,0 %.
4.16 Dung dịch chuẩn gốc sudan I, sudan II, sudan III, sudan IV, para red nồng độ 1 000 μg/ml
Dùng cân phân tích (5.2) cân 50 mg ±0,1 mg mỗi loại chất chuẩn (4.10); (4.11); (4.12); (4.13); (4.14) vào các bình định mức dung tích 50 ml (5.12) riêng rẽ. Hoà tan chất chuẩn sudan I (4.10), sudan II (4.11) và định mức đến vạch bằng axetonitril (4.1); hoà tan chất chuẩn sudan III (4.12), sudan IV (4.13) và para red (4.14) và định mức đến vạch bằng etyl axetat (4.7) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 000 μg/ml. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20°C có thể bền đến 3 tháng.
Lượng cân trên phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 μg/ml sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.
4.17 Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) sudan I và sudan II nồng độ 10 μg/ml, sudan III và sudan IV nồng độ 40 μg/ml, para red nồng độ 200 μg/ml trong axetonitril.
Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch chuẩn gốc sudan I, sudan II, 400 μl từ mỗi dung dịch chuẩn gốc sudan III, sudan IV và 2 ml dung dịch chuẩn gốc para red (4.16) vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.1). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20°C có thể bền đến 1 tháng.
4.18 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (S2) sudan I và sudan II nồng độ 1 μg/ml, sudan III và sudan IV nồng độ 4 μg/ml, para red nồng độ 20 μg/ml trong axetonitril: nước.
Lấy 1 ml từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (4.17) bằng micropipet (5.11) vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch với hỗn hợp dung dịch axetonitril: nước (4.9). Dung dịch này được chuẩn bị trong ngày.
4.19 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (S3) sudan I và sudan II nồng độ 100 ng/ml, sudan III và sudan IV nồng độ 400 ng/ml, para red nồng độ 2000 ng/ml trong axetonitril: nước.
Dùng micropipet (5.11) hút 1 ml từ dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (4.18) vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch với hỗn hợp dung dịch axetonitril: nước (4.9). Dung dịch này được chuẩn bị trong ngày.
4.20 Dung dịch nội chuẩn gốc sudan I-d5, nồng độ 1 000 μg/ml trong axetonitril
Dùng micropipet (5.11) hút 1 ml axetonitril (4.1) vào lọ (5.17) có chứa 1 mg chất nội chuẩn (4.15) thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 6 tháng.
4.21 Dung dịch nội chuẩn trung gian (IS1) sudan I-d5, 10 μg/ml trong axetonitril.
Lấy 100 μl từ dung dịch nội chuẩn gốc sudan I-d5, (4.20) bằng micropipet (5.11) cho vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.1). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 3 tháng.
4.22 Dung dịch nội chuẩn làm việc (IS2) sudan l-d5, 1 μg/ml trong trong axetonitril: nước.
Lấy 1 ml dung dịch hỗn hợp nội chuẩn trung gian (4.21) bằng micropipet (5.11) cho vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch với hỗn hợp dung dịch axetonitril: nước (4.9). Dung dịch này khi được bảo quản ờ nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 1 tháng.
4.23 Dung môi pha động kênh B, axetonitril chứa 0,1% axit formic.
Lấy 1 ml axit formic (4.4) cho vào 1 000 ml axetonitril (4.1) bằng micropipet (5.11), khuấy đều. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tuần.
4.24 Dung môi pha động kênh A, nước chứa 0,1% axit formic.
Lấy 1 ml axit formic (4.4) cho vào 1 000 ml nước (4.3) bằng micropipet (5.11), khuấy đều. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tuần.
5 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau:
5.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)
- Bơm 2 kênh dung môi gradient;
- Đầu dò ba tứ cực với nguồn ion hóa ESI;
- Máy tính và phần mềm phân tích;
- Hệ thống bơm mẫu tự động.
5.2 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg.
5.3 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 200 r/min đến 5 000 r/min, dài nhiệt độ từ 0 °C đến 10 °C.
5.4 Máy vortex, tốc độ tối đa 2 000 r/min.
5.5 Tủ sấy, dải nhiệt độ đến 250 °C.
5.6 Bộ bay hơi nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ.
5.7 Máy lắc ngang
5.8 Bể siêu âm.
5.9 Pasteur pipet, nhựa dung tích 5 ml.
5.10 Tủ lạnh âm sâu, dải nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 30 °C.
5.11 Micropipet, dung tích 5 μl đến 50 μl, 10 μl đến 100 μl, 20 μl đến 200 μl, 100 μl đến 1 000 μl và 1 ml đến 5 ml.
5.12 Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml và 1 000 ml.
5.13 Ống ly tâm, dung tích 15 ml, 50 ml.
5.14 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.
5.15 Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 1 000 ml.
5.16 Màng lọc nylon, kích thước lỗ 0,2 µm đường kính 13 mm.
5.17 Lọ đựng dung dịch chuẩn, dung tích 10 ml, 50 ml
5.18 Ống thủy tinh, dung tích 8 ml.
5.19 Ống đong thủy tinh, dung tích 100 ml.
5.20 Bộ chiết pha rắn, gồm bơm chân không và bình chân không có adaptor.
5.21 Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.
6 Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải là mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
7 Chuẩn bị mẫu
7.1 Chuẩn bị mẫu thử
Dùng cân kỹ thuật (5.21) cân 5 g ± 0,01 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml (5.13). Thêm 50 μl dung dịch nội chuẩn làm việc (4.22). Lắc đều bằng máy vortex (5.4) 30 s sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
7.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử. Mẫu trắng là mẫu trứng không chứa các sudan. Trong một lô mẫu phân tích, chuẩn bị tối thiểu một mẫu trắng.
Mẫu trắng là mẫu có giá trị nồng độ không quá 30% LOQ của từng chất phân tích tương ứng.
7.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Mẫu kiểm soát được chuẩn bị như mẫu thử. Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng có bổ sung 50 μl dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (4.19) và 50 μl dung dịch nội chuẩn làm việc (4.22) để có được nồng độ chuẩn của mẫu kiểm soát là sudan I, sudan II là 1 μg/kg; sudan III, sudan IV là 4 μg/kg; para red là 20 μg/kg và nồng độ chất nội chuẩn là 10 μg/kg. Lắc đều bằng máy vortex (5.4) 30 s sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
7.4 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn
Mẫu để dựng đường chuẩn được chuẩn bị như mẫu thử. Mẫu dựng đường chuẩn được dựng trên mẫu trắng (7.2) thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau:
- Đối với sudan I, sudan II là: 0 μg/kg; 1 μg/kg; 2 μg/kg; 5 μg/kg; 10 μg/kg và 20 μg/kg.
- Đối với sudan III, sudan IV là: 0 μg/kg; 4 μg/kg; 8 μg/kg; 20 μg/kg; 40 μg/kg và 80 μg/kg.
- Đối với para red là: 0 μg/kg; 20 μg/kg; 40 μg/kg; 100 μg/kg; 200 μg/kg và 400 μg/kg.
Cho lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp (4.18), (4.19) và dung dịch nội chuẩn (4.22) vào các ống ly tâm có chứa mẫu trắng theo Bảng 1, lắc 15 s bằng máy vortex (5.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
Bảng 1 - Nồng độ các dung dịch chuẩn dùng để xây dựng đường chuẩn sudan I, sudan II sudan III, sudan IV và para red
|
Nồng độ chất chuẩn sudan I, sudan II trong mẫu (Mg/kg) |
Nồng độ chất chuẩn sudan III, sudan IV trong mẫu (Mg/kg) |
Nồng độ chất chuẩn para red trong mẫu (Mg/kg) |
Thể tích dung dịch chuẩn (4.19) thêm vào (μl) |
Thể tích dung dịch chuẩn (4.18) thêm vào (μl) |
Thể tích dung dịch nội chuẩn (4.22) thêm vào (μl) |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
- |
50 |
|
1 |
4 |
20 |
50 |
- |
50 |
|
2 |
8 |
40 |
100 |
- |
50 |
|
5 |
20 |
100 |
- |
25 |
50 |
|
10 |
40 |
200 |
- |
50 |
50 |
|
20 |
80 |
400 |
- |
100 |
50 |
8 Cách tiến hành
8.1 Chiết mẫu và làm sạch mẫu
Cho vào mẫu 10 ml axetonitril (4.2);
Lắc bằng máy lắc ngang (5.7) trong 10 min;
Đưa vào bể siêu âm (5.8) trong 10 min;
Ly tâm mẫu ở 5000 r/min bằng máy ly tâm lạnh (5.3) trong 15 min ở 4°C;
Lấy hết lớp dung dịch phía trên sang ống ly tâm 15 ml (5.13) bằng pasteur pipet (5.9);
Hoạt hóa cột chiết pha rắn HLB (4.8) trên bộ chiết pha rắn (5.20) bằng 1 ml metanol (4.5) và 1 ml nước cất;
Cho dịch chiết chảy qua cột chiết pha rắn tốc độ 2 giọt/s;
Làm khô cột 5 min bằng bơm chân không (5.20);
Rửa giải chất phân tích bằng 3 ml n-hexan (4.6) vào ống thủy tinh (5.18)
Dịch chiết được làm khô bằng bộ bay hơi nitơ (5.6) ở 50 °C;
Hoàn nguyên cặn bằng 0,5 ml dung dịch axetonitril (4.1);
Lọc bằng màng lọc nylon (5.16), chuyển dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (5.14);
Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (5.1).
8.2 Phép xác định trên LC-MS/MS
8.2.1 Yêu cầu chung
Tối ưu hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế, năng lượng, khí...để mỗi chất phân tích thu được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) là cao nhất và lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có pic nhiễu tại vị trí của pic phân tích.
8.2.2 Các điều kiện phân tích (tham khảo)
8.2.2.1 Điều kiện trên LC
|
Cột sắc ký: |
RP C18, đường kính trong 2,1 mm, chiều dài cột 100 mm, kích thước hạt 1,7 μm. |
|
Nhiệt độ cột: |
(40 ± 2) °C. |
|
Tốc độ dòng: |
0,2 ml/min. |
|
Thể tích bơm mẫu: |
5 μl. |
|
Thời gian phân tích: |
16 min. |
|
Pha động: |
Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2. |
Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC
|
Thời gian (min) |
Kênh A Nước chứa 0,1 % axit formic (4.24) |
Kênh B Axetonitril chứa 0,1 % axit formic (4.23) |
|
0 |
80 |
20 |
|
0,50 |
30 |
70 |
|
6,00 |
0 |
100 |
|
10,00 |
0 |
100 |
|
10,01 |
80 |
20 |
|
16,00 |
80 |
20 |
8.2.2.2 Điều kiện trên MS
|
Kiểu ion hóa: |
ESI (+) |
|
Nhiệt độ nguồn ion hóa: |
150 °C |
|
Nhiệt độ hóa hơi dung môi: |
400 °C |
|
Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: |
600 L/h |
|
Tốc độ dòng khí qua khối nón: |
20 L/h |
|
Áp suất khí va chạm: |
Argon, p = 2,93x10-3 mbar |
|
Điện thế mao quản: |
2,0 kV |
Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS
|
Chất phân tích |
Thời gian lưu (min) |
Ion mẹ (m/z) |
Ion con (m/z) |
Năng lượng va chạm CE (eV) |
Năng lượng (Samμle Cone) (V) |
|
Sudan I |
3,6 |
249,0 |
155,9* |
16 |
26 |
|
127,8 |
26 |
||||
|
Sudan II |
5,0 |
277,0 |
120,8 |
20 |
22 |
|
155,9' |
14 |
||||
|
Sudan III |
5,8 |
353,1 |
76,8* |
26 |
40 |
|
196,5 |
22 |
||||
|
Sudan IV |
7,0 |
381,1 |
90,9' |
32 |
36 |
|
105,8 |
44 |
||||
|
Para red |
3,0 |
294,0 |
155,9* |
16 |
26 |
|
127,8 |
26 |
||||
|
Sudan I-ds |
3,6 |
254,0 |
155,9 |
16 |
24 |
Chú thích Bảng 3: ion ký hiệu (*) dùng để định lượng. Sudan l-d5 sử dụng cho cả 5 chất sudan.
8.3 Trình tự bơm mẫu
- Bơm dung môi kiểm tra máy: axetonitril (4.1);
- Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;
- Bơm mẫu trắng;
- Bơm mẫu kiểm soát;
- Bơm mẫu thử;
8.4 Hệ số tín hiệu, RF, tính theo công thức:
Trong đó:
Sp: diện tích pic của ion định lượng chất cần phân tích;
SpIS: diện tích pic của ion thứ cấp của chất nội chuẩn.
8.5 Dựng đường chuẩn
Dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu RF với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu, x, theo phương trình đường chuẩn: RF = ax + b. Trong đó:
b là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;
a là hệ số góc của đường chuẩn.
8.6 Tính kết quả
Hàm lượng chất phân tích trong mẫu, C, microgam trên kilogam (μg/kg) được tính theo công thức sau:
Trong đó:
Cx là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lít (μg/l);
V là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);
F là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg/kg (ppb) được làm tròn đến hai chữ số sau dấu phẩy.
9 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;
- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;
- Kết quả thử nghiệm thu được.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I, 01/01/2020 Quy trình nội bộ VS1/QT/226/TD “Trứng - Xác định dư lượng Sudan bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần”.
[2] Xiaolin Hou, Yonggangang Li, Chromatographia 2010, 71, 135-138 Analysis of para red and sudan dyes in egg yolk by UPLC-MS-MS
[3] Phòng thí nghiệm AVA (Agri-Food and Veterinary Authority) ] Singapore Quy trình nội bộ FN3.3.3 detection of Sudan I,II,III,IV & Black B and Para Red by LC/MS/MS
Ý kiến bạn đọc
