Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14188:2024 về Mật ong - Xác định dư lượng nhóm Neonicotinoid bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14188:2024

MẬT ONG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM NEONICOTINOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS)

Honey - Determination of Neonicotinoid residues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

Lời nói đầu

TCVN 14188:2024 do Trung tâm Kiểm tra vệ sinh Thú y Trung ương Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị. Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

MẬT ONG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM NEONICOTINOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS)

Honey - Determination of Neonicotinoid residues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng các Neonicotinoid gồm: Acetamiprid, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, clothianidin trong mật ong bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

Giới hạn định lượng của phương pháp đối với các chất là 10 μg/kg.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696: 1987), Nước được dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

Mẫu thử được axit hóa, dư lượng nhóm Neonicotinoid gồm: Acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram được chiết ra từ mẫu bằng dung dịch axetonitril. Dịch chiết được bổ sung natri axetat và magie sulphat, ly tâm và lọc bằng màng lọc nylon kích thước lỗ 0,2 μm. Phân tích dịch lọc bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần.

4  Thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích trừ khi có yêu cầu khác. Nước cất được dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm ít nhất đạt loại 3 theo TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

4.1  Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho LC-MS.

4.2  Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho HPLC.

4.3  Nước (H₂O), loại dùng cho LC-MS.

4.4  Magie sulphat (MgSO₄) khan, loại dùng cho phân tích.

4.5  Natri axetat (CH₃COONa), loại dùng cho phân tích.

4.6  Axit axetic (CH₃COOH), loại dùng cho phân tích.

4.7  Axit formic (HCOOH), loại dùng cho phân tích.

4.8  Dung dịch axetonitril 0,1 % axit axetic theo thể tích

Lấy 1 ml axit axetic (4.6) vào bình định mức 1 000 ml (5.12) định mức tới vạch bằng axetonitril (4.2), lắc kỹ. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.

4.9 Dung dịch axetonitril: nước (30:70)

Lấy 30 ml axetonitril (4.1) pha vào 70 ml nước (4.3) bằng ống đong (5.11) cho vào lọ thủy tinh 100 ml (5.15) , lắc kỹ. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.

4.10  Chất chuẩn acetamiprid, độ tinh khiết ≥ 98,0 %.

4.11  Chất chuẩn imidacloprid, độ tinh khiết ≥ 98,0 %.

4.12  Chất chuẩn thiacloprid, độ tinh khiết ≥ 98,0 %.

4.13  Chất chuẩn thiamethoxam, độ tinh khiết ≥ 98,0 %.

4.14  Chất chuẩn nitenpyram, độ tinh khiết ≥ 98,0 %.

4.15  Chất chuẩn clothianidin, độ tinh khiết ≥ 98,0 %.

4.16  Chất nội chuẩn clothianidin-d₃, độ tinh khiết ≥ 98,0 %.

4.17  Dung dịch chuẩn acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, nồng độ 1 000 μg/ml trong axetonitril

Dùng cân phân tích (5.2) cân 50 mg ± 0,1 mg mỗi loại chất chuẩn (4.10); (4.11); (4.12); (4.13); (4.14); (4.15) vào các bình định mức dung tích 50 ml (5.12) riêng biệt. Hoà tan và định mức đến vạch bằng axetonitril (4.1) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 000 μg/ml. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 3 tháng.

CHÚ THÍCH: Lượng cân trên phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 μg/ml sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.

Dung dịch chuẩn sau khi pha được đựng trong lọ đựng dung dịch chuẩn (5.8)

4.18  Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, nồng độ 10 μg/ml trong axetonitril.

Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch chuẩn gốc acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram (4.17) bằng micropipet (5.6) vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.1). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 1 tháng.

4.19  Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (S2) acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, nitenpyram, 1 μg/ml trong dung dịch axetonitril: nước.

Lấy 1 ml từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (4.18) bằng micropipet (5.6) vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch với dung dịch axetonitril: nước (4.9). Dung dịch này được chuẩn bị trong ngày.

4.20  Dung dịch nội chuẩn gốc clothianidin-d3 nồng độ 1 000 μg/ml trong axetonitril

Lấy 1 ml axetonitril (4.1) bằng micropipet (5.6) vào lọ có chứa 1 mg chất nội chuẩn (4.16) thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 6 tháng.

4.21  Dung dịch nội chuẩn trung gian (IS1) clothianidin-d3, 10 μg/ml trong axetonitril.

Lấy 100 μl từ dung dịch nội chuẩn gốc clothianidin-d3 (4.20) bằng micropipet (5.6) cho vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.1). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 3 tháng.

4.22  Dung dịch nội chuẩn làm việc (IS2) clothianidin-d3, 1 μg/ml trong trong dung dịch axetonitril: nước.

Lấy 1 ml dung dịch nội chuẩn trung gian (4.21) bằng micropipet (5.6) cho vào bình định mức 10 ml (5.12), định mức đến vạch bằng dung dịch axetonitril: nước (4.9). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 1 tháng.

4.23  Dung môi pha động kênh B, axetonitril chứa 0,1 % axit formic.

Lấy 1 ml axit formic (4.7) bằng micropipet (5.6) cho vào 1 000 ml axetonitril (4.1), khuấy đều. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tuần.

4.24  Dung môi pha động kênh A, nước chứa 0,1 % axit formic.

Lấy 1 ml axit formic (4.7) bằng micropipet (5.6) cho vào 1 000 ml nước (4.3), khuấy đều. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tuần.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau:

5.1  Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

- Bơm 2 kênh dung môi gradient;

- Detector ba tứ cực với nguồn ion hóa ESI;

- Máy tính và phần mềm phân tích;

- Hệ thống bơm mẫu tự động.

5.2  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg.

5.3  Máy ly tâm lạnh, tốc độ 200 r/min đến 5 000 r/min, dải nhiệt độ từ 0 °C đến 10 °C.

5.4  Máy vortex, tốc độ tối đa 2 000 r/min.

5.5  Tủ sấy, dải nhiệt độ đến 250 °C.

5.6  Micropipet, dung tích 5 μl đến 50 μl, 10 μl đến 100 μl, 20 μl đến 200 μl, 100 μl đến 1 000 μl và 1 ml đến 5 ml.

5.7  Máy lắc ngang, dải tốc độ 10 rpm đến 300 rpm.

5.8  Lọ đựng dung dịch chuẩn, dung tích 10 ml, 50 ml.

5.9  Pipet pasteur, nhựa dung tích 5 ml.

5.10  Tủ lạnh âm sâu, dải nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 30 °C.

5.11  Ống đong thủy tinh, dung tích 100 ml.

5.12  Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml và 1 000 ml.

5.13  Ống ly tâm, dung tích 50 ml.

5.14  Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.

5.15  Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 1 000 ml.

5.16  Màng lọc nylon, kích thước lỗ 0,2 μm đường kính 13 mm.

5.17  Máy đồng hoá mẫu

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải là mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

7  Chuẩn bị mẫu

7.1  Chuẩn bị mẫu thử

Đồng nhất mẫu bằng máy đồng hoá mẫu (5.17) trong 5 min. Dùng cân phân tích (5.2) cân 10 g ± 0,01g mẫu vào ống ly tâm 50 ml (5.13). Thêm 100 μl dung dịch nội chuẩn (4.22). Lắc đều bằng máy vortex (5.4) 30 s sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

7.2  Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử. Mẫu trắng là mẫu mật ong không chứa các Neonicotinoid. Trong một lô mẫu phân tích, chuẩn bị tối thiểu một mẫu trắng.

Mẫu trắng là mẫu có giá trị nồng độ không quá 30 % LOQ của từng chất phân tích tương ứng.

7.3  Chuẩn bị mẫu kiểm soát

Mẫu kiểm soát được chuẩn bị như mẫu thử. Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng có bổ sung 20 μl dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (4.18) và 100 μl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn (4.22) để có được nồng độ chuẩn của mẫu kiểm soát là 20 μg/kg và nồng độ chất nội chuẩn là 10 μg/kg. Lắc đều bằng máy vortex (5.4) 30 s sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

7.4  Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn

Đường chuẩn được dựng trên mẫu trắng (7.2). Mẫu để dựng đường chuẩn được chuẩn bị như mẫu thử thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau 0 μg/kg; 7,5 μg/kg; 15 μg/kg; 30 μg/kg; 60 μg/kg và 120 μg/kg.

Cho lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp (4.18), (4.19) và dung dịch hỗn hợp nội chuẩn (4.22) vào các ống ly tâm có chứa mẫu trắng theo Bảng 1, lắc 15 s bằng máy vortex (5.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

Bảng 1 - Nồng độ các dung dịch chuẩn dùng để xây dựng đường chuẩn

Nồng độ chất chuẩn trong mẫu (μg/kg)	Thể tích dung dịch chuẩn (4.19) thêm vào (μl)	Thể tích dung dịch chuẩn (4.18) thêm vào (μl)	Thể tích dung dịch nội chuẩn (4.22) thêm vào (μl)
0	-	-	100
7,5	75	-	100
15	150	-	100
30	-	30	100
60	-	60	100
120	-	120	100

8  Cách tiến hành

8.1  Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Cho vào mẫu 10 ml nước cất;

Lắc bằng máy vortex (5.4) đến khi mẫu tan hoàn toàn;

Thêm 10 ml axetonitril 0,1% axit axetic (4.8);

Lắc bằng máy vortex (5.4) trong 1 min;

Lắc bằng máy lắc ngang (5.7) trong 15 min;

Thêm 1 g natri axetat (4.5), 4 g magie sulphat (4.4);

Lắc bằng máy vortex (5.4) trong 1 min;

Ly tâm mẫu ở 4 500 r/min, nhiệt độ 10 °C bằng máy ly tâm lạnh (5.3) trong 5 min;

Hút dịch chiết phía trên bằng pipet pasteur (5.9) và lọc bằng màng lọc nylon (5.16), chuyển dịch lọc vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (5.14);

Phân tích trên thiết bị LC-MS/MS (5.1)

8.2  Phép xác định trên LC-MS/MS

8.2.1  Yêu cầu chung

Tối ưu hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế, năng lượng, khí... để mỗi chất phân tích thu được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) là cao nhất và lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có pic nhiễu tại vị trí của pic phân tích.

8.2.2  Các điều kiện phân tích (tham khảo)

8.2.2.1  Điều kiện trên LC

Cột sắc ký:	RP C18, đường kính trong 2,1 mm, chiều dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 μm.
Nhiệt độ cột:	(40 ± 5) °C.
Tốc độ dòng:	0,2 ml/min.
Thể tích bơm mẫu:	5 μl.
Thời gian phân tích:	10 min.
Pha động:	Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2.

Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC

Thời gian (min)	Kênh A Nước chứa 0,1 % axit formic (4.24)	Kênh B Axetonitril chứa 0,1 % axit formic (4.23)
0	97	3
0,5	97	3
6,0	3	97
7,0	3	97
7,5	97	3
10,0	97	3

8.2.2.2  Điều kiện trên MS

Kiểu ion hóa:	ESI (+)
Nhiệt độ nguồn ion hóa:	150 °C
Nhiệt độ hóa hơi dung môi:	400 °C
Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi:	600 L/h
Tốc độ dòng khí qua khối nón:	20 L/h
Áp suất khí va chạm:	Argon, p = 2,93x10-3 mbar
Điện thế mao quản:	2,0 kV

Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS

Kháng sinh	Thời gian lưu (min)	Ion mẹ (m/z)	Ion con (m/z)	Năng lượng va chạm CE (eV)	Năng lượng (Samμle Cone) (V)
Acetamiprid	4,5	223,0	56*	17	25
			126	20
Imidacloprid	4,5	256,0	175*	20	22
			209	17
Thiacloprid	4,8	253,0	126*	20	25
			186	16
Thiamethoxam	4,1	292,0	181*	22	20
			211	10
Nitenpyram	3,7	271,0	224*	22	22
			237	20
Clothianidin	4,4	249,6	132*	16	16
			169	14
Clothianidin-d3	4,4	252,6	135	16	16

Chú thích Bảng 3: ion ký hiệu (*) dùng để định lượng.

8.3  Trình tự bơm mẫu

- Bơm dung môi kiểm tra máy: axetonitril (4.1);

- Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

- Bơm mẫu trắng;

- Bơm mẫu kiểm soát;

- Bơm mẫu thử.

8.4  Hệ số tín hiệu, RF, tính theo công thức:

Trong đó:

Sp: diện tích pic của ion định lượng chất cần phân tích;

Spis: diện tích pic của ion thứ cấp của chất nội chuẩn.

8.5  Dựng đường chuẩn

Dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu RF với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu, x, theo phương trình đường chuẩn: RF = ax + b. Trong đó:

b  là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

a  là hệ số góc của đường chuẩn.

8.6  Tính kết quả

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu, C, microgam trên kilogam (μg/kg) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

Cx  là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lit (μg/l);

V  là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

F  là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

m  là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg/kg (ppb) được làm tròn đến hai chữ số sau dấu phẩy.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

- Kết quả thử nghiệm thu được.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I, 01/01/2020, Quy trình nội bộ VS1/QT/235/TD “Mật ong - Xác định dư lượng nhóm Neonicotinoid bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần".

[2] Gina Tanner and Christoph Czerwenka, 2011, LC-MS/MS Analysis of Neonicotinoid Insecticides in Honey Methodology and Residue Findings in Austrian Honeys, Journal of Agricultural and Food Chemistry.

[3] Michele Proietto Galeano, Monica Scordino, Leonardo Sabatino, Valentina Panto, Giovanni Morabito, Elena Chiappara, Pasqualino Traulo, and Giacomo Gagliano, 2013, UHPLC/MS-MS Analysis of Six Neonicotinoidin Honey by Modified QuEChERS: Method Development,Validation, and Uncertainty Measurement, Hindawi.