Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14109:2024 về Phân bón - Xác định hàm lượng polyphenol tổng số - Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14109:2024

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ - PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ DÙNG THUỐC THỬ FOLIN-CIOCALTEU

Fertilizers - Determination of total polyphenols content - Spectrophotometric method using Folin-Ciocalteu reagent

Lời nói đầu

TCVN 14109:2024 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ - PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ DÙNG THUỐC THỬ FOLIN-CIOCALTEU

Fertilizers - Determination of total polyphenols content - Spectrophotometric method using Folin-Ciocalteu reagent

CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong phân bón bằng phép đo phổ hấp thụ phân tử dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 9486:2018, Phân bón - Lấy mẫu

TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991), Phân bón rắn - phương pháp chuẩn bị mẫu để xác định các chỉ tiêu hóa học và vật lý

3  Nguyên tắc

Polyphenol trong phân bón được chiết bằng metanol 70 % ở 70 °C. Các nhóm hydroxy phenol trong polyphenol được oxy hóa bằng axit phospho-vonframic của thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo hợp chất màu xanh và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm.

Các thuốc thử Folin-Ciocalteu phân ứng với nhiều hợp chất polyphenol và có thể có đáp ứng khác nhau với các hợp chất đơn lẻ, việc lựa chọn axit gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn giúp ích cho việc thu được dữ liệu xác định polyphenol tổng số.

4  Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, trong quá trình phân tích chỉ sử dụng các hóa chất, thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích dùng cho phân tích và nước cất hai lần phù hợp với TCVN 4851:1989 (ISO 3696 :1987) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 μS/m); sau đây gọi là nước).

4.1  Metanol (CH₃OH).

4.2  Hỗn hợp chiết metanol/nước, 70 % metanol (theo thể tích)

Cho 700 mL metanol (4.1) vào bình định mức dung tích 1000 mL. Pha loãng đến vạch bằng nước và trộn đều.

4.3  Thuốc thử Folin-Ciocalteu, đã được pha chế sẵn (hỗn hợp của phosphomolybdate (((NH⁴)₃PMo₁₂O₄₀)) và phosphotungstate (Na₃PO₄∙12WO₃∙xH₂O))

Nên kiểm thuốc thử bằng cách xây dựng đường chuẩn với axit gallic để xác định sự phù hợp của thuốc thử được cung cấp.

4.4 Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10 % (theo thể tích)

Rót khoảng 20 mL thuốc thử vào cốc đã được rửa sạch, sấy khô. Dùng pipet hút chính xác 20 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu (4.3) vào bình định mức dung tích 200 mL. Pha loãng đến vạch bằng nước và trộn đều.

CHÚ THÍCH 1:

- Chuẩn bị dung dịch thuốc thử trong ngày sử dụng.

- Để tránh nhiễm bẩn thuốc thử Folin-Ciocalteu (4.4), nên loại bỏ thuốc thử Folin-Ciocalteu (4.3) còn dư trong cốc.

4.5  Natri cacbonat (Na₂CO₃) tinh thể.

4.6  Dung dịch natri cacbonat, 7,5 % (theo khối lượng)

Cân (37,50 ± 0,01) g natri cacbonat khan (4.5) vào cốc dung tích 500 mL. Thêm vào 200 mL nước ấm, khuấy tan hoàn toàn. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức dung tích 500 mL, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến vạch định mức, lắc đều.

Dung dịch này ở nhiệt độ phòng bền trong 1 tháng.

4.7  Axit gallic (C₆H₂(OH)₃COOH), tinh thể.

4.8  Dung dịch chuẩn gốc axit gallic, có sẵn, đã được chứng nhận hoặc tương đương với axit gallic khan nồng độ khoảng 1000 mg/L.

Dùng cân phân tích (5.1), cân chính xác 0,11 g axit gallic ngậm một phân tử nước (M = 188,14) cho vào bình định mức một vạch 100 mL. Hòa tan trong nước, pha loãng đến vạch và lắc đều.

CHÚ THÍCH 2: Axit gallic ngậm một phân tử nước tốt hơn ở dạng khan, vì có độ hòa tan cao hơn, đã khử đặc tính hút ẩm và có sẵn loại đã được chứng nhận, ví dụ A.C.S, biểu thị cho các hóa chất đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật của Hội hóa học Mỹ đưa ra. Nếu chưa biết độ ẩm thì cần xác định độ ẩm (hao hụt khối lượng ở 103 °C) trên một phần mẫu chuẩn. Sau đó, có thể tính nồng độ của dung dịch chuẩn gốc theo axit gallic khan.

4.9  Dung dịch chuẩn axit gallic, 100 mg/L

Dùng pipet hút 10 mL dung dịch chuẩn gốc axit gallic (4.8) vào bình định mức dung tích 100 mL. Pha loãng đến vạch bằng nước và lắc đều.

4.10  Dãy dung dịch chuẩn axit gallic: từ 1,0 mg/L đến 5,0 mg/L

Dùng pipet hút các thể tích dung dịch chuẩn axit gallic (4.10) trong Bảng 1 vào bình định mức dung tích 100 mL. Pha loãng đến vạch bằng nước và lắc đều.

Bảng 1 - Dung dịch chuẩn axit gallic có nồng độ từ 1,0 mg/L đến 5,0 mg/L

Nồng độ dung dịch chuẩn axit gallic (mg/L)	Thể tích của dung dịch chuẩn axit gallic 100 mg/L (4.9) (mL)	Thể tích nước (mL)
1	1,0	99,0
2	2,0	98,0
3	3,0	97,0
4	4,0	96,0
5	5,0	95,0

CHÚ THÍCH 3:

- Dung dịch chuẩn được sử dụng trong ngày.

- Tùy thuộc vào điều kiện trang thiết bị và hàm lượng polyphenol trong mẫu thử để xây dựng đường chuẩn sao cho phù hợp.

5  Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và

5.1  Cân phân tích, có độ chính xác đến ± 0,0001 g.

5.2  Nồi cách thủy.

5.3  Máy ly tâm.

5.4  Máy quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS).

5.5  Pipet các loại dung tích 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 25 mL.

5.6  Bình định mức dung tích 100 mL, 200 mL, 500 mL.

5.7  Máy trộn Vortex.

5.8  Ống chiết, bằng thủy tinh, dung tích 20 mL, có nút đậy kín và có thể chịu được khi ly tâm.

5.9  Ống đong có chia độ, bằng thủy tinh, dung tích 10 mL, chia độ 0,1 mL.

Trước khi sử dụng, ống đong cần được làm sạch bằng axit nitric khoảng 15 % ( theo thể tích), sau đó tráng kỹ bằng nước và làm khô trong tủ sấy ở 40 °C.

6  Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 9486: 2018.

6.2  Chuẩn bị mẫu

6.2.1  Phân bón dạng rắn: Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991)

6.2.2  Phân bón dạng lỏng

6.2.2.1  Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được lắc đều.

6.2.2.2  Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu

Dùng cân phân tích (5.1) cân từ 2,5 g đến 5 g mẫu đã được chuẩn bị theo (6.2.1 và 6.2.2.2), vào ống chiết dung tích 20 mL. Đối với mẫu dạng lỏng (6.2.2.1), dùng pipet (5.5) hút 2,5 mL đến 5 mL dung dịch mẫu và cân chính xác đến 0,0001 g để xác định khối lượng (g), sau đó tiến hành tương tự như đối với mẫu rắn và mẫu lỏng dạng sền sệt;

Cho ống chiết mẫu vào nồi cách thủy đặt ở 70 °C, thêm 5 mL hỗn hợp chiết metanol/nước (4.4) (đã được làm nóng trong nồi cách thủy ở 70 °C và trong ít nhất 30 min để cho hỗn hợp chiết cân bằng), đậy nắp và trộn trên máy trộn vortex (5.7).

Tiếp tục gia nhiệt ống chiết trong nồi cách thủy 10 min, trộn trên máy trộn vortex (5.7) sau 5 min đến 10 min.

CHÚ THÍCH 4: Quan trọng nhất là trộn đều kỹ các mẫu để đảm bảo chiết hết.

Lấy ống chiết ra khỏi nồi cách thủy và để nguội đến nhiệt độ phòng. Mở nắp và đặt ống vào máy ly tâm (5.3) ở tốc độ 3 500 vòng/min trong 10 min.

Gạn cẩn thận dịch nổi phía trên vào ống đong (5.9).

Lặp lại các bước chiết trên khoảng 3 lần, sau đó phối trộn các dịch chiết, thêm hỗn hợp chiết nguội metanol/ nước (4.4) đến 25 mL và trộn đều.

CHÚ THÍCH 5: Dịch chiết từ có thể bền ít nhất trong 24 h nếu được bảo quản ở 4°C. Để cho dịch chiết đạt đến nhiệt độ phòng trước khi tiến hành phép phân tích. Nếu chỉ một lượng nhỏ mẫu dạng hạt có thể bị lắng xuống trong quá trình bảo quản thì không cần phải tái huyền phù.

7.2  Dịch pha loãng

Dùng pipet (5.5) chuyển 1,0 mL dịch chiết mẫu (7.1) vào bình định mức dung tích 25 mL. Pha loãng đến vạch bằng nước và trộn đều.

7.3  Xác định polyphenol

Dùng pipet (5.5) thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 mL dung dịch chuẩn axit gallic theo Bảng 1 (4.10) vào các ống đong có chia độ (5.9) (Dung dịch này tương ứng với khoảng 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg và 5 μg axit gallic khan).

Dùng pipet (5.5) thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 mL nước vào các ống đong có chia độ (5.9). Đây là dung dịch so sánh mẫu trắng thuốc thử.

Dùng pipet (5.5) thực hiện hai lần, mỗi lần chuyển 1,0 mL dịch chiết mẫu đã được pha loãng (7.2) vào các ống đong có chia độ (5.9).

Dùng pipet (5.5) thêm 5,0 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10 % (4.4) vào từng ống và trộn đều trong vòng 3 min đến 8 min, dùng pipet lấy 4,0 mL dung dịch natri cacbonat 7,5 % (4.6) vào mỗi ống. Đậy nắp và trộn đều.

Để yên bình ở nhiệt độ phòng trong 60 min, sau đó đo mật độ quang trong cuvet có chiều dài đường quang 10 mm so với dung dịch mẫu trắng thuốc thử trên máy đo quang phổ (5.4) ở bước sóng 765 nm.

CHÚ THÍCH 6: Mẫu trắng thuốc thử phải có mật độ quang < 0,010. Các giá trị mẫu trắng cao hơn cho thấy có sự nhiễm từ nước, thuốc thử hoặc dụng cụ thủy tinh. Điều quan trọng nữa là mật độ quang của mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn. Nếu mật độ quang của mẫu cao hơn mật độ quang của dung dịch chuẩn axit gallic 5 μg thì lặp lại phép phân tích bằng cách tăng độ pha loãng (7.2).

8  Biểu thị kết quả

Hàm lượng polyphenol (X) trong mẫu phân bón, tính bằng mg/kg, theo công thức:

trong đó

a  là nồng độ của polyphenol trong dung dịch mẫu thử được xác định theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lit (mg/L);

f  là hệ số pha loãng;

V  là thể tích dung dịch định mức của mẫu sau khi chiết, tính bằng mililit (mL);

m  là khối lượng mẫu cân tính bằng gam (g);

P_i  là độ tinh khiết của chất chuẩn

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song với khối lượng cân khác nhau, sai lệch giữa chúng không được vượt quá theo quy định của AOAC (tùy thuộc vào mức nồng độ của chất thử) so với giá trị trung bình.

Kết quả hàm lượng polyphenol được lấy sau dấu phẩy hai chữ số

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm cần có đầy đủ những thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;

c) Kết quả thử nghiệm;

d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) Ngày thử nghiệm.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin về hoạt chất polyphenol

- Công thức cấu tạo

Polyphenol

Axit gallic, một dạng của polyphenol

- Tên hoạt chất: Axit gallic

- Tên hóa học: IUPAC : 3,4,5 trihydroxybenzoic acid

- Công thức phân tử: C₇H₆O₅

- Khối lượng phân tử: 170,12 g/mol

- Nhiệt độ sôi: 250 °C

- Độ hòa tan: tan trong nước: 11,9 g/L, (20 °C) ở dạng anhydric, 15 g/L, (20 °C) ở dạng monohydrat

- Dạng bên ngoài: chất rắn, màu trắng, trắng vàng.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Thông tin về đường chuẩn của polyphenol

Y = 0.0135733 +0.00000

r² = 0.99918

R(m)2 =0.99918

Đường chuẩn của axit galic trong phân bón có nồng độ từ 0,1 mg/L đến 5 mg/L

Standard Table

No	Sample ID	Type	Ex	Conc	WL 765.0	Wgt. Factor	Comments
1	1	Standard		0.0000	0.0000	1.0000
2	2	Standard		0.1000	0.0021	1.0000
3	3	Standard		0.2000	0.0033	1.0000
4	4	Standard		0.5000	0.0076	1.0000
5	5	Standard		1.0000	0.0126	1.0000
6	6	Standard		2.0000	0.0265	1.0000
7	7	Standard		5.0000	0.0682	1.0000

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005) Chè - Xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè xanh - Phần 1: Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè - Phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin - Ciocalteu