Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13647:2023 về Mỹ phẩm - Phương pháp phân tích - Định tính các steroid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13647:2023

MỸ PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH - ĐỊNH TÍNH CÁC STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Cosmetics - Analytical methods - Identification of steroids by high-performance liquid chromatography (HPLC)

 

Lời nói đầu

TCVN 13647:2023 được xây dựng trên cơ sở tham khảo ACM 007 - Identification of steroids in cosmetic products by TLC and HPLC

TCVN 13647:2023 do Viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

Lời giới thiệu

Steroid thường được dùng theo chỉ định với tác dụng chính là chữa trị bệnh ngoài da, giảm viêm. Tuy nhiên tác dụng phụ của steroid còn có thể làm trắng da vì vậy nhiều chế phẩm mỹ phẩm trên thị trường đã bổ sung trái phép steroids. Chính điều này kèm với việc lạm dụng sản phẩm chứa steroid trong thời gian dài đã gây nên những tổn thương nặng nề cho da.

Một số các steroid đã phát hiện:

Bảng 1 - Thông tin các steroid

Tên	Công thức phân tử	CAS number	Danh pháp IUPAC	Cấu trúc phân tử
Prednison	C21H26O5	53-03-2	17,21-dihydroxypregna-1,4-diene 3,11,20-trione
Prednisolon	C21H28O5	50-24-8	(11β)-11,17,21-Trihydroxypregna-1,4-diene-3,20- dione
Cortison	C21H28O5	53-06-5	(1R,3aS,3bS,9aR,9bS,11aS)-1- Hydroxy-1-(hydroxyacetyl)-9a,11a-dimethyl- 2, 3,3a,3b,4,5,8,9,93,9b,11,11a-dodecahydro-7H-cyclopenta[a]phenanthrene-7,10(1H)-dione
Betamethason	C22H29FO5	378-44-9	(8S,9R, 10S, 11S, 13S, 14S, 16S, 17 R)-9-Fluoro-11,17-dihydroxy-17-(2-hydroxyacetyl)-10,13,16- trimethyl-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-3-one
Dexamethason	C22H29FO5	50-02-2	(8S, 9R, 10S, 11S, 13S, 14S, 16R, 17 R)-9-Fluoro11,17-dihydroxy-17- (2-hydroxyacetyl)-10,13,16- trimethyl-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-3-one
Triamcinolon acetonid	C24H31FO6	76-25-5	(4aS,4bR,5S,6aS,6bS,9aR, 10aS, 10bS)-4b-fluoro-6b-glycoloyl-5- hydroxy-4a,6a,8,8-tetramethyl- 4a,4b,5,6,6a,6b,9a,10,10a,10b,1 1,12-dodecahydro-2H- naphtho[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-2-one
Hydrocortison acetat	C23H32O6	50-03-3	[2- [(8S,9S,10R,11S,13S,14S,11R)- 11,17-Dihydroxy-10,13-dimethyl-3-oxo2,6,7,8,9,11,12,14,15,16- decahydro-1 Fl- cyc!openta[a]phenanthren-17-yl]- 2-oxoethyl] acetate
Betamethason 17-Valerat	C27H37FO6	2152-44-5	(11β, 16β)-9-Fluoro-11,21- dihydroxy-16-methyl-3,20- dioxopregna-1,4-dien-17-yl valerate
Mometason Furoat	C27H30O6CI2	83919-23-7	(9 R,10S,11S,13S,14S,16R, 17R)-9-chloro-17-(2-chloroacetyl)-11-hydroxy-10,13,16-trimethyl-3-oxo-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- dodecahydro-3H- cyclopenta[a]phenanthren-17-yl furan-2-carboxylate

Một số phương định tính một số chất trong nhóm steroid như phương pháp hóa học, sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao trong dược điền trong và ngoài nước .

Phương pháp phân tích này sử dụng phương pháp sắc ký lòng hiệu năng cao đầu dò PDA hoặc tương đương định tính các steroid trên trong sản phẩm mỹ phẩm.

 

MỸ PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH - ĐỊNH TÍNH CÁC STEROID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Cosmetics - Analytical methods - Identification of steroids by high-performance liquid chromatography (HPLC)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính các steroid (bao gồm prednison, prednisolon, betamethason, dexamethason, cortison, hydrocortison acetat, mometason furoat, betamethason 17-valerat, và triamcinolon acetonid) trong mỹ phẩm.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

3  Nguyên tắc

Ma64u thử được chiết với methanol, làm bay hơi dịch chiết đến khô, cắn được hòa trong methanol để định tính steroid bằng phương pháp HPLC với cột pha đảo và đầu dò PDA hoặc tương đương.

4  Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương.

CẢNH BÁO: Công việc phân tích phải được tiến hành trong môi trường phòng thử nghiệm phù hợp, được trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng tay).

4.1  Methanol

4.2  Acetonitril

4.3  Nước

4.4  Pha động theo chương trình như sau:

4.5  Chất chuẩn

4.5.1  Prednison

4.5.2  Prednisolon

4.5.3  Betamethason

4.5.4  Dexamethason

4.5.5  Cortison

4.5.6  Hydrocortison acetat

4.5.7  Mometason furoat

4.5.8  Đetamethason 17-valerat

4.5.9  Triamcinolon acetonid

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò PDA hoặc tương đương, được trang bị bơm, hệ thống bơm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cho cột và phần mền xử lý số liệu.

5.2  Cột phân tích HPLC, Phenyl-hexyl (kích thước 4,6 mm x 150 mm; 2,6 μm) hay tương đương

5.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg; 0,01 mg

5.4  Máy lắc

5.5  Máy ly tâm, có thể quay ở tốc độ từ 3000 đến 4000 vòng/min

5.6  Bể cách thủy

5.7  Bình định mức, loại A, với các dung tích khác nhau

5.8  Pipet thủy tinh, loại A, với các dung tích khác nhau

5.9  Ống ly tâm, 10 ml, có nắp đậy kín

5.10  Màng lọc PVDF, kích thước lỗ lọc 0,45 μm hoặc tương đương

5.11  Xylanh, dung tích 5 mL

5.12  Lọ đựng mẫu cho HPLC, loại 1,5 ml hoặc tương đương (phù hợp thiết bị sử dụng)

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị dung dịch chuẩn

6.1.1  Dung dịch chuẩn (0,5 mg/mL)

Cân chính xác khoảng 5 mg mỗi chất chuẩn đối chiếu (4.5), chính xác đến 0,01 mg, cho vào từng bình định mức 10 mL (5.7), thêm 5 mL methanol (4.1), siêu âm 5 min, thêm methanol đến thể tích, lắc đều.

6.1.2  Dung dịch chuẩn hỗn hợp (0,055 mg/mL)

Lấy 1 mL của từng dung dịch chuẩn đổi chiếu (6.1.1) vào bình định mức 10 mL (5.7), lọc qua màng lọc PVDF 0,45 μm (5.10).

6.2  Chuẩn bị dung dịch thử

Cân chính xác khoảng 1,000 g mẫu thử kem, chính xác đến 0,1 mg, vào vào ống ly tâm (5.9), thêm 5 mL methanol (4.1), làm ẩm trong bể cách thủy (5.6) ở 60 °C trong 10 min, lắc mạnh bằng máy lắc (5.4) trong 10 min, ly tâm 3000-4000 vòng/min, sau đỏ để lạnh trong 10 min, lấy dịch trong và làm bay hơi đến khô trên bể cách thủy (4.6), hòa tan cắn trong 5 ml methanoL (4.1).

Lọc qua màng lọc PVDF 0,45 μm (5.10).

6.3  Xác định bằng HPLC

6.3.1  Điều kiện sắc ký

- Pha động:	Triển khai sắc ký theo chương trình pha động (4.4)
- Detector:	PDA hoặc tương đương ở bước sóng 240 nm
- Thể tích tiêm:	10 μL
- Tốc độ dòng:	0,7 mL/min
- Nhiệt độ buồng cột:	40 °C
- Thời gian sắc ký:	45 min

6.3.2  Tính tương thích hệ thống:

6.3.2.1  Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp (6.1.2), xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích hoặc chiều cao pic, RSD phải nhỏ hơn 2,0 % ở tất cả các chất chuẩn.

6.3.2.2  Độ phân giải giữa các pic liền kề nhau trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp (6.1.2) phải lớn hơn 1,5.

6.3.2.3  Hệ số bất đối xứng của các pic phải từ 0,9 ÷ 1,5

6.3.3  Tiêm lần lượt các dung dịch sau:

- Các dung dịch chuẩn.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp.

- Dung dịch thử

7  Đánh giá kết quả

7.1  Mẫu thử được xác định là dương tính với một hợp chất steroid khi:

- Thời gian lưu của pic tương ứng trong mẫu thử khác biệt không quá 1 % so với thời gian lưu của pic chính tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn, phổ hấp thụ UV của pic trong dung dịch mẫu thử và pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn có chỉ số tương đồng không ít hơn 90 %.

- Pic phải đáp ứng các yêu cầu mục 6.3.2.2 và 6.3.2.3.

7.2  Mẫu thử được xác định là âm tính với một hợp chất steroid khi diện tích hay chiều cao của pic tương ứng trong mẫu thử nhỏ hơn diện tích hay chiều cao của pic chính tương ứng trong sắc ký đồ mẫu tự tạo có nồng độ ứng với LOD pha trong dung dịch chuẩn.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:

a) Tất cả thông tin cần thiết để nhận biết mẫu;

b) Tất cả thông tin cần thiết để nhận biết phòng thí nghiệm thực hiện thử nghiệm;

c) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

e) Ngày nhận mẫu phòng thí nghiệm;

f) Ngày kết thúc thử nghiệm;

g) Kết quả thu được và đơn vị biểu thị kết quả;

h) Bất kỳ thao tác nào không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

i) Nhận dạng và chữ ký của người chịu trách nhiệm đối với báo cáo thử nghiệm.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin phương pháp HPLC

- LOD cho tất cả các steroid trong dung dịch chuẩn là 55 μg/mL tương ứng trong mẫu thử 250 μg/g (ACM 007)

- LOD cho tất cả các steroid trong dung dịch chuẩn là 1 μg/mL tương ứng trong mẫu thử khoảng 5 μg/g (khảo nghiệm)

Hình A.1 - Sắc kí đồ và thông tin pic của dung dịch chuẩn

Hình A.2 - Phổ UV của dung dịch chuẩn

Hình A.2 - (kết thúc)

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Định tính các steroid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

B.1  Phạm vi áp dụng

Phương pháp này dùng để định tính các steroid (bao gồm hydrocortison acetat, dexamethason, betamethason, betamethason 17-valerat và triamcinolon acetonid) trong sản phẩm mỹ phẩm

B.2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng phương pháp này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thí áp dụng bàn được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

B.3  Nguyên tắc

Sau khi chiết steroid bằng ethyl acetat (đối với mẫu thử dạng lỏng) đã được trung hòa hoặc methanol (đối với mẫu thử dạng kem), các steroid được tách bởi phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC và xác định bởi đèn UV, bước sóng 254 nm, sử dụng các chất chuẩn tương ứng.

B.4  Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích hoặc có chất lượng tương đương.

CẢNH BÁO: Công việc phân tích phải được tiến hành trong môi trường phòng thử nghiệm phù hợp, được trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng tay).

B.4.1  Dicloromethan

B.4.2  Ethyl acetat

B.4.3  Nước

B.4.4  Methanol

B.4.5  Anisaldehyd

B.4.6  Acid sulfuric đậm đặc

B.4.7  Dung dịch acid hydrocloric 0,5 M

B.4.8  Dung dịch amonium hydroxyd 0,5 M

B.4.9  Acid acetic băng

B.4.10  Dung môi khai triển: Dicloromethan - methanol - nước (95.5:0,2)

B.4.11  Chất đối chiếu:

B.4.11.1  Hydrocortison acetat

B.4.11.2  Dexamethason

B.4.11.3  Betamethason

B.4.11.4  Betamethason 17-valerat

B.4.11.5  Triamcinolon acetonid

B.4.12  Thuốc thử phát hiện (chỉ pha khi dùng)

Lấy chính xác 50 mL acid acetic băng (B.4.9) vào bình định mức 100 mL (B.5.4) thêm 0,5 mL anisaldehyd (B.5.5), 11 mL acid sulfuric đậm đặc (B.5.6), lắc nhẹ nhàng.

B.5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

B.5.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

B.5.2  Đèn soi UV, bước sóng 254 nm

B.5.3  Bản mỏng TLC, silica gel 60 F254, 10 x 20 cm; bề dày 0,25 mm (Merck hoặc tương đương)

B.5.4  Bình định mức, loại A, với các dung tích khác nhau

B.5.5  Bình chiết, loại A

B.5.6  Bể cách thủy

B.5.7  Bể siêu âm

B.5.8  Bình sắc ký

B.5.9  Dụng cụ phun thuốc thử

B.5.10  Máy ly tâm, có thể quay ở tốc độ từ 3000 đến 4000 vòng/min

B.5.11  Máy lắc

B.5.12  Máy đo pH

B.5.13  Màng lọc PVDF, kích thước lỗ lọc 0,45 μm hoặc tương đương

B.5.14  Pipet thủy tinh, loại A, với các dung tích khác nhau

B.5.15  Tủ sấy

B.5.16  Mao quản chấm sắc ký - micropipet

B.6  Cách tiến hành

B.6.1  Chuẩn bị dung dịch chuẩn

B.6.1.1  Dung dịch chuẩn

Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn đối chiếu vào các bình định mức 10 mL (B.5.4) riêng biệt, thêm 5 mL methanol (B.4.4) siêu âm 5 min, tiếp tục thêm methanol (B.4.4) vừa đủ đến thể tích, trộn đều.

B.6.1.2  Dung dịch chuẩn hỗn hợp

Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn đối chiếu vào bình định mức 10 mL (B.5.4), thêm 5 mL methanol (B.4.4) siêu âm 5 min, tiếp tục thêm methanol (B.4.4) vừa đủ đến thể tích, trộn đều.

B.6.2  Chuẩn bị dung dịch thử

B.6.2.1  Mẫu dạng lỏng

Lấy chính xác khoảng 15 mL (B.5.14) mẫu thử, trung hòa đến pH 7 bằng dung dịch acid hydrocloric 0,5 M (B.4.7) hoặc dung dịch amoni hydroxyd 0,5 M (B.4.8), chiết 2 lần mỗi lần với 20 mL ethyl acetat (B.4.2), loại bỏ lớp nước, lọc và tập trung dịch chiết ethyl acetat, bay hơi đến cắn trên bể cách thủy (B.5.6), hòa tan cắn trong 5 mL methanol (B.4.4), lọc qua màng lọc PVDF 0,45 μm (B.5.13).

B.6.2.2  Mẫu dạng kem

Cân chính xác khoảng 5,000 g mẫu thử trong ống ly tâm, thêm 20 mL methanol (B.4.4), làm ấm trên bể cách thủy (B.5.6) ở 60 °C khoảng 10 min lắc mạnh bằng máy lắc (B.5.11) trong 5 min. Ly tâm (B.5.10) ở 3000 - 4000 vòng/min trong 10 min, sau đó để vào tủ lạnh trong 10 min, bay hơi dung dịch trong phía trên đến cắn trên bể cách thủy (B.5.6), hòa tan cắn trong 5 mL methanol (B.4.4), lọc qua màng lọc PVDF 0,45 μm (B.5.13).

B.6.3  Tiến hành sắc ký

B.6.3.1  Điều kiện sắc ký lớp mỏng

Hoạt hóa bản mỏng (B.5.3) ở 100 °C trong 10 min.

Bão hòa bình sắc ký (B.5.8) với hệ dung môi triển khai (B.4.10).

B.6.3.2  Chấm lên bản mỏng (B.5.3) 20 μL của mỗi dung dịch thử; dung dịch chuẩn đối chiếu; hỗn hợp dung dịch thử - dung dịch chuẩn với tỷ lệ (1:1).

B.6.3.3  Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm.

B.6.4  Phát hiện

Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng và quan sát bản mỏng dưới đèn soi UV, bước sóng 254 nm (B.5.2), đánh dấu vị trí của các vết trên bản mỏng

Phun thuốc thử phát hiện (B.4.14), để khô.

Để trong tủ sấy (B.5.15) ở 120 °C trong 10 min, quan sát màu của vết nhận được.

B.7  Đánh giá kết quả

B.7.1 Tính giá trị R_f của mỗi vết quan sát được bằng công thức sau:

Trong đó:

a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết. b: khoảng cách đường đi của dung môi.

B.7.2  Quan sát vị trí và màu sắc, các vết sắc ký khi soi đèn và sau khi phun thuốc thử của mẫu thử và mẫu chuẩn. So sánh các vết thu được từ mẫu thử với các vết mẫu chuẩn tương ứng về trị số R_f và màu sắc sau khi phun thuốc thử.

B.7.3  Thông tin tham khảo

Bảng B.1 - Vị trí và màu sắc, các vết sắc ký sau khi phun thuốc

- Phương pháp này dùng để định tính: cortison acetat, prednisolon, prednison, tlucinolon acetonid, betamethason 21-valerat và hydrocortison.

- Trường hợp dương tính theo phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), thực hiện thêm phương pháp HPLC để khẳng định.