Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13417:2021 (ISO 16256:2012) về Thử nghiệm lâm sàn trong phòng thí nghiệm và hệ thống thử nghiệm chẩn đoán in vitro - Phương pháp tham chiếu để thử nghiệm hoạt tính in vitro của các chất kháng nấm liên quan đến các bệnh nhiễm trùng

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13417:2021

ISO 16256:2012

THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ HỆ THỐNG THỬ NGHIỆM CHẨN ĐOÁN IN VITRO - PHƯƠNG PHÁP THAM CHIẾU ĐỂ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH IN VITRO CỦA CÁC CHẤT KHÁNG NẤM LIÊN QUAN ĐẾN CÁC BỆNH NHIỄM TRÙNG

Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems - Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against yeast fungi involved in infectious diseases

Lời nói đầu

TCVN 13417:2021 hoàn toàn tương đương ISO 16256:2012.

TCVN 13417:2021 do Viện Trang thiết bị và Công trình y tế biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Các thử nghiệm tính nhạy in vitro được thực hiện trên các vi sinh vật bị nghi ngờ gây bệnh, đặc biệt nếu sinh vật được cho là thuộc về loài có thể biểu hiện khả năng kháng thuốc đối với các thuốc kháng sinh sử dụng thường xuyên. Các thử nghiệm này cũng rất quan trọng trong giám sát sự kháng thuốc, trong các nghiên cứu dịch tễ học về tính nhạy và trong các so sánh các thuốc mới và thuốc hiện có.

Các quy trình pha loãng được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chất kháng sinh và đại diện cho phương pháp tham chiếu để kiểm tra tính nhạy kháng nấm. Các phương pháp MIC được sử dụng trong giám sát sự kháng thuốc, trong thử nghiệm so sánh các thuốc mới cho mục đích nghiên cứu hoặc đăng ký, để xác định tính nhạy của các vi sinh vật cho kết quả tương đương trong các thử nghiệm thường quy, cho các thử nghiệm với các sinh vật mà các thử nghiệm thường quy có thể không đáng tin cậy và khi cần kết quả định lượng cho việc xử lý lâm sàng. Trong các thử nghiệm pha loãng, các vi sinh vật được kiểm tra khả năng tạo ra sự phát triển rõ rệt trên một loạt đĩa thạch (pha loãng thạch) hoặc trong canh thang (pha loãng canh thang) có chứa các dung dịch pha loãng nối tiếp của tác nhân kháng sinh.

Nồng độ thấp nhất của chất kháng sinh (tính bằng mg/l), trong các điều kiện thử nghiệm in vitro xác định, làm giảm sự phát triển có thể nhìn thấy hoặc đo lường được bằng mặt quang học của vi sinh vật trong một khoảng thời gian xác định được gọi là MIC. MIC là một chỉ dẫn cho bác sĩ lâm sàng về tính nhạy của vi sinh vật đối với chất kháng sinh và hỗ trợ các quyết định điều trị. Việc đối chứng cẩn thận và tiêu chuẩn hóa là cần thiết đối với độ tái lập bên trong và giữa các phòng xét nghiệm do kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi phương pháp sử dụng. Người ta chấp nhận rằng các phép thử MIC trong canh thang có thể tái lập được trong vòng một độ pha loãng gấp đôi của điểm kết thúc thật (nghĩa là ± 1 giếng hoặc ống trong loạt pha loãng tăng gấp đôi).

Pha loãng canh thang là một kỹ thuật trong đó các ống chứa đựng các thể tích canh thang giống hệt nhau cùng với các dung dịch chất kháng sinh nồng độ tăng dần (thường là gấp đôi) được cấy một số lượng vi sinh vật đã biết.

Độ vi pha loãng canh thang biểu thị tính năng của thử nghiệm pha loãng canh thang trong các khay vi pha loãng.

Các phương pháp tham chiếu mô tả trong tiêu chuẩn này dùng cho thử nghiệm các nuôi cấy nấm men thuần chủng. Các phương pháp vi pha loãng canh thang mô tả trong tiêu chuẩn này giống với các phương pháp đã mô tả bởi Viện Tiêu chuẩn Xét nghiệm và Lâm sàng (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI) và bởi Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm Tính nhạy Kháng sinh (EUCAST). Các phương pháp này đã chứng tỏ cung cấp các MIC của fluconazole cơ bản giống nhau, nếu không muốn nói là giống nhau đến 2 mg/l. Các nghiên cứu với nhiều chất kháng nấm khác đã được lên kế hoạch hoặc đang tiến hành. Phòng thí nghiệm muốn sử dụng tiêu chuẩn này để tiến hành các nghiên cứu các chất kháng nấm mới hơn, hoặc làm phương pháp tham chiếu để so sánh các MIC thu được từ một thiết bị chẩn đoán, nên lựa chọn quy trình dựa trên việc lựa chọn số đọc MIC xác định bằng mắt (phương pháp CLSI) hoặc bằng cách sử dụng quang phổ kế (phương pháp EUCAST). Trong cả hai trường hợp, cần tuân thủ một cách rõ ràng các chi tiết quy trình cho tùy chọn đó.

THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ HỆ THỐNG THỬ NGHIỆM CHẨN ĐOÁN IN VITRO - PHƯƠNG PHÁP THAM CHIẾU ĐỂ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH IN VITRO CỦA CÁC CHẤT KHÁNG NẤM LIÊN QUAN ĐẾN CÁC BỆNH NHIỄM TRÙNG

Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems - Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against yeast fungi involved in infectious diseases

CẢNH BÁO - Việc sử dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, hoạt động và thiết bị gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không giải quyết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng nó. Người sử dụng tiêu chuẩn này có trách nhiệm thiết lập các thực hành sức khỏe và an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng những hạn chế luật định trước khi sử dụng.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp thử tính nhạy với các chất kháng nấm của nấm men, kể cả Candida spp và Cryptococcus neoformans, gây ra nhiễm trùng. Phương pháp tham chiếu mô tả ở đây vẫn chưa được sử dụng trong các nghiên cứu về các dạng lên men của nấm lưỡng hình, chẳng hạn như B. dermatitidis và/hoặc H. capsulatum. Hơn nữa, việc thử nghiệm nấm sợi (nấm mốc) dẫn đến một số vấn đề bổ sung trong quá trình tiêu chuẩn hóa chưa được giải quyết bởi quy trình hiện hành. Các phương pháp tham chiếu dùng cho thử nghiệm tính nhạy của nấm sợi với chất kháng nấm trong dung dịch pha loãng canh thang đã được phát triển và hiện có sẵn như tài liệu CLSI M38 và tài liệu EUCAST E.DEF 9.1.^{[4][5][6][7][8]}

Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp tham chiếu pha loãng vi lượng canh thang có thể được thực hiện bằng một trong hai cách. Một cách liên quan đến việc xác định MIC bằng mắt (phương pháp CLSI); cách thứ hai liên quan đến việc xác định MIC bằng quang phổ kế (phương pháp EUCAST)^[2]. MIC phản ánh hoạt tính của thuốc trong các điều kiện thử nghiệm được mô tả và có thể được diễn giải cho các mục đích điều trị lâm sàng bằng cách tính đến các yếu tố khác, chẳng hạn như dược lý của thuốc hay các cơ chế kháng chất kháng nấm. MIC có thể được phân loại là “nhạy” (S), “nhạy phụ thuộc liều” (S DD), “trung gian” (I), “không nhạy” (NS) hoặc “kháng thuốc” (R). Ngoài ra, có thể sử dụng các phân bố MIC để xác định các quần thể nấm kiểu hoang dã hoặc không hoang dã. Việc diễn giải lâm sàng giá trị MIC nằm ngoài phạm vi của tiêu chuẩn này; Có thể tìm thấy các điểm gãy danh mục diễn giải cụ thể cho các phương pháp có nguồn gốc từ CLSI và EUCAST bằng cách tham khảo các bảng diễn giải mới nhất được cung cấp bởi các tổ chức ^[2][9].

Nên so sánh các phương pháp thử nghiệm thường quy tính nhạy hay các thiết bị thử nghiệm chẩn đoán với phương pháp tham chiếu này để đảm bảo các kết quả tương ứng và đáng tin cậy cho các mục đích xác thực hoặc đăng ký.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1

Chất kháng nấm (antifungal agent)

Chất có nguồn gốc sinh học, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt nấm, và do đó có thể được sử dụng trong điều trị các nhiễm trùng

CHÚ THÍCH: Các chất tiệt khuẩn đồ vật, chất sát trùng mô và chất bảo quản không được bao gồm trong định nghĩa này.

2.2

Chất kháng nấm - đặc tính (antifungal agents - properties)

2.2.1

Hiệu lực (potency)

Phần hoạt tính của một chất thử, được xác định trong một xét nghiệm sinh học so với bột tham chiếu của cùng một chất

CHÚ THÍCH: Hiệu lực được biểu thị bằng phần khối lượng theo miligam trên gam (mg /g), hoặc bằng lượng hoạt tính theo đơn vị quốc tế (IU) trên gam, hoặc dưới dạng phần trăm thể tích hay khối lượng, hoặc dưới dạng nồng độ lượng chất (phần khối lượng) theo mol trên lít của các thành phần trong chất thử nghiệm.

2.2.2

Nồng độ (concentration)

Lượng chất kháng nấm trong một thể tích chất lỏng xác định

CHÚ THÍCH 1: Nồng độ được biểu thị bằng mg/l.

CHÚ THÍCH 2: mg /I = μg /ml nhưng không khuyến khích sử dụng đơn vị μg /ml.

2.3

Dung dịch gốc (stock solution)

Dung dịch ban đầu được sử dụng để pha loãng thêm

2.4

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimum inhibitory concentration)

Nồng độ thấp nhất, trong các điều kiện thử nghiệm in vitro xác định, làm giảm sự phát triển tới một lượng thỏa thuận, trong một khoảng thời gian xác định

CHÚ THÍCH: MIC được biểu thị bằng mg/l.

2.5

Điểm gãy (breakpoint)

BP

Giá trị MIC cụ thể có thể được sử dụng để chỉ định nấm vào các phân loại lâm sàng “nhạy”, “nhạy phụ thuộc vào liều”, “trung gian”, “không nhạy” và “kháng thuốc”

CHÚ THÍCH: Đối với các điểm gãy diễn giải hiện tại, có thể tham khảo các ấn phẩm mới nhất của các tổ chức sử dụng phương pháp tham chiếu này (ví dụ: CLSI và EUCAST).

2.5.1

Cách đọc trực quan bằng mắt (visual reading pathway)

2.5.1.1

Nhạy (susceptible)

S

Chủng nấm bị ức chế in vitro bởi một nồng độ của chất kháng nấm có liên quan đến khả năng thành công điều trị cao.

CHÚ THÍCH 1: Các chủng nấm được phân loại là nhạy bằng cách áp dụng các điểm gãy thích hợp trong hệ thống thử nghiệm kiểu hình xác định.

CHÚ THÍCH 2: Điểm gãy này có thể thay đổi trong một số trường hợp nhất định (ví dụ: thay đổi liều lượng thuốc thường sử dụng, xuất hiện các cơ chế kháng thuốc mới).

2.5.1.2

Nhạy phụ thuộc liều lượng (susceptible dose-dependent)

S-DD

Chủng nấm bị ức chế in vitro bởi một nồng độ chất kháng nấm có thể đạt được in vivo bằng cách sử dụng các liều cao hơn bình thường khi có thể sử dụng lịch trình liều lượng như vậy một cách an toàn

CHÚ THÍCH 1: Các chủng nấm được phân loại là nhạy phụ thuộc liều lượng bằng cách áp dụng các điểm gãy thích hợp trong một hệ thống thử nghiệm kiểu hình xác định.

CHÚ THÍCH 2: Lớp nhạy này ngụ ý rằng một nhiễm trùng do tác nhân phân lập này có thể được điều trị một cách thích hợp ở các vị trí cơ thể mà thuốc có thể tập hợp một cách sinh lý hoặc khi có thể sử dụng một liều lượng cao.

CHÚ THÍCH 3: Điểm gãy này có thể thay đổi trong một số trường hợp (chẳng hạn ở các liều lượng sử dụng thông thường, khi xuất hiện các cơ chế kháng thuốc mới).

2.5.1.3

Nhạy trung gian (intermediate)

I

Vi sinh vật có một mức độ hoạt tính của chất kháng sinh liên quan đến hiệu quả điều trị không chắc chắn

CHÚ THÍCH: Nhiễm trùng do chủng phân lập này có thể được điều trị thích hợp ở các vị trí cơ thể nơi thuốc tập trung nhiều hoặc khi có thể sử dụng liều lượng thuốc cao; nó cũng chỉ ra một vùng đệm cần ngăn chặn các yếu tố kỹ thuật nhỏ, không kiểm soát, khỏi việc gây ra những khác biệt lớn trong các diễn giải.

2.5.1.4

Không nhạy (nonsusceptible)

NS

Phân loại sử dụng cho các nấm men hiện chỉ có phân loại diễn giải nhạy, mà không có phân loại diễn giải nhạy phụ thuộc liều lượng, nhạy trung gian hay kháng thuốc (tức là phân loại diễn giải chỉ nhạy)

CHÚ THÍCH: Phân loại này thường được dành cho các chất kháng nấm mới vẫn chưa gặp phải chủng phân lập kháng thuốc nào.

2.5.1.5

Kháng thuốc (resistant)

R

Chủng nấm bị ức chế in vitro bởi một nồng độ của chất kháng nấm có liên quan đến khả năng thất bại điều trị cao

CHÚ THÍCH 1: Chủng nấm được phân loại là kháng thuốc bằng cách áp dụng các điểm gãy thích hợp trong một hệ thống thử nghiệm kiểu hình xác định.

CHÚ THÍCH 2: Điểm gãy này có thể thay đổi trong một số trường hợp nhất định (ví dụ: thay đổi về liều lượng thuốc thường dùng, xuất hiện các cơ chế kháng thuốc mới).

2.5.2

Cách đọc quang phổ kế (spectrophotometric reading pathway)

2.5.2.1

Nhạy (susceptible)

S

Vi sinh vật có mức độ hoạt tính kháng vi sinh liên quan đến khả năng điều trị thành công cao

2.5.2.2

Trung gian (intermediate)

Vi sinh vật có mức độ hoạt tính của chất kháng sinh liên quan đến hiệu quả điều trị không chắc chắn

CHÚ THÍCH: Nhiễm trùng do chủng phân lập này có thể được điều trị thích hợp ở các vị trí cơ thể nơi thuốc tập trung nhiều hoặc khi có thể sử dụng liều lượng thuốc cao; nó cũng chỉ ra một vùng đệm cần ngăn ngừa các yếu tố kỹ thuật nhỏ, không kiểm soát khỏi việc gây ra những khác biệt lớn trong các diễn giải.

2.5.2.3

Kháng thuốc (resistant)

R

Vi sinh vật có mức hoạt tinh kháng sinh liên quan đến khả năng điều trị thất bại cao

2.6

Loại hoang dã (wild type)

Không có các cơ chế kháng thuốc đạt được ở một chủng nấm nhất định đối với chất kháng nấm

2.7

Chủng chuẩn (reference strain)

Chủng nấm đã được lập danh mục, đã mô tả rõ và có các kiểu hình và /hoặc kiểu gen nhạy kháng nấm xác định và ổn định

CHÚ THÍCH: Các chủng chuẩn được lưu giữ làm các mẫu nuôi cấy dự trữ, từ đó tạo ra các mẫu nuôi cấy làm việc. Có thể nhận được chúng từ các bộ sưu tập nuôi cấy và sử dụng cho kiểm soát chất lượng.

2.8

Phương pháp thử nghiệm tính nhạy (susceptibility testing method)

2.8.1

Pha loãng canh thang (broth dilution)

Kỹ thuật trong đó các ống đựng được đổ các thể tích thích hợp của dung dịch chất kháng nấm với các nồng độ tăng dần (thường gấp hai lần) và các thể tích thích hợp canh thang cùng với một lượng chất cấy xác định

CHÚ THÍCH: Mục đích của phương pháp này là xác định MIC.

2.8.2

Vi pha loãng (microdilution)

Thực hiện pha loãng canh thang trong các khay vi pha loãng với dung tích ≤ 300 μl mỗi giếng

2.9

Canh thang (broth)

Môi trường lỏng sử dụng cho sự phát triển nấm men trong ống nghiệm (in vitro)

2.10

Chất cấy (inoculum)

Số lượng nấm men trong một dịch treo, được tính theo thể tích cuối

CHÚ THÍCH: Chất cấy được biểu thị bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mililit (CFU /ml).

2.11

Ảnh hưởng của chất cấy (inoculum effect)

Sự thay đổi MIC liên quan đến sự thay đổi chất cấy

3  Quy trình thử nghiệm

3.1  Yêu cầu chung

Các thử nghiệm được thực hiện trong các khay vi pha loãng bằng nhựa sử dụng một lần. Phương pháp này dựa trên việc chuẩn bị các dung dịch làm việc chứa chất kháng nấm với độ mạnh tăng lên gấp đôi ở thể tích 100 μl mỗi giếng và bổ sung chất cấy cũng với thể tích 100 μl.

3.2  Môi trường nuôi

3.2.1  Yêu cầu chung

Phải sử dụng canh thang RPMI-1640 (xem Phụ lục A để biết chi tiết về việc chuẩn bị hai phiên bản canh thang đường glucose RPMI 1640).

3.2.2  Cách đọc trực quan bằng mắt

Môi trường RPMI-1640 cần chứa 0,2 % glucose. Chuẩn bị canh thang RPMI-1640 và chia thành các dung dịch cùng thể tích với mức pha loãng gấp đôi chất kháng nấm và cung cấp chất cấy vào thể tích tương đương canh thang RPMI-1640.

3.2.3  Cách đọc quang phổ kế

Môi trường RPMI-1640 cần chứa 2 % glucose. Chuẩn bị canh thang RPMI-1640 và các chất kháng nấm ở độ mạnh thay đổi gấp đôi, sau đó thêm chất cấy chứa trong cùng một thể tích nước cất.

3.3  Chất kháng nấm

3.3.1  Yêu cầu chung

Các chất kháng nấm phải được lấy trực tiếp từ nhà sản xuất hoặc từ các nguồn thương mại đáng tin cậy; các chế phẩm dược phẩm sẵn có để sử dụng lâm sàng không được chấp nhận. Các chất kháng nấm phải được cung cấp cùng với số lô, hiệu lực, hạn sử dụng và thông tin chi tiết về các điều kiện bảo quản khuyến nghị. Các chất này phải được bảo quản trong vật chứa đậy kín ở nơi tối, ở nhiệt độ -20 °C, cùng với chất hút ẩm trừ khi nhà sản xuất khuyến cáo khác. Các thuốc hút ẩm nên được phân phối thành các lượng nhỏ, mỗi phần được sử dụng trong một lần thử nghiệm.

Để vật chứa ấm lên đến nhiệt độ phòng trước khi mở ra để tránh ngưng tụ và mất hiệu lực.

3.3.2  Chuẩn bị dung dịch gốc

Phải sử dụng các cân phân tích đã hiệu chuẩn để cân chất kháng nấm. Việc cho phép hiệu lực của bột phải được thực hiện theo công thức sau đây để thu được lượng chất kháng nấm hoặc thể tích chất pha loãng cần thiết cho một dung dịch tiêu chuẩn:

trong đó:

p là nồng độ của dung dịch gốc, theo mg/l;

m là khối lượng chất kháng nấm (bột), theo g;

P là hiệu lực của chất kháng nấm (bột), theo mg/g;

V là thể tích của chất pha loãng, theo lít (l).

Nồng độ của dung dịch gốc nên từ 1000 mg/l trở lên, mặc dù độ hòa tan của một số chất kháng nấm là một yếu tố hạn chế. Nồng độ thực tế của các dung dịch gốc phụ thuộc vào phương pháp chuẩn bị các dung dịch làm việc (pha loãng nối tiếp). Một số chất kháng nấm đòi hỏi dung môi thay thế (xem Bảng 1). Việc tiệt khuẩn các dung dịch pha loãng thường không cần thiết. Nếu được yêu cầu, việc tiệt khuẩn nên được thực hiện bằng cách lọc qua màng và các mẫu thử nghiệm trước và sau khi tiệt khuẩn phải được so sánh bằng xét nghiệm để đảm bảo rằng không có sự hấp phụ trên màng lọc.

Trừ khi có sẵn thông tin về độ ổn định của dung dịch gốc trong các điều kiện bảo quản quy định, chúng nên được chuẩn bị mới cho mỗi lô thử nghiệm.

Bảng 1 - Dung môi và chất pha loãng dùng để chuẩn bị dung dịch gốc chất kháng nấm

3.3.3  Chuẩn bị các dung dịch làm việc

Khoảng nồng độ được chọn để thử nghiệm phụ thuộc vào các sinh vật và chất kháng nấm. Dải đã chọn phải cho phép xác định đầy đủ điểm cuối MIC đối với các chủng chuẩn thích hợp. Chuẩn bị một loạt pha loãng gấp đôi dựa trên 1 mg/l trong canh thang glucose RPMI-1640. Quy trình nêu trong Bảng 2 và Bảng 3 được biết là có thể tạo ra một loạt dung dịch pha loãng đạt yêu cầu một cách đáng tin cậy và cần được tuân thủ trừ khi một phương pháp thay thế được xác thực một cách cẩn thận. Ví dụ, công trình của một nhóm đã báo cáo rằng việc pha loãng nối tiếp các hợp chất ưa nước hơn có thể tạo ra kết quả chấp nhận được. Các dung dịch làm việc cần phải được sử dụng trong cùng ngày trừ khi có sẵn thông tin từ nhà sản xuất về độ ổn định của các dung dịch này trong các điều kiện bảo quản quy định.

Bảng 2 - Biểu đồ chuẩn bị dung dịch pha loãng của chất kháng nấm tan trong nước sử dụng trong các thử nghiệm nhạy trong canh thang pha loãng

Bảng 3 - Biểu đồ chuẩn bị loạt dung dịch của chất kháng nấm không tan trong nước sử dụng trong các thử nghiệm nhạy pha loãng trong canh thang

3.3.4  Chuẩn bị các khay vi pha loãng chứa canh thang cho các thử nghiệm đọc bằng mắt

3.3.4.1  Cách đọc bằng mắt

Phân phối 100 μl ung dịch làm việc vào 10 giếng của mỗi dãy khay vi pha cùng với gấp đôi các nồng độ cuối mong muốn chất kháng nấm trong 96 khay nhựa đáy tròn dùng một lần.

Trên mỗi hàng khay nên đưa vào ít nhất nhất một giếng chứa 100 μl môi trường không chứa chất kháng nấm làm đối chứng sự phát triển cho mỗi chủng thử nghiệm. Tương tự như vậy, nên đưa vào một giếng chứa 200 μl môi trường không chứa chất kháng nấm làm giếng đối chứng âm không chứa chất cấy cho mỗi chủng thử nghiệm.

3.3.5  Chuẩn bị các khay vi pha cho các thử nghiệm đọc bằng quang phổ kế

3.3.5.1  Cách đọc quang phổ kế

Các dung dịch làm việc được phân phối vào các khay vi pha ở 100 μl mỗi giếng cùng với gấp đôi các nồng độ cuối mong muốn của chất kháng nấm trong môi trường nuôi đậm đặc gấp đôi trong 96 khay nhựa đáy phẳng dùng một lần.

Trên mỗi hàng khay nên đưa vào ít nhất một giếng chứa 100 μl môi trường không chứa chất kháng nấm làm đối chứng phát triển cho mỗi chủng thử nghiệm. Tương tự như vậy, nên đưa vào một giếng chứa 200 μl môi trường không chứa chất kháng nấm làm đối chứng âm không chứa chất cấy cho mỗi chủng thử nghiệm.

3.4  Bảo quản các khay vi pha

Các khay đã làm đầy có thể được sử dụng ngay lập tức hoặc có thể được bảo quản trong túi nhựa kín và ngay lập tức đặt vào trong tủ đông (phương pháp CLSI: đọc trực quan; - 70 °C tới tối đa 6 tháng; phương pháp EUCAST: đọc quang phổ kế; -70 °C trở xuống cho tới 6 tháng hoặc ở -20 °C không quá 1 tháng. Thời gian bảo quản cho phép sẽ được xác định dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc đối với các hợp chất riêng lẻ và sự phù hợp với phạm vi QC được chấp nhận. Khay không được bảo quản trong tủ đông tự rã đông và để rã đông. Các dung dịch chống nấm không được đông lạnh lại, vì các chu kỳ đông lạnh-rã đông lặp đi lặp lại sẽ đẩy nhanh sự phân hủy của một số chất kháng nắm.

3.5  Chuẩn bị chất cấy - yêu cầu chung

3.5.1  Yêu cầu chung

Việc chuẩn hóa chất cấy là cần thiết cho các thử nghiệm độ nhạy của dung dịch pha loãng canh thang được chính xác và có thể tái lập.

Tất cả các dòng phân lập phải được cấy phụ vào mòi trường thạch không ức chế để đảm bảo độ tinh khiết và khả năng sống.

3.5.2  Chuẩn bị chất cấy cho phép đọc thử nghiệm bằng mắt

Chất cấy cần được chuẩn bị bằng cách lấy năm khuẩn lạc có đường kính khoảng 1 mm từ nuôi cấy cũ Candida spp trong vòng 20 (± 2) h hoặc nuôi cấy cũ C. neoformans trong vòng 46 (±2) h.

Các khuẩn lạc phải được tạo dịch treo trong 5 ml nước muối vô trùng 0,85 % hoặc nước vô trùng. Lưu ý rằng C. neoformans có tốc độ phát triển chậm. Nhiệt độ phát triển tối ưu của C. neoformans là 30 °C.

Dịch treo thu được phải được quay xoáy trong 15 s và điều chỉnh mật độ tế bào nhờ máy đo quang phổ bằng cách thêm đủ nước muối vô trùng hoặc nước vô trùng để đạt được mật độ quang học tương đương với mật độ quang tạo ra bởi tiêu chuẩn McFarland 0,5 (xem Phụ lục B) ở bước sóng 530 nm. Quy trình này sẽ tạo ra dịch treo nấm men từ 10⁶ đến 5 x 10⁶ CFU /ml.

Trộn dịch treo nấm men đã điều chỉnh bằng máy trộn quay, pha loãng 1:50 với môi trường nuôi canh thang RPMI 1640 thích hợp, và tiếp tục pha loãng 1:20 với môi trường để thu được hai lần chất cấy thử nghiệm cuối cùng (10³ đến 5 x 10³ CFU / ml). Pha loãng chất cấy (gấp đôi) 1:1 khi cấy vào các giếng 100 μl sẽ tạo ra kích thước chất cấy cuối cùng mong muốn là 0,5 x 10³ đến 2,5 x 10³ CFU/ml.

3.5.3  Chuẩn bị chất cấy để đọc thử nghiệm bằng quang phổ kế

Chất cấy cần được chuẩn bị bằng cách chọn năm khuẩn lạc có đường kính khoảng 1 mm từ nuôi cấy cũ Candida spp trong vòng 18 đến 24 h hoặc từ nuôi cấy cũ C. neoformans trong vòng 46 (± 2) h. Các khuẩn lạc phải được tạo dịch treo trong 5 ml nước cất vô trùng.

Dịch treo thu được phải được xoáy trong 15 s và điều chỉnh mật độ tế bào nhờ máy đo quang phổ bằng cách thêm đủ nước muối vô trùng hoặc nước vô trùng để đạt được mật độ quang học tương đương với mật độ quang tạo ra bởi tiêu chuẩn McFarland 0,5 (xem Phụ lục B) ở bước sóng 530 nm. Quy trình này sẽ tạo ra dịch treo nấm men từ 10⁶ đến 5 x 10⁶ CFU/ ml.

Trộn dịch treo nấm men đã điều chỉnh bằng máy trộn xoáy, pha loãng 1:10 với nước cất vô trùng để thu được chất cấy thử nghiệm có độ đậm giảm gấp đôi (10⁵ đến 5 x 10⁵ CFU /ml). Pha loãng chất cấy (gấp đôi) 1:1 và cấy 100 μl chất cấy vào các giếng sẽ tạo ra kích thước chất cấy cuối cùng mong muốn từ 0,5 x 10⁵ đến 2,5 x 10⁵ CFU /ml.

3.6  Cấy vào các khay vi pha loãng

Các khay phải được cấy trong vòng 30 min sau khi chuẩn hóa dịch treo chất cấy để duy trì mật độ số lượng tế bào sống. Thêm vào mỗi giếng chứa 100 μl chất kháng nấm đã pha loãng trong canh thang (xem 3.5.2 và 3.5.3), một thể tích 100 μl dịch treo nấm men.

Thực hiện đếm tế bào sống một cách định kỳ trên các giếng đối chứng dương của khay pha loãng vi sinh để đảm bảo rằng các giếng thử nghiệm chứa số lượng CFU thích hợp dựa trên phương pháp sử dụng để đọc MIC. Điều này phải được thực hiện bằng cách lấy 10 μl ra khỏi giếng đối chứng phát triển sinh trưởng ngay sau khi cấy và pha loãng nó trong 1 ml nước canh hoặc nước muối (đối với phương pháp đọc bằng mắt) hoặc 2 ml nước cất vô trùng (đối với phương pháp đọc quang phổ). Trải 100 μl dịch treo đã pha loãng lên trên bề mặt một đĩa thạch thích hợp, sau đó được ủ qua đêm. Dịch treo thử nghiệm được chấp nhận phải có 5-125 khuẩn lạc.

3.7  Ủ các khay vi pha loãng

3.7.1  Yêu cầu chung

Các khay vi pha loãng phải được đậy kín trong túi polyetylen hoặc có nắp đậy kín trước khi ủ, hoặc một phương pháp khác ngăn hút ẩm. Để tránh làm nóng không đồng đều, không nên xếp chồng lên nhau các khay vi pha loãng cao hơn năm khay.

Các khay vi pha loãng được ủ ở 35 ± 2 °C trong môi trường không khí trong (22 ± 2) h đối với hầu hết các kết hợp thuốc kháng - nấm men. Một số chủng phân lập Cryptococcus có thể không phát triển đủ trừ khi nhiệt độ ủ được hạ xuống tới 30 °C.

3.7.2  Cách đọc trực quan bằng mắt

Thời gian ủ sẽ thay đổi tùy theo loài nấm men và chất kháng nấm thử nghiệm. Nhiều thử nghiệm có thể được đọc sau 24 h ủ. Xem Phụ lục C để biết thời gian ủ cụ thể. Để cập nhật thông tin này, vui lòng tham khảo tài liệu CLSI M27 ^[1].

3.7.3  Cách đọc quang phổ kế

Việc xác định MIC nên được thực hiện sau đọc 24 ± 2 h nếu độ hấp thụ của giếng đối chứng dương ≥ 0,2. Nếu độ hấp thụ <0,2, các thử nghiệm có thể được ủ lại trong 12 - 24 h. Không thể đọc được độ hấp thụ 0,2 sau 48 h được cho là thử nghiệm thất bại.

3.8  Đọc kết quả MIC

3.8.1  Yêu cầu chung

Kết quả chỉ được đọc khi có đủ sự phát triển của vi sinh thử nghiệm (tức là các quần lạc rõ ràng hoặc độ đục/độ hấp thụ chấp nhận được trong đối chứng phát triển dương), khi không có sự phát triển trong đối chứng không cấy hay đối chứng phát triển âm (nếu có) và khi độ tinh khiết chất cấy đã được thiết lập.

3.8.2  Phương pháp đọc trực quan

Với một số loại chất kháng nấm và một số chủng phân lập, có thể xảy ra sự phát triển vết (ức chế một phần sự phát triển trong phạm vi nồng độ chất kháng nấm rộng). Người ta ước tính có thể xảy ra hiện tượng này với fluconazole ở khoảng 5 % số chủng phân lập. Sự phát triển theo dấu vết này có thể làm cho một chủng phân lập có vẻ nhạy sau 24 h trở thành kháng thuốc hoàn toàn nếu thực hiện đọc 48 h. Vì lý do này, nên thực hiện đọc 24 h.

Để xác định MIC bằng mắt thường, các giếng của khay phải được kiểm tra từ phía đáy bằng các sử dụng thiết bị đọc có gương. Có thể hữu ích nếu lắc nhẹ nhàng sự phát triển trong khay trước khi đọc các điểm cuối. Đối với các chất flucytosine, azoles và echinocandin, lượng phát triển trong mỗi giếng được so sánh với lượng phát triển trong đối chứng phát triển dương, và MIC ghi lại là nồng độ thấp nhất của chất kháng nấm có thể ức chế đáng kể sự phát triển (ít nhất 50 %) khi so với đối chứng. Đối với amphotericin B, MIC là nồng độ giúp ức chế hoàn toàn sự phát triển.

3.8.3  Phương pháp đọc quang phổ kế

Để xác định các MIC bằng quang phổ, các khay vi pha loãng được đọc bằng đầu đọc sử dụng bước sóng từ 405 đến 530 nm. Nên trừ giá trị đọc của giếng đối chứng chứa môi trường nền khỏi các giếng khác. Đối với các chất flucytosine, azoles và echinocandin, lượng phát triển trong mỗi giếng được so sánh với lượng phát triển trong giếng đối chứng phát triển dương, và MIC được ghi lại là nồng độ thấp nhất của chất kháng nấm có thể ức chế đáng kể sự phát triển (ít nhất 50 %) khi so với đối chứng. Với amphotericin B, MIC là nồng độ đem lại sự ức chế phát triển ≥ 90 % so với đối chứng.

3.9  Diễn giải MIC

Việc diễn giải lâm sàng các giá trị MIC tạo ra bởi một trong hai cách thức trong tiêu chuẩn này cần dựa trên các điểm gãy đã được phê duyệt hiện tại bởi các tổ chức tiêu chuẩn tương ứng đã tạo cơ sở cho phương pháp thử nghiệm đó. Do vậy, việc diễn giải MIC của các chất kháng nấm được xác định bằng cách đọc trực quan các điểm cuối phải dựa trên các hướng dẫn mới nhất được công bố từ CLSI (www.CLSI.org)^[1,7] và MIC được xác định bằng các kết quả đo quang phổ cần được diễn giải bằng cách sử dụng các điểm gãy mới nhất có sẵn từ EUCAST (www.EUCAST.org)^[2].

4  Kiểm soát chất lượng (QC)

Chất lượng của các kết quả thử nghiệm được kiểm soát bằng cách sử dụng đồng thời các chủng đối chứng (xem Bảng 4 và 5). Các chủng đối chứng gốc phải được bảo quản đông khô hoặc đông lạnh (-70 °C đối với phương pháp đọc trực quan; -60 °C đối với phương pháp đọc quang phổ). Chuẩn bị các nuôi cấy làm việc bằng cách nuôi các chủng gốc trên môi trường thạch không ức chế. Chỉ có thể tạo ra các nuôi cấy phụ nữa từ nuôi cấy làm việc ban đầu. Thường xuyên thay thế chúng bằng các tủ đông nghiêng mới được chuẩn bị từ nguồn cung trong tủ đông ít nhất hai tuần một lần. Khi có sẵn, mỗi ngày nên thử nghiệm ít nhất hai chủng QC liên quan đến thử nghiệm đang tiến hành. Các khuẩn lạc thử nghiệm của các mẫu cấy đối chứng được xử lý giống như các mẫu nuôi thông thường. MIC của các chất kháng nấm đối với vi sinh đối chứng phải nằm trong phạm vi quy định trong Bảng 4 và 5 ^[2,7]. Nếu gặp phải giá trị nằm ngoài các giá trị đối chứng, nên lặp lại thử nghiệm để xác định xem các bước thiết yếu của quy trình hiện đã được kiểm soát tốt chưa. Nếu tiếp tục quan sát thấy các giá trị ngoài đối chứng thì phải kiểm tra cẩn thận tất cả các khía cạnh của quy trình và tạm dừng thử nghiệm thêm tham chiếu cho đến khi các giá trị đối chứng lại nằm trong phạm vi chính xác.

Bảng 4 - Các giới hạn MIC 24h và 48h khuyến nghị cho hai chủng QC dùng cho các thử nghiệm vi pha loãng trong canh thang đọc trực quan bằng mắt ^[12,13]

Bảng 5 - Giới hạn MIC khuyến nghị cho các chủng QC dùng cho thử nghiệm vi pha loãng canh thang đọc bằng quang phổ kế ^[2,14]

Phụ lục A

(tham khảo)

Môi trường RPMI-1640

A.1  Yêu cầu chung

Môi trường RPMI-1640 được đệm bởi 1 L dung dịch MOPS 0,165 M.

10,4 g bột RPMI-1640 chứa bột (với glutamine và phenol đỏ, không có bicarbonate).

34,53 g chất đệm MOPS (3- [N-morpholino] propanesulfonic acid).

Hòa tan môi trường chứa bột trong 900 ml nước cất. Thêm MOPS (nồng độ cuối 0,165M) và khuấy cho đến khi tan hoàn toàn. Trong khi khuấy, điều chỉnh pH đến 7,0 ở 25 °C bằng cách sử dụng dung dịch NaOH 1,0M. Bổ sung thêm nước để cho môi trường cuối cùng có thể tích 1 L. Vô khuẩn qua màng lọc và bảo quản ở 4 °C cho đến khi sử dụng.

Bảng A.1 - Thành phần môi trường RPMI-1640

(với glutamine và phenol đỏ nhưng không chứa bicarbonate)

Bảng A.2 - Các thành phần của môi trường RPMI-1640 2% glucose

A.2  Tài liệu tham khảo Phụ lục A

a) Clinical and Laboratory Standards Institute (2008). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; 3rd Informational Supplement M27-S3. Wayne, PA.

b) European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. (2007), EUCAST Definitive Document EDef 7.1: Method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts. Clinl Microbiol Infect; 14: 398-405, 2008.

Phụ lục B

(tham khảo)

Độ đục chuẩn McFarland 0,5 BaSO4

Để tiêu chuẩn hóa mật độ chất cấy, sử dụng một độ đục chuẩn BaSO4 (tiêu chuẩn 0,5 McFarland)

Quy trình này bao gồm các bước sau đây:

a) chuẩn bị độ đục này bằng cách thêm 0,5 ml dung dịch BaCl₂ 0,048 M (1,175 % w/v BaCl₂ x 2 H₂O) vào 99,5 ml dung dịch H₂SO₄ 0,18M (tỷ lượng thể tích 1 %);

b) kiểm tra mật độ chính xác của độ đục chuẩn bằng cách sử dụng quang phổ kế có đường sáng 1 cm và cuvet phù hợp để xác định độ hấp thụ. Độ hấp thụ ở bước sóng 625 nm phải là 0,08 đến 0,13 đối với tiêu chuẩn 0,5 McFarland;

c) phân phối 4 ml đến 6 ml vào các ống có nắp vặn cùng kích thước với các ống sử dụng trong nuôi cấy hoặc pha loãng chất cấy trong canh thang;

d) đậy chặt các ống này và bảo quản trong bóng tối ở nhiệt độ phòng;

e) lắc mạnh độ đục chuẩn này trên máy trộn xoáy cơ học ngay trước khi sử dụng;

f) thay thế các độ đục chuẩn hoặc kiểm tra lại mật độ của chúng sau ba tháng kể từ khi chuẩn bị.

Phụ lục C

(tham khảo)

Thời gian đọc chấp nhận để diễn giải MIC, sử dụng quy trình đọc MIC bằng mắt

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CLSI M27-A3, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Third Edition; Approved Standard. CLSI: Wayne, PA., 2008. (Phương pháp tham chiếu để thử nghiệm sự nhạy kháng nấm của nấm men trong canh thang pha loãng)

[2] European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. 2007), EUCAST Definitive Document EDef 7.1: Method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts. Clinl Microbiol Infect; 14: 398-405, 2008. (Tài liệu tin cậy EUCAST EDef 7.1: Phương pháp xác định MIC trong canh thang pha loãng của chất kháng nấm đối với các nấm lên men)

[3] Rodriguez-Tudella J.L., Donnelly J.P., Pfaller M.A., Chryssantou E., Warn P., Denning D.W. et al. Statistical analysis of correlation between fluconazole MICs for Candida spp. assessed by standard methods set forth by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (E.Dis 7.1) and CLSI (M27-A2). J. Clin. Microbiol. 2007, 45 (1) pp. 109-111. (Phân tích thống kê sự tương quan giữa các MIC của fluconazole đối với Candida spp được đánh giá bằng các phương pháp chuẩn do Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm Tính nhạy với Kháng sinh đưa ra)

[4] CLSI M38-A2, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi, Second Edition; Approved Standard. CLSI: Wayne, PA., 2008. (Phương pháp tham chiếu để thử nghiệm sự nhạy kháng nấm trong canh thang pha loãng của nấm sợi)

[5] Espinel-Ingroff A., Dawson K., Pfaller M. et al. Comparative and collaborative evaluation of standardization of antifungal susceptibility testing for filamentous fungi. Antimicrob. Agents Chemother. 1995, 39 pp. 314-319. (Đánh giá so sánh và cộng tác trong việc tiêu chuẩn hóa thử nghiệm tính nhạy kháng nấm đối với nấm sợi)

[6] Espinel-Ingroff A., Bartlett M., Bowden R. et al. Multicenter evaluation of proposed standardization procedure for antifungal susceptibility testing for filamentous fungi. J. Clin. Microbiol. 1997, 35 pp. 139-143. (Đánh giá của nhiều trung tâm về quy trình tiêu chuẩn hóa đề xuất cho thử nghiệm sự nhạy kháng nấm đối với nấm sợi)

[7] Rodriquez Tudela J.L., Donnelly J.P., Arendrup M.C., Arikan S., Barchiesi F., Bille J. et al. EUCAST Technical Note on the method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia-forming moulds. Clin. Microbiol. Infect. 2008 Oct, 14 (10) pp. 982-984. (Ghi chú kỹ thuật của EUCAST về phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chất kháng nấm trong canh thang pha loãng đối với nấm mốc hình thành bào tử).

[8] Cuenca-Estrella M., Arendrup M.C., Chryssanthou E., Dannaoui E., Lass-Florl C., Sandven P. et al. the AFST Subcommittee of EUCAST. Multicenter Determination of Quality Control Strains and Quality Control Ranges for Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts and Filamentous Fungi Using the Methods of the Antifungal Susceptibility Testing Subcommittee of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (AFST-EUCAST). Clin. Microbiol. Infect. 2007, 13 (10) pp. 1018-1022. (Xác định đa trung tâm các chủng đổi chứng chất lượng và phạm vi đối chứng chất lượng cho thử nghiệm sự nhạy kháng nấm của nấm men và nấm sợi, sử dụng các phương pháp của Tiểu ban Thử nghiệm sự Nhạy Kháng nấm thuộc Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm sự Nhạy Kháng nấm)

[9] CLSI M27-S3, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Third Informational Supplement. CLSI: Wayne, PA., 2008. (Phương pháp tham chiếu để thử nghiệm sự nhạy kháng nấm trong canh thang pha loãng của nấm men)

[10] Lopez A.G., Arendrup M.C., Lass-Flörl C., Rodriguez-Tudela J.-L, Cuenca-Estrella M. Multicenter Comparison of the ISO Standard 20776-1 and the Serial 2-Fold Dilution Procedures to Dilute Hydrophilic and Hydrophobic Antifungal Agents for Susceptibility Testing. J. Clin. Microbiol. 2010 May, 48 (5) pp. 1918-1920. (So sánh đa trung tâm của Tiêu chuẩn ISO 20776-1 và tài liệu Quy trình Pha loãng Loạt 2 lần để Pha loãng các Chất kháng nấm Ưa nước và Kỵ nước cho Thử nghiệm sự Nhạy)

[11] Arthington-Skaggs B.A., Wamock D.W., Morrison C.J. Quantitation of Candida albicans ergosterol content improves the correlation between in vitro antifungal susceptibility test results and in vivo outcome after fluconazole treatment in a murine model of invasive candidiasis. Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 44 pp. 2081-2085. (Định lượng hàm lượng ergosterol của Candida albicans cải thiện mối tương quan giữa kết quả thử nghiệm tính nhạy kháng nấm in vitro và kết quả in vivo sau khi điều trị fluconazole trong mô hình nhiễm nấm Candida xâm lấn ở chuột)

[12] AI B. et al. Quality control limits for broth microdilution susceptibility tests for ten antifungal agents. J. Clin. Microbiol. 2000, 38 pp. 3457-3459. (Giới hạn đối chứng chất lượng của các thử nghiệm sự nhạy trong canh thang vi pha loãng đối với 10 chất kháng nấm)

[13] Krisher K. et al. Quality control parameters for broth microdilution tests of anidulafungin. J. Clin. Microbiol. 2004, 42 p. 490. (Các thông số đối chứng chất lượng dùng cho thử nghiệm anidulafungin trong canh thang vi pha loãng)

[14] Arendrup MC, & Cuenca-Estrella MHope W and the Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). EUCAST Definitive Document E.DEF 7.2: Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts. February 2012. (Phương pháp xác định các nồng độ ức chế tối thiểu trong canh thang pha loãng của các chất kháng nấm đối với nấm men)

MỤC LỤC

Lời nói đầu

Lời giới thiệu

1  Phạm vi áp dụng

2  Thuật ngữ và định nghĩa

3  Quy trình thử nghiệm

4  Quản lý chất lượng (QC)

Phụ lục A (tham khảo) - RPMI-1640 medium

Phụ lục B (tham khảo) - Tiêu chuẩn độ đục McFarland 0,5 bari sulfat.

Phụ lục C (tham khảo) - Số lần đọc chấp nhận được sự phiên dịch MIC sử dụng các thủ tục đọc MIC thị giác

Thư mục tài liệu tham khảo