Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13312:2021 về Thực phẩm - Xác định hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13312:2021

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC AXIT AMIN CÓ CHỨA LƯU HUỲNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Foods - Determination of sulfur amino acids by ion exchange chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 13312:2021 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 985.28 Sulfur amino acids in food, feed ingredients and processed foods. Ion exchange chromatographic method;

TCVN 13312:2021 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC AXIT AMIN CÓ CHỨA LƯU HUỲNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Foods - Determination of sulfur amino acids by ion exchange chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh (axit cysteic và methionin sulfon) trong thực phẩm bằng sắc ký trao đổi ion.

2  Nguyên tắc

Protein trong mẫu thử được oxy hóa bằng axit performic tạo thành axit cysteic và methionin sulfon, sau đó thủy phân với dung dịch axit clohydric 6 M. Axit cysteic và methionin sulfon được xác định bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng là nước cất và nước đã khử ion, trừ khi có quy định khác.

3.1  Hydro peroxit (H₂O₂), 30 %.

3.2  Axit formic (CH₂O₂), 88 %.

3.3  Axit performic (CH₂O₃)

Thêm 1 phần thể tích hydroperoxit 30 % (3.1) vào 9 phần thể tích axit formic 88 % (3.2) trong chai thủy tinh có nắp đậy, để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 h, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Sau đó để trong bể nước đá 30 min. Chuẩn bị dung dịch mới trước khi sử dụng.

3.4  Dung dịch axit clohydric (HCl), 6 M

Pha loãng dung dịch axit clohydric 37 % với nước đã khử ion theo tỷ lệ 1:1.

3.5  Axit bromhydric (HBr), 48 %.

3.6  1- Octanol.

3.7  1- Propanol.

3.8  Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 2 M

Hòa tan 40 g natri hydroxit trong nước, chuyển vào bình định mức 500 ml và thêm nước đến vạch.

3.9  Natri xitrat ngậm hai phân tử nước (C₆H₅Na₃O₇.2H₂O).

3.10  Thiodiglycol (C₄H₁₀SO₂).

3.11  Dung dịch đệm bảo quản “pHix” (ví dụ: Pierce Chemical Co 1)).

3.12  Dung dịch đệm xitrat

3.12.1  Dung dịch đệm natri xitrat ngậm hai phân tử nước, pH 2,2

Hòa tan 176,6 g natri xitrat ngậm hai phân tử nước (3.9) trong 180 ml thiodiglycol (3.10) và 140 ml dung dịch axit clohydric 6 M (3.4), thêm 36 giọt dung dịch đệm bảo quản “pHix” (3.11). Chỉnh pH đến 2,2 ± 0,05 bằng dung dịch axit clohydric 6 M và thêm nước đến 9 L. Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 μm (4.8).

3.12.2  Dung dịch đệm rửa giải natri xitrat 0,17 M, pH 2,85

Hòa tan 16,67 g natri xitrat ngậm hai phân tử nước (3.9) trong 50 ml 1-propanol (3.7), 5 ml thiodiglycol (3.10), thêm 4 giọt đệm bảo quản “pHix” (3.11) và 10 ml axit clohydric đặc. Chỉnh pH tới 2,85 ± 0,02 bằng dung dịch axit clohydric 6 M (3.4) và thêm nước đến 1 L. Lọc hai lần qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 μm (4.8).

3.12.3  Dung dịch đệm rửa giải natri xitrat 0,2 M, pH 4,25 (ví dụ: Pierce Chemical Co.¹⁾).

Lọc dung dịch hai lần qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 μm (4.8).

3.13  Dung dịch chuẩn axit cysteic và methionin sulfon, 2,5 μmol/ml

Hòa tan 93,6 mg axit L-cysteic (ví dụ: Sigma Chemical Co. ¹⁾), 90,6 mg L-methionin sulfon (ví dụ: ICN K&K Laboratories Inc. ¹⁾) và 1 giọt đệm bảo quản “pHix” (3.11), chuyển vào bình định mức 200 ml và thêm nước đến vạch.

3.14  Dung dịch nội chuẩn norleucin

3.14.1  Dung dịch nội chuẩn gốc, 10 μmol/ml

Hòa tan 0,328 mg norleucin trong nước, chuyển vào bình định mức 250 ml và thêm nước đến vạch.

3.14.2  Dung dịch nội chuẩn làm việc, 1,5 μmol/ml

Pha loãng 75 ml dung dịch chuẩn gốc (3.14.1) bằng nước thành 500 ml.

3.15  Dung dịch chuẩn hỗn hợp các axit amin

Hòa tan 1,77 g axit L-aspartic, 0,40 g L-threonin, 0,53 g L-serin, 0,58 g L-valin, 0,66 g L-isoleucin, 1,32 g L-leucin, 0,38 g glycin, và 0,45 g L-alanin trong nước, chuyển vào bình định mức 1 L và thêm nước đến vạch.

3.16  Khí nitơ.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Thiết bị sắc ký trao đổi ion (ví dụ: Dionex D-500 2)), hoạt động theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.2  Cột sắc ký, bằng thép không gỉ, kích thước 50 cm x 1,75 mm, chứa hạt trao đổi cation D-5A (ví dụ: Dionex Corp.²⁾).

4.3  Máy ly tâm, có thể ly tâm ở tốc độ 15 000 r/min

4.4  Máy cô quay chân không, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 °C.

4.5  Bình đun sôi, dung tích 125 ml.

4.6  Pipet.

4.7  Máy lắc ngang.

4.8  Màng lọc, cỡ lỗ 0,45 μm.

4.9  Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ ở 110 °C ± 0,5 °C.

4.10  Giấy lọc sợi thủy tinh (ví dụ: Whatman ²⁾).

5  Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Tham khảo các tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm. Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm, việc lấy mẫu theo thỏa thuận giữa các bên liên quan.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Chuẩn bị phần mẫu thử

Nghiền nhỏ mẫu và trộn đều kỹ. Cân phần mẫu thử thích hợp chứa từ 7,5 mg đến 25 mg protein cho vào bình đun sôi 125 ml (4.5). Dùng pipet lấy 2,00 ml dung dịch chuẩn axit cysteic và methionin sulfon (3.13) cho vào bình đun sôi 125 ml thứ hai và làm khô bằng máy cô quay chân không (4.4) ở nhiệt độ 37 °C.

7  Cách tiến hành

7.1  Oxy hóa thủy phân mẫu thử

Đặt bình chứa phần mẫu thử và các chất chuẩn đã chuẩn bị vào bể nước đá trong 30 min. Thêm 10 ml axit performic lạnh (3.3) vào mỗi bình, không lắc xoáy, đóng chặt nắp và để trong bể nước đá 16 h.

Thêm vào mỗi bình 3 ml axit bromhydric 48 % (3.5) và 3 giọt 1-octanol (3.6), lắc nhẹ và để yên trong bể nước đá 30 min. Làm bay hơi đến khô ở 37 °C trong bộ cô quay chân không (4.8). Đặt các bình vào bộ chiết pha rắn và hút chân không ở áp suất < 25 mmHg trong khoảng thời gian ≥ 15 min cho đến khi khô hoàn toàn. Lấy các bình ra khỏi bộ chiết pha rắn và thêm 15 ml dung dịch axit clohydric 6 M (3.4), thổi khí nitơ khô trong 1 min, đóng chặt nắp và để trong tủ sấy (4.9) ở nhiệt độ 110 °C ± 0,5 °C trong 18 h.

Lấy bình ra, để nguội, thêm 4,0 ml dung dịch nội chuẩn làm việc (3.14.2), 8 ml nước và 3 giọt 1-octanol (3.6). Làm bay hơi đến khô ở nhiệt độ nhỏ hơn 50 °C trong bộ cô quay chân không. Lặp lại bước thêm 8 ml nước và làm bay hơi thêm hai lần nữa. Thêm 15 ml dung dịch đệm natri xitrat (3.12.1) và lắc bằng máy lắc ngang (4.7) trong 30 min. Chỉnh pH đến 2,2 ± 0,05 bằng dung dịch natri hydroxit 2 M (3.8). Thêm tiếp 1,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp các axit amin (3.15) vào bình cầu có chứa sẵn chuẩn axit cysteic và methionin sulfon. Chuyển toàn bộ dung dịch thử và các chất chuẩn trong các bình cầu sang các bình định mức 25 ml, rửa bình cầu và thêm dung dịch đệm nạp natri xitrat (3.12.1) đến vạch. Lọc các dịch thu được này qua giấy lọc sợi thủy tinh (4.10), cho vào ống ly tâm. Tiến hành ly tâm với tốc độ 15 000 r/min trong 5 min.

7.2  Xác định

Cho dung dịch thử hoặc chất chuẩn (7.1) sau ly tâm vào các lọ chứa mẫu của thiết bị phân tích axit amin. Vận hành thiết bị (4.1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và bơm các dung dịch chuẩn axit cysteic và methionin sulfon. Chỉnh điều kiện sắc ký để thu được độ phân giải lớn hơn 90 % của pic methionin sulfon. Lần lượt bơm 40 μl dung dịch các mẫu thử và chất chuẩn. Bơm các dung dịch chuẩn tại thời điểm bắt đầu, kết thúc và sau mỗi 5 lần bơm dung dịch thử.

Tính diện tích pic (không tính chiều cao) của axit cysteic và methionin sulfon trong các phần mẫu thử và chất chuẩn.

8  Tính kết quả

a) Hệ số đáp ứng đối với axit cysteic, K_c, được tính theo Công thức (1):

Trong đó:

S_i là diện tích pic của chất nội chuẩn trong mẫu chuẩn;

S_c là diện tích pic của axit cysteic trong mẫu chuẩn;

0,2 là nồng độ của axit cysteic chuẩn bị theo Điều 6, tính bằng micromol trên mililit (μmol/ml);

25 là dung tích bình định mức, tính bằng mililit (ml);

M_c là khối lượng phân tử của axit cysteic, tính bằng microgam trên micromol (trường hợp này M_c= 121,2 μg/μmol).

b) Hệ số đáp ứng đối với methionin sulfon, K_m, được tính theo Công thức (2):

Trong đó:

M_m là khối lượng phân tử của methionin, tính bằng microgam trên micromol (trường hợp này M_m = 149,2 μg/μmol);

S_m là diện tích của methionin sulfon trong mẫu chuẩn.

c) Hàm lượng cystein trong mẫu thử, X_c, tính bằng phần trăm (%), được tính theo Công thức (3):

Trong đó:

K_c là hệ số đáp ứng đối với axit cysteic;

S_sc là diện tích pic của axit cysteic trong mẫu thử;

S_si là diện tích pic của chất nội chuẩn trong mẫu thử;

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng miligam (mg);

1000 là hệ số chuyển đổi đơn vị từ microgam sang miligam.

d) Hàm lượng methionin trong mẫu thử, X_m, tính bằng phần trăm (%), được tính theo Công thức (4):

Trong đó:

K_m là hệ số đáp ứng đối với methionin sulfon;

S_sm là diện tích pic của methionin sulfon trong mẫu thử;

S_si là diện tích pic của chất nội chuẩn trong mẫu thử.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.