Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13288:2021 về Nguyên liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe - Xác định hàm lượng chondroitin sulfat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV sau khi thủy phân bằng enzym

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13288:2021

NGUYÊN LIỆU VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHONDROITIN SULFAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI
DETECTOR UV SAU KHI THỦY PHÂN BẰNG ENZYM

Raw materials and health supplements - Determination of chondroitin sulfate content by high-performance liquid chromatographic method with UV detection after enzymatic hydrolysis

Lời nói đầu

TCVN 13288:2021 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2015:11 Chondroitin sulfate content in raw materials and dietary supμLements High-performance liquid chromatography with UV detection after enzymatic hydrolysis;

TCVN 13288:2021 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

NGUYÊN LIỆU VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHONDROITIN SULFAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI
DETECTOR UV SAU KHI THỦY PHÂN BẰNG ENZYM

Raw materials and health supplements - Determination of chondroitin sulfate content by high-performance liquid chromatographic method with UV detection after enzymatic hydrolysis

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng chondroitin sulfat (CS) trong nguyên liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe (viên nang cứng, viên nang mềm, viên nén, viên nhai và dạng lỏng) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV sau khi thủy phân bằng enzym.

2  Nguyên tắc

Chondroitin sulfat trong mẫu được chiết bằng nước, được thủy phân bằng enzym Chondroitinase ACII ở 37 °C trong 3 h và được xác định trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HΜLC) với detector UV ở bước sóng 240 nm.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước cất hai lần hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Dung môi.

3.1.1  Axetonitril (CH₃CN).

3.1.2  Axit clohydric đặc (HCI).

3.2  Tetrabutylamoni bisulfat ({[CH₃(CH₂)₃]₄N}₂SO₄), độ tinh khiết ≥ 99,0 %, ví dụ: Cat. No. 86868 của Sigma-Aldrich 1).

3.3  Tris-(hydroxymetyl)aminometan (TRIS) (C₄H₁₁NO₃), ví dụ: Cat. No. T-1503 của Sigma-Aldrich2).

3.4  Natri axetat (CH₃COONa), dạng khan, ví dụ: Cat. No. S-8750 của Sigma-Aldrich ²⁾.

3.5  Axit axetic băng (CH₃COOH), ví dụ: Cat. No. A-0808 của Sigma-Aldrich ²⁾.

3.6  Natri clorua (NaCI).

3.7  Albumin từ huyết thanh bò, 1x đã kết tinh, 97 %, ví dụ: Cat. No. A-4378 của Sigma-Aldrich ²⁾.

3.8  Chondroitinase AC II, 5 đơn vị, ví dụ: Cat. No. 100335-1A của Seikagaku America ²⁾.

3.9  Pha động A

Cân 340 mg tetrabutylambni bisulfat (3.2), chuyển vào bình định mức 1 000 mL (4.11). Hòa tan và pha loãng bằng nước đến vạch. Đưa bình vào bể rung siêu âm (4.4) để khử khí.

3.10  Pha động B

Cân 340 mg tetrabutylamoni bisulfat (3.2), chuyển vào bình định mức 1 000 mL (4.11) và hòa tan hoàn toàn trong 330 mL nước đã khử ion. Thêm axetonitril (3.1.1) đến vạch. Đưa bình vào bể rung siêu âm (4.4) để khử khí và lọc qua thiết bị lọc (4.10).

3.11  Dung dịch axit clohydric, 0,12 M

Lấy cẩn thận 1 mL axit clohydric đặc (3.1.2) cho vào 99 mL nước và trộn đều.

3.12  Dung dịch axit clohydric, 6 M

Lấy cẩn thận 50 mL axit clohydric đặc (3.1.2) cho vào 50 mL nước và trộn đều.

3.13  Dung dịch đệm TRIS

Cân lần lượt 3 g TRIS (3.3), 2,4 g natri axetat (3.4), 1,46 g natri clorua (3.6) và 50 mg tinh thể albumin từ huyết thanh bò (3.7), hòa tan trong 100 mL dung dịch axit clohydric 0,12 M (3.11). Chỉnh pH đến 7,3 bằng dung dịch axit clohydric 6 M (3.12).

3.14  Dung dịch enzym

Hòa tan 5 đơn vị chondroitinase AC II (3.8) trong 0,5 mL nước. Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 0 °C khi chưa sử dụng.

3.15  Dung dịch pha loãng

Chuẩn bị ít nhất 20 mL dung dịch chứa 80 % pha động A (3.9) và 20 % pha động B (3.10).

3.16  Chất chuẩn, xem Bảng 1.

Bảng 1 - Các chất chuẩn

3.17  Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn thiết bị

3.17.1  Dung dịch chuẩn gốc

Cân chính xác khoảng 2 mg chất chuẩn ΔDi-0S, 10 mg mỗi chất chuẩn ΔDi-4S và ΔDi-6S (xem Bảng 1), chuyển vào bình định mức 50 mL (4.11). Hòa tan hoàn toàn bằng nước và thêm nước đến vạch.

3.17.2  Dung dịch chuẩn làm việc

Từ dung dịch chuẩn gốc (3.17.1), chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Δi-4S và ΔDi-6S khoảng 2 μg/mL, 8 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL và 100 μg/mL và nồng độ ΔDi-0S tương ứng 0,4 μg/mL, 1,6 μg/mL, 4, 8 μg/mL và 20 μg/mL theo Bảng 2.

Bảng 2 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc hiệu chuẩn thiết bị

3.18  Mẫu đối chứng chondroitin sulfat, từ khí quản bò, ví dụ: từ Bioiberica4).

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HΜLC), gồm bơm tự động Beckman 126 ⁴⁾, detector UV mảng diod số 168, bộ lấy mẫu tự động 507e và phần mềm 32 Karat.

4.2  Cột sắc ký, ví dụ: Phenomenex Synergi Polar-RP ⁴⁾, đường kính trong 4,6 mm x chiều dài 150 mm, cỡ hạt 4 μm.

4.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến ± 0,01 mg.

4.4  Bể rung siêu âm.

4.5  Máy đo pH, có thể đo chính xác đến ± 0,01 đơn vị pH.

4.6  Tủ ấm, có thể duy trì ở 37 °C.

4.7  Lọ nhỏ, dung tích 2 mL, có nắp và septa (màng phủ teflon).

4.8  Ống lồng, 200 μL, phù hợp với lọ nhỏ.

4.9  Bơm mẫu, có thể phân phối các thể tích 25 μL, 100 μL và 500 μL.

4.10  Thiết bị lọc, sử dụng màng lọc PTFE 0,2 pm.

4.11  Bình định mức, dung tích 50 mL, 100 mL, 1 000 mL.

4.12  Pipet tự động hoặc xylanh kín khí, có thể phân phối các thể tích thích hợp.

5  Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Tham khảo các tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm. Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm, việc lấy mẫu theo thỏa thuận giữa các bên liên quan.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị dung dịch đối chứng CS

Cân chính xác khoảng 100 mg mẫu đối chứng CS (3.18) cho vào bình định mức 50 mL (4.11). Thêm khoảng 30 mL nước và rung siêu âm trong bể (4.4) khoảng 15 min cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm nước đến vạch, trộn đều và ghi nhãn Dung dịch đối chứng 1.

6.2  Chuẩn bị dung dịch thử

6.2.1  Nguyên liệu

Cân chính xác khoảng 200 mg mẫu nguyên liệu CS cho vào bình định mức 100 mL (4.11). Thêm 60 mL nước và rung siêu âm trong bể (4.4) khoảng 15 min cho đến khi tan hoàn. Thêm nước đến vạch và lắc đều để thu được Dung dịch thử 1.

6.2.2  Viên nén

Cân 20 viên nén mẫu thử, tính khối lượng trung bình mỗi viên, nghiền 20 viên thành bột, sau đó trộn đều. Cân chính xác khoảng 0,2 g mẫu đã nghiền, cho vào bình định mức 100 mL (4.11). Thêm khoảng 60 mL nước và rung siêu âm trong bể (4.4) khoảng 15 min. Thêm nước đến vạch và trộn kỹ, lọc khoảng 1 mL đến 2 mL dung dịch qua màng lọc PTFE 0,2 μm (4.10) và ghi nhãn Dung dịch thử 1.

6.2.3  Viên nang

Cân 20 viên nang mẫu thử, tính khối lượng trung bình mỗi viên. Gom lượng chứa trong các viên nang (sử dụng miếng gạc hoặc bộ thổi khí để làm sạch vỏ nang) và trộn đều. Tiến hành tương tự viên nén (xem 6.2.2).

6.2.4  Sản phẩm công thức dạng lỏng

Trộn kỹ để đồng nhất mẫu. Cân chính xác một lượng mẫu thử tương đương với khoảng 200 mg CS cho vào bình định mức 100 mL (4.11). Thêm nước đến vạch, lắc kỹ và ghi nhãn dịch thử 1..

6.3  Thủy phân mẫu thử và mẫu kiểm soát bằng enzym

Dùng pipet lấy 20 μL dung dịch đệm TRIS (3.13), 30 μL dung dịch enzym (3.14) và 20 μL Dung dịch đối chứng 1 (6.1) hoặc Dung dịch thử 1 (6.2) cho vào lọ nhỏ 2 mL (4.7) với ống lồng 200 μL (4.8). Đặt lọ nhỏ trong tủ ấm ở 37 °C (4.6) trong 3 h. Sau đó lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng.

Dùng pipet tự động (4.12) chuyển toàn bộ mẫu trong ống lồng sang lọ nhỏ khác, tráng ống lồng bằng chính xác 100 μL pha động A (3.9). Thêm chính xác 830 μL pha động A, trộn kỹ và ghi nhãn Dung dịch đối chứng 2 hoặc Dung dịch thử 2 đã xử lý.

6.4  Xác định

6.4.1  Điều kiện vận hành HΜLC

Các điều kiện vận hành sau đây được cho là thích hợp:

- Tốc độ dòng:              1,1.mL/min;

- Nhiệt độ cột:               ổn định;

- Thể tích bơm mẫu:      30 μL;

- Bước sóng phát hiện: 240 nm;

- Chương trình gradient:

Bảng 3 - Chương trình gradient^a)

6.4.2  Bơm dung dịch và đo độ hấp thụ

Cân bằng hệ thống HΜLC (4.1) bằng các pha động (3.9 và 3.10) trong ít nhất 30 min cho đến khi thu được đường nền ổn định.

Bơm từng dung dịch chuẩn làm việc (3.17.2) và dung dịch thử (6.3) vào hệ thống HΜLC (4.1). Sau mỗi 20 lần bơm dung dịch thử và sau khi bơm xong tất cả dung dịch thử, bơm riêng từng dung dịch chuẩn.

Sau khi thiết bị đã ổn định, tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch đã bơm.

6.4.3  Đường chuẩn

Bơm từng dãy 5 dung dịch chuẩn làm việc (3.17.2). sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính đề xác định độ dốc, giao điểm với trục tung và hệ số tương quan r² của đường chuẩn đối với các chất chuẩn ΔDi-0S, ΔDi-4S và ΔDi-6S. Giá trị r² phải lớn hơn 0,995 đối với ΔDi-0S và lớn hơn 0,998 đối với ΔDi-4S, ΔDi-6S. Hệ số đuôi của mọi thành phần trong dài tuyến tính phải trong khoảng từ 0,80 đến 1,5.

6.4.4  Độ thu hồi

Bơm Dung dịch đối chứng 2 (6.3) và tính hàm lượng cs tổng số trong nguyên liệu đối chứng theo Điều 7. Độ thu hồi phải trong khoảng ± 3 % so với quy định.

7  Tính kết quả

7.1  Hàm lượng ΔDi-0S

Hàm lượng ΔDi-0S (phần CS chưa sultat hóa) trong mẫu thử, X0, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (1):

Trong đó:

P₀ là diện tích pic ΔDi-0S của mẫu thử;

b₀ là giao điểm của đường chuẩn ΔDi-0S với trục tung;

m₀ là độ dốc của đường chuẩn ΔDi-0S;

V là thể tích Dung dịch thử 1, tính bằng mililit (ở đây V = 100 mL);

W là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

D là hệ số pha loãng (ở đây D = 50).

7.2  Hàm lượng ΔDi-4S

Hàm lượng ΔDi-4S (phần CSA) trong mẫu thử, X₄, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (2):

Trong đó:

P₄ là diện tích pic ΔDi-4S của mẫu thử;

b₄ là giao điểm của đường chuẩn ΔDi-4S với trục tung;

m₄ là độ dốc của đường chuẩn ΔDi-4S;

V, W, D như nêu trong 7.1.

7.3  Hàm lượng ΔDi-GS

Hàm lượng ΔDi-6S (phần CSC) trong mẫu thử, X₆, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (3):

Trong đó:

P₆ là diện tích pic ΔDi-6S của mẫu thử;

b₆ là giao điểm với trục tung của đường chuẩn ΔDi-6S;

m₆ là độ dốc của đường chuẩn ΔDi-6S;

V, W, D như nêu trong 7.1.

7.4  Hàm lượng ΔDi-di(2,6)S

Hàm lượng ΔDi-di(2,6)S trong mẫu thử, X_2,6, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (4):

Trong đó:

P_2,6 là diện tích pic ΔDi-di(2,6)S của mẫu thử;

b₆, m₆ như nêu trong 7.3;

V, W, D như nêu trong 7.1;

F là hệ số chuyển đổi khối lượng phân tử giữa ΔDi-6S và ΔDi-di(2,6)S (ở đây F = 1,190).

7.5  Hàm lượng ΔDi-di(4,6)S

Hàm lượng ΔDi-di(4,6)S trong mẫu thử, X_4,6, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (5):

Trong đó:

P_4,6 là diện tích pic ΔDi-di(4,6)S của mẫu thử;

b₆, m₆ như nêu trong 7.3;

V, W, D như nêu trong 7.1;

F là hệ số chuyển đổi khối lượng phân tử giữa ΔDi-6S và ΔDi-di(4,6)S (ở đây F = 1,190).

7.6  Hàm lượng ΔDi-tri(2,4,6)S

Hàm lượng ΔDi-tri(2,4,6)S trong mẫu thử, X_2,4,6, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (6):

Trong đó:

P_2,4,6 là diện tích pic ΔDi-tri(2,4,6)S của mẫu thử;

b₆, m₆ như nêu trong 7.3;

V, W, D như nêu trong 7.1;

F là hệ số chuyển đổi khối lượng phân tử giữa ΔDi-6S và ΔDi-tri(2,4,6)S (ở đây F= 1,380).

7.7  Hàm lượng CS tổng số

Hàm lượng CS tổng số trong mẫu thử, X, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (7):

7.8  Hàm lượng CS trong các nền mẫu chế phẩm

a) Hàm lượng CS trong mẫu viên nén, X_T, biểu thị bằng miligam trên viên (mg/viên), được tính theo Công thức (8):

Trong đó:

X là hàm lượng CS trong mẫu thử, tính bằng microgam trên gam (μg/g);

W_T là khối lượng trung bình của các viên nén (xem 6.2.2), tính bằng gam (g).

b) Hàm lượng CS trong mẫu viên nang, X_c, biểu thị bằng miligam trên viên (mg/viên), được tính theo Công thức (9):

Trong đó:

W_c là khối lượng trung bình của lượng chứa trong các viên nang (xem 6.2.3), tính bằng gam (g).

c) Hàm lượng CS trong mẫu sản phẩm công thức dạng lỏng, X_L, biểu thị bằng miligam trên mililit (mg/mL), được tính theo Công thức (10):

Trong đó: SG là khối lượng riêng của mẫu thử (xem 6.2.4), tính bằng gam trên milìlit (g/mL).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết đề nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Sắc ký đồ điển hình của hỗn hợp dung dịch chuẩn và một số nền mẫu

CHÚ DẪN :

(1) ΔDi- 0S (2,5 min), (2) ΔDi-6S (5,9 min), (3) ΔDi-4S (6,3 min)

Hình A.1 - Ví dụ về sắc ký đồ của hỗn hợp dung dịch chuẩn

CHÚ DẪN :

(1) ΔDi-0S, (2) ΔDi-6S, (3) ΔDi-4S

Hình A.2 - Ví dụ về sắc ký đồ của mẫu khí quản bò

CHÚ DẪN :

(1) ΔDi-0S, (2) ΔDi-6S, (3) ΔDi-4S, (4) Δdi-di(2,6)S và (5) Δdi-di(4,6)S.

Hình A.3 - Ví dụ về sắc ký đồ của mẫu vây cá mập