NGŨ CỐC - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BETA-D-GLUCAN - PHƯƠNG PHÁP ENZYME
Cereals - Determination of β-D-glucan by enzymatic method
Lời nói đầu
TCVN 12629:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 995.16 β-D-Glucan in Oats. Streamlined Enzymatic Method;
TCVN 12629:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
NGŨ CỐC - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BETA-D-GLUCAN - PHƯƠNG PHÁP ENZYME
Cereals - Determination of β-D-glucan by enzymatic method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng β-D-glucan trong ngũ cốc bằng đo quang sau khi sử dụng enzym.
Phương pháp này có thể áp dụng đối với ngũ cốc nguyên hạt và sản phẩm từ ngũ cốc dạng bột, dạng mảnh.
Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.
(1→3)(1→4)-β-D-Glucan được thủy phân đặc hiệu bởi lichenase tạo thành các oligosaccharide và chúng được phân cắt tiếp thành glucose bởi β-glucosidase. Glucose được định lượng, sử dụng hỗn hợp đệm peroxidase /oxidase glucose.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất, trừ khi có quy định khác.
3.1 Dung dịch lichenase, 50 U/ml
Pha loãng 1 ml dung dịch lichenase - amoni sulfat thành 20 ml bằng dung dịch đệm phosphat 20 mM (3.5). Chia dung dịch enzym thành các phần 5 ml và bảo quản đông lạnh trong các ống polypropylen để phòng ngừa nhiễm vi sinh vật. Huyền phù lichenase - amoni sulfat không pha loãng, ổn định 6 năm khi được bảo quản ở 4 °C.
CHÚ THÍCH: Một đơn vị (U) hoạt độ enzym là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 µM glucose trong 1 min từ β-glucan lúa mạch (10 mg/ml) ở pH 6,5 và nhiệt độ 40 °C.
3.2 Dung dịch β-glucosidase, 2 U/ml
Pha loãng 1 ml dung dịch β-glucosidase - amoni sulfat thành 20 ml bằng dung dịch đệm axetat 50 mM (3.6.2). Chia dung dịch enzym thành các phần 5 ml và bảo quản đông lạnh trong các ống polypropylen để phòng ngừa nhiễm vi sinh vật. Huyền phù β-glucosidase - amoni sulfat không pha loãng, ổn định 6 năm khi được bảo quản ở 4 °C.
Kiểm tra độ tinh khiết của các enzym: tiến hành các bước được nêu trong 5.1 đến 5.3, sử dụng tinh bột ngô (3.8) làm phần mẫu thử. Hàm lượng β-D-glucan phải là 0 % (độ hấp thụ quang của chất phân tích bằng độ hấp thụ quang của mẫu trắng thuốc thử).
Kiểm tra hoạt độ enzym của từng lô lichenase và β-glucosidase: sử dụng mẫu bột chuẩn (3.9). Kiểm tra độ tinh khiết của β-glucosidase bằng cách ủ enzym này với hỗn hợp phản ứng lichenase từ 5.3.6 (sử dụng 0,1 ml cho mỗi quy trình định lượng chuẩn thử nghiệm chuẩn) đối với khoảng thời gian bổ sung (nghĩa là tăng lên một vài giờ thay vì 10 min).
3.3 Dung dịch hỗn hợp đệm glucose oxidase/peroxidase
3.3.1 Dung dịch hỗn hợp đệm đậm đặc
Hòa tan 13,6 g kali dihydro phosphat (KH2PO4), 4,2 g natri hydroxit (NaOH) và 3,0 g axit 4-hydroxybenzoic trong 96 ml nước. Chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch axit clohydric 2 M (16,7 ml/100 ml) hoặc natri hydroxit 2 M (8,0 g/100 ml). Định mức dung dịch đến 100 ml, thêm 0,4 g natri azide, trộn đều đến khi tan hết. Dung dịch hỗn hợp đệm đậm đặc bền đến 3 năm ở 4 °C.
3.3.2 Dung dịch hỗn hợp đệm làm việc, nồng độ tương ứng: glucose oxidase > 12000 U/L, peroxidase > 650 U/L và 4-aminoantipyrine 0,4 mM (81,3 mg/l)
Pha loãng 50 ml dung dịch hỗn hợp đệm đậm đặc (3.3.1) thành 1 L và thêm toàn bộ lượng chất trong lọ chứa hỗn hợp glucose oxidase/peroxidase đông khô, để thu được nồng độ yêu cầu. Bọc chai đựng hỗn hợp đệm glucose oxidase/peroxidase bằng lá nhôm để bảo vệ các chất phản ứng khỏi ánh sáng. Thuốc thử này ổn định từ 2 tháng đến 3 tháng ở 4 °C và từ 2 năm đến 3 năm ở âm 20 °C. Màu được hình thành với glucose ổn định trong một vài giờ nếu thuốc thử được lưu trữ đông lạnh, tốt nhất chia thành các phần thích hợp. Đừng đóng băng và tan hơn một lần. Khi các thuốc thử được chuẩn bị mới có thể có màu vàng sáng hoặc màu hồng nhạt. Cấu trúc màu với glucose ổn định một vài giờ.
Kiểm tra sự hình thành màu sắc và sự ổn định của hỗn hợp đệm glucose oxidase/peroxidase bằng cách ủ (lặp 2 lần) 3,0 ml hỗn hợp đệm glucose oxidase/peroxidase với glucose chuẩn (100 μg tinh thể khô glucose trong 0,2 ml dung dịch natri benzoat 0,2 %). Sau khi ủ với các khoảng thời gian 15 min, 20 min, 30 min và 60 min, đọc độ hấp thụ quang của dung dịch ở 510 nm. Sự hình thành màu đậm nhất đạt được trong vòng 20 min và màu sắc ổn định ít nhất 60 min ở 50 °C.
3.4 Dung dịch etanol, khoảng 50 % thể tích
Pha loãng etanol 95 % với cùng thể tích nước. Bảo quản trong các chai kín ở nhiệt độ phòng.
3.5 Dung dịch đệm phosphat 20 mM, pH 6,5
Hòa tan 3,12 g natri dihydro phosphat dihydrat (NaH2PO4.2H2O) trong 900 ml nước và chỉnh pH đến 6,5 bằng dung dịch natri hydroxit 100 mM (4 g/l). Dung dịch đã chuẩn bị bền trong 1 tháng ở 4 °C.
3.6 Dung dịch đệm natri axetat
3.6.1 Dung dịch đệm natri axetat, 200 mM, pH 4,0
Thêm 7,6 ml axit axetic băng vào 990 ml nước, sau đó thêm và hòa tan 4,8 g natri axetat trihydrat (CH3COONa.3H2O). Kiểm tra pH và chỉnh đến pH 4,0 bằng dung dịch axit clohydric 2 M hoặc dung dịch natri hydroxit 2 M, nếu cần. Điều chỉnh thể tích đến 1 L. Dung dịch đệm đã chuẩn bị bền trong 2 tháng ở 4 °C.
3.6.2 Dung dịch đệm natri axetat, 50 mM, pH 4,0
Pha loãng 250 ml dung dịch đệm natri axetat 200 mM (3.6.1) thành 1 lít bằng nước.
3.7 Dung dịch chuẩn D-glucose
3.7.1 Dung dịch chuẩn gốc D-glucose, 1 mg/ml
Trước khi chuẩn bị dung dịch, làm khô tinh thể glucose (độ tinh khiết > 97 %) 16 h ở 60 °C trong điều kiện chân không.
3.7.2 Dung dịch chuẩn làm việc D-glucose, 50 µg/200 µl và 100 µg/200 µl
Thêm 50 µl và 100 µl dung dịch chuẩn gốc D-glucose (3.7.1) vào các ống nghiệm (4.7) riêng rẽ và chỉnh thể tích trong mỗi ống đến 200 µl bằng dung dịch đệm natri axetat 50 mM (3.6).
Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.
3.8 Tinh bột ngô.
3.9 Mẫu bột chuẩn, chứa một lượng đã biết lichenase và β-D-glucan (hàm lượng thấp và cao).
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Máy nghiền phòng thí nghiệm.
4.2 Máy ly tâm, có thể tạo gia tốc 1 000g.
4.3 Nồi cách thủy, duy trì ở 50 °C ± 1 °C.
4.4 Bể đun sôi, đun sôi nước ở 95 °C đến 100 °C.
4.5 Máy trộn (Voltex).
4.6 Máy đo pH.
4.7 Ống nghiệm thủy tinh, dung tích 17 ml, 16 mm x 29 mm, để ly tâm ở tốc độ 1 000g.
4.8 Giấy lọc nhanh không tro.
4.9 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.
4.10 Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ ở 103 °C ± 1 °C.
4.11 Máy đo quang, cài đặt ở bước sóng 510 nm.
4.12 Pipet, có thể phân phối 100 µl và 200 µl, có đầu tip dùng một lần.
4.13 Bộ phân phối, với đầu hút 5,0 ml phân phối chính xác 100 µl hoặc 200 µl và đầu hút 50 ml phân phối 4,0 hoặc 5,0 ml.
4.15 Nhiệt kế, có dải đo bao trùm nhiệt độ 103 °C ± 1 °C.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
Nghiền khoảng 50 g phân mẫu thử bằng máy nghiền (4.1), rây qua sàng 0,5 mm. Chuyển toàn bộ mẫu sang túi nhựa miệng rộng và trộn đều bằng cách lắc và đảo chiều túi.
Xác định độ ẩm bằng cách sấy 2 g đến 5 g phần mẫu thử đã nghiền 16 h trong tủ sấy (4.10) ở 103 °C ± 1 °C. Sử dụng độ ẩm xác định được để tính kết quả theo hàm lượng chất khô.
5.2 Mẫu trắng thuốc thử
Chuyển 0,2 ml dung dịch đệm natri axetat 50 mM (3.6.2) vào các ống nghiệm (4.7).
5.3 Xác định
Thực hiện với 4 ống dung dịch chuẩn làm việc D-glucose (3.7.2), 2 ống mẫu trắng thuốc thử (xem 5.2) và mẫu bột chuẩn (3.9) cho mỗi loạt phân tích. Sử dụng mẫu trắng thuốc thử (5.2) làm giá trị 0 đo quang.
CHÚ THÍCH: Tiến hành cẩn thận theo các bước (5.3.1) đến (5.3.3) để thu được huyền phù đồng nhất.
5.3.1 Dùng cân (4.9) để cân khoảng 80 mg đến 100 mg phần mẫu thử đã chuẩn bị (5.1), chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống nghiệm thủy tinh (4.7). Gõ nhẹ để tất cả mẫu rơi xuống đáy ống. Ly tâm huyền phù ở 1 000g và loại bỏ dịch nổi. Sử dụng cặn để phân tích.
CHÚ THÍCH: Khi phân tích sản phẩm ngũ cốc chứa hàm lượng glucose cao, tách sơ bộ 80 mg - 100 mg phần mẫu đã nghiền hai lần bằng etanol, mỗi lần 10 ml dung dịch etanol (3.4) ở 80 °C trong 10 min.
5.3.2 Thêm 0,2 ml etanol 50 % (3.4) vào ống và trộn đều trên máy trộn để chắc chắn tất cả mẫu đều ướt. Thêm 4 ml dung dịch đệm phosphat (3.5) và trộn mạnh trên máy trộn Vortex (4.5) để phân tán hoàn toàn.
5.3.3 Đặt ngay ống nghiệm vào bể nước sôi (4.4). Ủ 1 min, lấy ống ra khỏi bể nước sôi và trộn mạnh trên máy Vortex. Đặt ống trở lại bể nước sôi thêm 2 min và sau đó trộn mạnh.
CHÚ THÍCH: Một phần chất rắn sẽ bám vào thành ống nghiệm; điều này không ảnh hưởng đến chất phân tích vì ống nghiệm sẽ được xử lý với enzym trong bước tiếp.
5.3.4 Đặt các ống trong nồi cách thủy (4.3) cài đặt ở 50 °C và để ổn định 5 min. Thêm 0,2 ml dung dịch lichenase (3.1) vào ống và trộn trên máy trộn Vortex (4.5). Trộn đều ống cho đến khi mẫu dính trên thành ống được làm ướt bởi huyền phù chứa lichenase. Cho bi thủy tinh vào ống và ủ 60 min ở 50 °C, trộn mạnh trên máy trộn (khoảng 10 s) 3 lần hoặc 4 lần trong quá trình ủ.
Cách khác, đặt một thanh khuấy từ trong từng ống và đặt giá ống nghiệm trên một đĩa Pyrex được đổ đầy nước và đặt trên máy khuấy từ cài đặt ở 50 °C hoặc sử dụng bể ủ khuấy trộn.
CHÚ THÍCH: Không cần thiết phải trộn ống liên tục từ đầu đến cuối trong khi ủ; tuy nhiên nó có thể được thực hiện thay thế cho máy trộn nếu thiết bị thích hợp có sẵn.
5.3.5 Thêm 5 ml dung dịch đệm natri axetat 200 mM (3.6) vào từng ống và trộn kỹ trên máy trộn.
5.3.6 Để nguội các ống 5 min đến 10 min đến nhiệt độ phòng và sau đó ly tâm (4.2) 10 min ở 1 000 g.
CHÚ THÍCH: Phần nổi phía trên có thể vẫn hơi đục. Điều này không ảnh hưởng đến độ chính xác của định lượng vi mẫu trắng bao gồm dịch nổi tương tự như phần mẫu thử nhưng không được xử lý với β-glucosidase hoặc lọc dịch nổi phía trên qua giấy lọc nhanh không tro (4.8).
5.3.7 Chuyển cẩn thận và chính xác 0,1 ml phần nổi phía trên (hoặc dịch lọc) vào đáy của các ống nghiệm riêng rẽ, sử dụng 3 ống/phần nổi phía trên (hoặc dịch lọc) [chỉ xử lý 2 ống (dung dịch phản ứng) với β-glucosidase trong 5.3.8. Đối với ống không được xử lý với β-glucosidase sẽ thu được giá trị mẫu trắng (trên việc xử lý với hỗn hợp đệm glucose oxidase/peroxidase)].
5.3.8 Thêm 0,1 ml dung dịch đệm axetat 50 mM (3.6) vào mẫu trắng dịch nổi (hoặc dịch lọc). Thêm 0,1 ml phần dung dịch β-glucosidase (3.2) vào các dung dịch phản ứng từ mẫu thử và mẫu chuẩn và ủ 10 min ở 50 °C.
5.3.9 Thêm 3,0 ml hỗn hợp đệm glucose oxidase/peroxidase (3.3) vào từng ống (dung dịch phản ứng từ mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng thuốc thử, dung dịch chuẩn làm việc D-glucose và các mẫu trắng) và ủ 20 min ở nhiệt độ 50 °C.
5.3.10 Dùng máy đo quang (4.11), đo và ghi lại các giá trị độ hấp thụ quang (A) của từng ống ở bước sóng 510 nm so với mẫu trắng thuốc thử. Dung dịch mẫu thử chứa > 10 % hàm lượng β-D-glucan sẽ có các giá trị độ hấp thụ quang lớn hơn giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn D-glucose 100 µg. Trong trường hợp này, phân tích lại mẫu thử bằng cách pha loãng phần dịch nổi phía trên (hoặc dịch lọc trong 5.3.6 với dung dịch đệm axetat 50 mM và tiến hành theo 5.3.7. Khi tính hàm lượng β-D-glucan, cần tính đến hệ số pha loãng.
Tính hàm lượng β-D-glucan có trong mẫu thử, X, bằng phần trăm khối lượng, theo Công thức (1):
(1)
Trong đó:
ΔA là độ hấp thụ quang của dung dịch phản ứng (nghĩa là độ hấp thụ quang của phần mẫu thử khi xử lý β-glucosidase trừ đi độ hấp thụ quang mẫu trắng của cùng mẫu thử);
F là hệ số chuyển đổi giá trị độ hấp thụ sang µg glucose = 100 µg glucose/giá trị độ hấp thụ quang của 100 µg glucose;
94 là hệ số chuyển đổi thể tích (0,1 ml dung dịch từ 9,4 ml được phân tích);
1/1000 là hệ số chuyển đổi từ µg thành mg;
100/W là hệ số chuyển đổi thành 100 mg phần mẫu thử;
W là khối lượng phần mẫu thử (mg);
162/180 là hệ số chuyển đổi từ glucose tự do được xác định thành glucose khan.
Tính hàm lượng β-D-glucan có trong mẫu thử, Y, bằng phần trăm khối lượng chất khô, theo Công thức (2):
(2)
Trong đó:
H là độ ẩm của phần mẫu thử.
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được;
f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm
Bảng A.1 - Các kết quả nghiên cứu phòng thử nghiệm quốc tế để xác định β-D-Glucan trong yến mạch bằng phương pháp enzyma
Mẫu |
Giá trị trung bình, % khối lượng chất khô |
Sr |
SR |
RSDr, % |
RSDR, % |
rb |
Rc |
Bột yến mạch |
2,73 |
0,083 |
0,241 |
3,1 |
8,8 |
0,232 |
0,675 |
Cám yến mạch |
6,39 |
0,296 |
0,456 |
4,6 |
7,1 |
0,829 |
1,277 |
Yến mạch cán |
4,27 |
0,283 |
0,315 |
6,6 |
7,4 |
0,792 |
0,882 |
Cám yến mạch (ngũ cốc ăn sáng) |
3,93 |
0,484 |
0,484 |
12,3 |
12,3 |
1,355 |
1,355 |
Cám yến mạch ăn liền |
8,00 |
0,480 |
0,524 |
6,0 |
6,6 |
1,344 |
1,467 |
a Dựa trên kết quả từ 8 phòng thử nghiệm, không được xác định khoảng lệch. b r = 2,8 x Sr c R = 2,8 x SR sr là độ lệch chuẩn lặp lại; sR là độ lệch chuẩn tái lập; RSDr là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại; RSDR là độ lệch chuẩn tương đối tái lập. |
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] J. AOAC Int. 80, 580 (1997)
[2] Proceedings of the 4th International Oat Conference (1992) (A.R. Barn, Ed.) Adelaide, SA, Australia, pp 104-107.
Ý kiến bạn đọc
Nhấp vào nút tại mỗi ô tìm kiếm.
Màn hình hiện lên như thế này thì bạn bắt đầu nói, hệ thống giới hạn tối đa 10 giây.
Bạn cũng có thể dừng bất kỳ lúc nào để gửi kết quả tìm kiếm ngay bằng cách nhấp vào nút micro đang xoay bên dưới
Để tăng độ chính xác bạn hãy nói không quá nhanh, rõ ràng.