Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12602:2018 (EN 15781:2009) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định maduramincin - Ammonium bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo có tạo dẫn xuất sau cột

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12602:2018

EN 15781:2009

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH MADURAMICIN-AMMONIUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC LÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO CÓ TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT

Animal feeding stuffs - Determination of maduramicin-ammonium by reversed-phase HPLC using post-column derivatisation

Lời nói đầu

TCVN 12302:2018 hoàn toàn tương đương với EN 15781:2009

TCVN 12602:2018 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH MADURAMICIN-AMMONIUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC LÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO CÓ TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT

Animal feeding stuffs - Determination of maduramicin-ammonium by reversed-phase HPLC using post-column derivatisation

CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng maduramicin trong thức ăn chăn nuôi và premix bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo có tạo dẫn xuất sau cột.

Hàm lượng maduramicin thông thường trong thức ăn chăn nuôi là 5 mg/kg, trong premix 500 mg/kg. Giới hạn định lượng là 2 mg/kg. Giới hạn phát hiện là 0,5 mg/kg.

CHÚ THÍCH: Giới hạn định lượng có thể thấp hơn nhưng cần được người sử dụng xác nhận.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

Chiết mẫu bằng metanol. Tiến hành xác định maduramicin bằng phương pháp HPLC pha đảo có tạo dẫn xuất sau cột với vanillin và được phát hiện ở bước sóng 520 nm.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1  Nước, đạt loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696).

4.2  Metanol (CH₃OH), loại dùng cho HPLC.

4.3  1,5-dimetylhexylamin [CH₃(CH₂)₄CH₂N(CH₃)₂].

4.4  Axit sulfuric (H₂SO₄), nồng độ 95 % đến 97 %

4.5  Axit ortho-phosphoric, (H₃PO₄), nồng độ xấp xỉ 85 %.

4.5.1  Axit orth-phosphoric loãng

Hòa tan 10 ml axit ortho-phosphoric (4.5) với nước (4.1) đủ 100 ml.

4.6  Kali dihydro phosphat (KH₂PO₄)

4.7  Dung dịch đệm phosphat, (KH₂PO₄) = 10 mmol/l, pH 4,0

Hòa tan 1,36 g kali hydro phosphat (4.6) vào 500 ml nước (4.1). Thêm 3,0 ml axit ortho-phosphoric (4.5) và 10 ml 1,5-dimethylhexylamin (4.3). Chỉnh pH đến 4,0 bằng axit ortho-phosphoric loãng (4.5.1) và thêm nước đã khử khoáng đến 1000 ml. Các dung dịch có thể được bảo quản trong vài tuần, nhưng nếu thấy có nấm phát triển thì loại bỏ và chuẩn bị dung dịch mới.

4.8  Pha động

Pha loãng 100 ml dung dịch đệm phosphat (4.7) với metanol (4.2) cho đủ 1 000 ml.

4.9  Vanillin, 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, độ tinh khiết tối thiểu 98 % khối lượng (loại sử dụng cho HPLC).

4.9.1  Thuốc thử vanillin

Hòa tan 10 g vanillin (4.9) trong hỗn hợp gồm 250 ml metanol (4.2) và 5,0 ml axit sulfuric (4,4). Trộn kỹ và siêu âm trong vài min trong chân không ở nhiệt độ phòng. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày sử dụng và phải được làm mát bằng nước đá trong quá trình sử dụng.

CHÚ THÍCH: Dimethylaminobenzaldehyde (DMAB) cũng phù hợp để sử dụng làm thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột (chi tiết được đưa ra trong Phụ lục B) tuy nhiên, chưa có việc kiểm tra đầy đủ về loại thuốc thử này.

4.10  Maduramicin

4.11  Các dung dịch chuẩn

4.11.1  Dung dịch chuẩn gốc, 100 µg/ml

Cân khoảng 10 mg maduramicin (4.10), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml. Hòa tan trong metanol (4.2) và thêm metanol đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 °C. Chuẩn bị dung dịch trong tháng sử dụng.

4.11.2  Dung dịch chuẩn trung gian, 10 µg/ml

Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn gốc (4.11.1) bằng metanol (4.2) trong bình định mức 100 ml, thêm metanol đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 °C. Chuẩn bị dung dịch trong tuần sử dụng.

4.11.3  Các dung dịch hiệu chuẩn

Nghiên cứu liên phòng thí nghiệm được thực hiện với 8 dung dịch hiệu chuẩn. Cho vào một loạt bình định mức dung tích 50 ml: 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml, 5,0 ml, 6,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.11.2). Thêm metanol (4.2) vào các bình cho đến vạch và trộn. Các dung dịch này chứa tương ứng: 0,2 µg, 0,4 µg, 0,6 µg, 0,8 µg, 1,0 µg, 1,2 µg, 1,6 µg và 2,0 µg maduramicin trong mỗi mililít dung dịch. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng 5 dung dịch hiệu chuẩn với nồng độ maduramicin lần lượt là: 0,4 µg, 0,7 µg, 1,0 µg, 1,5 µg và 2,0 µg trong mỗi ml dung dịch. Các dung dịch hiệu chuẩn nên được chuẩn bị trong ngày phân tích.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Máy ly tâm.

5.2  Bể siêu âm.

5.3  Hệ thống HPLC bao gồm:

5.3.1  Bơm không xung, tốc độ 0,4 ml/min

5.3.2  Hệ thống bơm mẫu, bơm thủ công hoặc tự động, có vòng bơm thích hợp để bơm 50 µl.

5.3.3  Detector UV/VIS, phù hợp để đo ở 520 nm.

CHÚ THÍCH: Tốt nhất là nhiễu < 1.10^-5 AU (250 nm, 600 nm).

5.3.4  Máy tích phân hoặc máy tính.

5.3.5  Bộ phản ứng sau cột, bao gồm:

CHÚ THÍCH: Tránh sử dụng ống thép không rỉ trong bộ phản ứng sau cột và detector.

5.3.5.1  Buồng trộn PEEK

5.3.5.2  Cuộn phản ứng PTFE, 1,5 ml đến 2,0 ml hoạt động ở 95 °C

Sử dụng cuộn phản ứng bán sẵn hoặc có thể được làm bằng cách sử dụng 1 đoạn ống thép không gỉ SS316, đường kính trong 0,5 mm, dài từ 7,5 m đến 10 m, phù hợp với bộ phản ứng (gợi ý: quấn đoạn ống quanh một lá nhôm để cho vừa khít với lò phản ứng và bảo đảm truyền nhiệt tốt đến cuộn dây). Nên sử dụng cuộn dây có vỏ bọc bằng vải bán sẵn. Để đảm bảo pha trộn hiệu quả thuốc thử với dung dịch thoát ra từ cột, nên sử dụng bộ trộn 3 nhánh (chữ T) tĩnh hoặc tạo xoáy (không phải bộ trộn thông thường) ở trước cuộn phản ứng.

CHÚ THÍCH 1: Nếu gặp vấn đề về bọt khí trong hệ thống, thì dùng một đoạn ống polytetrafluoroethylene (PTFE) (ví dụ: 1 m đường kính trong 0,25 mm) đặt ở giữa bơm thuốc thử và buồng trộn và ống Teflon (ví dụ: 3 m đường kính trong 0,17 mm) đặt ở giữa buồng phản ứng và detector.

CHÚ THÍCH 2: Có thể sử dụng nhiệt độ trong khoảng từ 92 °C đến 98 °C, đảm bảo được độ ổn định cao (1 °C).

5.3.5.3  Lò phản ứng hoặc nồi cách thủy dùng cho cuộn phản ứng PTFE, phù hợp để vận hành ở 95 °C.

5.3.6  Bơm thuốc thử sau cột, không tạo ra xung, dung tích lưu lượng 0,4 ml/min.

5.3.7  Cột sắc ký lỏng, 250 mm x 4,6 mm, vật liệu 5 µm, Hypersil BDS C18 hoặc tương đương.

5.3.8  Lò cột, phù hợp để vận hành ở 40 °C.

5.4  Máy lắc, máy quay hoặc máy lắc rung.

5.5  Tủ đông lạnh

5.6  Màng lọc, PTFE, kích thước lỗ lọc trong khoảng 0,20 µm đến 0,45 µm.

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497).

Điều quan trọng là mẫu phòng thí nghiệm nhận được phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

7  Chuẩn bị mẫu thử

Tiêu chuẩn này không quy định việc chuẩn bị mẫu thử. Nên sử dụng phương pháp chuẩn bị mẫu thử nêu trong TCVN 4325 (ISO 6498).

8  Cách tiến hành

8.1  Chuẩn bị mẫu kiểm tra chất lượng

8.1.1  Mẫu thử trắng

Để thực hiện thử nghiệm đánh giá độ thu hồi (8.1.2), cần phân tích mẫu trắng để bảo đảm không có mặt maduramicin và các chất gây nhiễu. Mẫu thử trắng phải tương tự như nền mẫu thử và không chứa maduramicin hoặc các chất gây nhiễu.

8.1.2  Phép thử độ thu hồi

Cần thực hiện phép thử độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng đã được bổ sung một lượng maduramicin tương đương với lượng maduramicin có trong mẫu thử. Để thêm chuẩn ở mức 5 mg/kg, lấy 500 µl dung dịch chuẩn (4.11.1) cho vào bình. Thêm 10 g mẫu trắng, trộn đều và để yên 10 min, sau đó trộn lại vài lần trước khi tiếp tục tiến hành bước chiết (8.2).

Ngoài ra, nếu không có được mẫu trắng tương tự như mẫu thử (8.1.1), thì phép thử nghiệm độ thu hồi có thể được thực hiện bằng phương pháp thêm chuẩn. Trong trường hợp này, mẫu thử (mẫu cần được phân tích) được cho thêm vào một lượng maduramicin tương đương với lượng maduramicin có trong mẫu thử. Mẫu này được phân tích cùng với mẫu không bổ sung maduramicin và độ thu hồi sẽ tính được bằng phép tính trừ.

Độ thu hồi được chấp nhận là từ 90 % đến 110 %.

8.2  Chiết

8.2.1  Thức ăn chăn nuôi

Cân 10 g mẫu đã nghiền nhỏ (với các hạt ≤ 1 mm), chính xác tới 0,01 g, cho vào bình định mức 250 ml và thêm 50 ml metanol (4.2). Đậy bình và đặt bình vào bể siêu âm (5.2) ở 50 °C trong 20 min. Lắc mạnh bình bằng máy (5.4), bảo quản và để nguội đến nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min, gạn lấy lớp chất lỏng trong suốt nổi phía trên và cho vào tủ lạnh (5.5) từ 2 h đến 3 h để gạn chất béo. Sau đó, lấy ra một phần mẫu cho ly tâm trong 1 min đến 2 min. Sau khi lọc qua màng (5.6), lấy 50 µl dung dịch này bơm vào máy HPLC.

8.2.2  Premix

Cân 1 g mẫu đã nghiền nhỏ (với các hạt ≤ 1mm), chính xác đến 0,01 g, cho vào bình định mức 250 ml và thêm 50 ml metanol (4.2). Đậy bình và đặt bình vào bể siêu âm (5.2) ở 50 °C trong 20 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng, lắc mạnh bình bằng máy (5.4), để yên vài phút, gạn lấy một phần chất lỏng trong suốt nổi phía trên và pha loãng bằng metanol theo tỷ lệ 1:10 và cho vào tủ lạnh (5.5) trong 2 h đến 3 h để tách chất béo. Sau đó, lấy ra một phần cho ly tâm trong 1 min đến 2 min. Sau khi lọc qua màng (5.6), lấy 50 µl dung dịch này bơm vào máy HPLC.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng lượng mẫu nhiều hơn, nhưng phải được người sử dụng xác nhận. Trong trường hợp số dùng lượng mẫu nhiều hơn thì phải điều chỉnh lượng dung môi chiết cho phù hợp.

8.3  Xác định bằng HPLC

8.3.1  Điều kiện chạy HPLC

Các điều kiện sau đây được đưa ra trong hướng dẫn, các điều kiện khác có thể được sử dụng miễn là cho kết quả tương đương.

Để kiểm tra tính ổn định của hệ thống sắc ký, bơm vài lần dung dịch chuẩn (4.11.3) chứa 1,0 µg/ml vào hệ thống cho đến khi đạt được độ ổn định của diện tích các pic và thời gian lưu. Khi thực hiện ở các điều kiện nêu trên tách được maduramicin ra khỏi các ionophore như salinomycin, narasin, monensin và semduramycin với đường nền.

8.3.2  Dựng đường chuẩn

Bơm mỗi dung dịch chuẩn (4.11.3) vài lần vào hệ sắc ký và xác định giá trị trung bình của diện tích các pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn với trục tung là giá trị trung bình của diện tích các pic của các dung dịch chuẩn và trục hoành là nồng độ tương ứng, µg/ml, của dung dịch chuẩn.

8.3.3  Dung dịch mẫu thử

Bơm mẫu đã chiết (8.2) ít nhất 2 lần vào hệ sắc ký, thể tích mẫu bơm tương tự như thể tích dung dịch chuẩn và xác định giá trị trung bình diện tích pic maduramicin.

9  Tính kết quả

Từ giá trị trung bình diện tích pic maduramicin của mẫu thử, xác định nồng độ trong dung dịch mẫu thử, µg/ml, tìm giá trị tương ứng trên đường chuẩn (8.3.2).

Sử dụng công thức sau đây để tính hàm lượng maduramicin (w_m) trong mẫu, tính bằng mg/kg.

Trong đó:

ρ_m  là nồng độ khối lượng của maduramicin trong dịch chiết mẫu (8.2), tính bằng µg/ml;

m  là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam;

f_d  là hệ số pha loãng theo (8.2).

10  Khẳng định dữ liệu

Việc nhận biết maduramicin có thể được khẳng định bằng phương pháp đồng sắc ký. Dịch chiết mẫu (8.2) được thêm chuẩn bằng cách bổ sung một lượng nhất định dung dịch chuẩn. Lượng maduramicin bổ sung này phải tương đương với lượng maduramicin được tìm thấy trong dịch chiết mẫu. Chỉ có chiều cao của pic maduramicin tăng cao sau khi tính cả lượng đã thêm vào và cả dịch chiết mẫu. Chiều rộng của pic tại nửa chiều cao của pic phải nằm trong khoảng ± 10 % so với chiều rộng ban đầu của pic maduramicin của dịch chiết mẫu khi chưa được thêm chuẩn.

11  Độ chụm

11.1  Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về phương pháp này được tóm tắt trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ nghiên cứu cộng tác này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã cho.

11.2  Độ lặp lại

Sự khác biệt tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một chất liệu thử, trong cùng một phòng thí nghiệm do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

11.3  Độ tái lập

Sự khác biệt tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp trên cùng một chất liệu thử nghiệm trong các phòng thí nghiệm khác nhau với các người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

12  Báo cáo kết quả thử nghiệm

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải ghi rõ:

a) Thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) Phương pháp lấy mẫu được sử dụng, nếu biết;

c) Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng được;

e) Mọi chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết về sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

Phụ lục A

(tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thí nghiệm

Nghiên cứu liên phòng thí nghiệm của Châu Âu gồm 10 phòng thí nghiệm ở 9 quốc gia được thực hiện trên 5 mẫu khác nhau:

Mẫu A: thức ăn cho gà thịt, 4 % chất béo, hàm lượng maduramicin 2,5 mg/kg

Mẫu B: thức ăn cho gà thịt, 8 % chất béo, hàm lượng maduramicin 4,5 mg/kg

Mẫu C: thức ăn cho gà tây, hàm lượng maduramicin 5 mg/kg

Mẫu D: thức ăn cho gà thịt, 4 % chất béo, hàm lượng maduramicin 9 mg/kg

Mẫu E: Premix cho gà thịt, hàm lượng maduramicin 450 mg/kg

CHÚ THÍCH 1: Thức ăn dành cho gà thịt có chứa bột mì, tấm, khô đậu nành ép, gluten ngô thức ăn chăn nuôi và mỡ lợn công nghiệp.

CHÚ THÍCH 2: Thức ăn của gà tây chứa lúa mì, ngô, khô đậu nành ép, hạt cải, đậu Hà Lan, protein khoai tây và mỡ lợn công nghiệp.

Phép thử nghiệm này được Viện Kiểm định Chất lượng Sản phẩm Nông nghiệp của Hà Lan (RIKILT) tổ chức thực hiện năm 2002 và các kết quả thu đã được phân tích thống kê theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) để cung cấp dữ liệu chính xác nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thí nghiệm đối với maduramicin

Phụ lục B

(tham khảo)

Điều kiện để tạo dẫn xuất sau cột với DMAB

B.1  Thuốc thử

B.1.1  Metanol, CH₃OH, dùng cho HPLC

B.1.2  Axit sulfuric, H₂SO₄, 95 % đến 97 %

B.1.3  4-(dimetylamino) benzaldehyd, DMAB, C₉H₁₁NO

B.1.4  Metanol - axit sulfuric

Lấy 40 ml axit sulfuric (B.1.2) khuấy cẩn thận vào 950 ml metanol (B.1.1). Khử bọt khí dung dịch trong bể siêu âm (5.2) trong 15 min trước khi sử dụng.

B.1.5  Dung dịch DMAB

Hòa tan 60,0 g 4-(dimetylamino) benzaldehyd (B.1.3) trong 950 ml metanol (B.1.1). Khử bọt khí dung dịch trong bể siêu âm (5.2) trong 15 min trước khi sử dụng.

B.2  Thiết bị, dụng cụ

B.2.1  Bộ phản ứng sau cột (một bơm kép hoặc hai máy bơm đơn) có buồng trộn, cuộn phản ứng bằng vật liệu trơ (ví dụ Teflon® hoặc Peek®) để hoạt động ở 95 °C, dài 7,0 m với đường kính trong 0,33 mm và buồng phản ứng hoặc lò phản ứng hoạt động ở 95 °C.

Thể tích bơm: 100 µl.

CHÚ THÍCH: Nếu chỉ có một máy bơm sử dụng cho phản ứng sau cột, thì các thuốc thử B.1.4 và B.1.5 có thể được trộn lẫn với nhau tỷ lệ (1/1 thể tích). Vì DMAB sẽ bị oxy hóa nhanh làm cho dung dịch bị tối màu, nên dung dịch phải được bảo vệ tránh ánh sáng trong bồn nước đá và phải được sử dụng trong vòng 24 h.

B.3  Các điều kiện khác

Các điều kiện khác không thay đổi so với việc sử dụng thuốc thử vanillin (xem 5.3.5 và 8.3.1).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] J.J.M. Driessen, M.J.H. Tomassen and J. de Jong, CANFAS - Collaborative study for the determination of maduramicin in feedingstuffs and premixtures by HPLC, Report 2002.016, State Institute for Quality Control of Agricultural Products (RIKILT), 2002

[2] EU project 'Development and validation of HPLC methods for the official control of coccidiostats and antibiotics used as feed additives', CANFAS-SMT4-CT98-2216

[3] Jacob de Jong et al., Determination of maduramicin in feedingstuffs and premixtures by liquid chromatography: Development, validation, and interlaboratory study, J. of AOAC Int., 87, 5, 1033 -1041, 2004

[4] EN ISO 6497, Animal feeding stuffs - Sampling (ISO 6497:2002)

[5] ISO 6498, Animal feeding stuffs - Preparation of test samµles

[6] ISO 5725 (all parts), Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results.