Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12599:2018 (EN 16007:2011) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định ochratoxin A bằng phương pháp làm sạch qua cột ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12599:2018

EN 16007:2011

QUY THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH QUA CỘT ÁI LỰC MIỄN DỊCH VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG

Animal feeding stuffs - Determination of ochratoxin A in animal feed by immunoaffinity column clean-up and high performance liquid chromatography with fluorescence detection

Lời nói đầu

TCVN 12599:2018 hoàn toàn tương đương với EN 16007:2011;

TCVN 12599:2018 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH QUA CỘT ÁI LỰC MIỄN DỊCH VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG

Animal feeding stuffs - Determination of Ochratoxin A in animal feed by immunoaffinity column clean-up and High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định Ochratoxin A (OTA) trong thức ăn chăn nuôi có thành phần cơ bản là ngũ cốc, sử dụng phương pháp làm sạch qua cột ái lực miễn dịch và phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang.

CHÚ THÍCH: Nồng độ khối lượng OTA đã được thẩm định trong khoảng 39 µg/kg đến 338 µg/kg.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

Chiết OTA ra khỏi mẫu thử bằng hỗn hợp metanol - dung dịch natri bicarbonate 3 % trong nước. Dịch chiết được lọc, pha loãng với PBS và làm sạch bằng cách sử dụng cột ái lực miễn dịch (IAC). Trước tiên tách OTA ra khỏi cột IAC bằng metanol và sau đó bằng nước, thêm nước vào dịch tách rửa đến thể tích đã định và tiến hành lượng định bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang.

4  Thuốc thử

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử loại phân tích và sử dụng các dung môi có chất lượng HPLC hoặc chất lượng tốt hơn, trừ khi có quy định khác,

4.1  Metanol, CH₃OH, loại kỹ thuật.

4.2  Metanol, CH₃OH, loại dùng cho HPLC

4.3  Nước, nước (loại 1 trong TCVN 4851 (ISO 3696) và nước (loại 3 trong TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc tương đương.

4.4  Kali clorua, KCl.

4.5  Natri clorua, NaCl.

4.6  Dinatri hydrophosphat ngậm 12 phân tử nước, Na₂HPO₄.12H₂O.

4.7  Axetonitril, CH₃CN, loại HPLC.

4.8  Axit axetic đậm đặc (băng), CH₃COOH, tối thiểu 96 %.

4.9  Dung dịch axetonitril/axit axetic băng, pha axetonitril (4.7) và axit axetic băng (4.8) theo tỷ lệ 99/1 (thể tích).

4.10  Toluen, C₆H₅CH₃, loại phân tích.

4.11  Dung dịch toluen/axit axetic: pha toluen (4.10)/axit axetic băng (4.8) với tỷ lệ 99/1 (thể tích).

4.12  Natri hydro cacbonat (NaHCO₃), độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.13  Muối đệm phosphat (PBS) đậm đặc. Hòa tan các thành phần sau đây trong 1800 ml nước (nước loại 1 trong TCVN 4851):

- 4 g KCl (4.4);

-160 g NaCl (4.5);

- 72 g Na₂HPO₄.12H₂O (4.6).

4.14  PBS sẵn để sử dụng

Pha loãng 100 ml dung dịch PBS (4.13) đến 1000 ml với nước (nước loại 1 trong TCVN 4851). Chỉnh đến pH 7,4 bằng HCl 1 mol/l và thêm nước đủ 2000 ml (nước loại 1 trong TCVN 4851).

hoặc bằng cách

Hòa tan viên nén PBS trong 200 ml nước (nước loại 1 trong TCVN 4851) thu được dung dịch đệm phosphat 0,01 mol/lit, kali clorua 0,0027/ mol/lit và natri clorua 0,137 mol/lit, pH 7,4, ở 25 °C (ví dụ Sigma P4417).

4.15  Dung dịch natri hydro cacbonat 3 %

Cho 30 g natri hydro cacbonat (4.12) vào 1000 ml nước (nước loại 3 trong TCVN 4851).

4.16  Dung môi chiết, metanol/dung dịch nước natri hydro cacbonat 3 % theo tỷ lệ 50/50 (thể tích).

Cho 500 ml metanol (4.1) vào 500 ml dung dịch natri hydro cacbonat 3 % (4.15). Trộn đều.

4.17  Dung dịch axit axetic

Cho 30 ml axit axetic băng (4.8) vào 870 ml nước (nước loại 1 trong TCVN 4851) và lọc.

4.18  Pha động HPLC, axetonitril/metanol/dung dịch axit axetic băng theo tỷ lệ 35/35/30 (thể tích).

Trộn 1050 ml metanol (4.2) với 1050 ml axetonitril (4.7) và 900 ml dung dịch axit axetic băng (4.17). Trộn đều và khử bọt khí.

4.19  Ochratoxin A (OTA)

OTA tinh khiết dạng tinh thể, dạng màng khô, dạng bột hoặc trong dung dịch.

4.20  Dung dịch chuẩn OTA gốc

Chuẩn bị dung dịch 20 µg/ml trong dung dịch toluen/axit axetic (4.11) từ OTA (4.19)

Để xác định chính xác nồng độ, sử dụng máy đo quang phổ UV (5.21) ghi lại đường hấp thụ của dung dịch này trong khoảng bước sóng từ 300 nm và 370 nm trong cuvet thạch anh 1 cm, dùng dung dịch axit toluen/axit axetic (4.11) làm dung dịch so sánh. Xác định bước sóng có độ hấp thụ cực đại. Tính nồng độ khối lượng của OTA, ρ_ota, bằng microgam trên mililit theo công thức (1):

Trong đó:

4.21  Nitơ.

4.22  Dung dịch OTA trung gian

Chuẩn bị 10 ml dung dịch chuẩn OTA gốc pha loãng để dựng đồ thị hiệu chuẩn bằng cách pha loãng 100 lần dung dịch chuẩn OTA gốc (4.20) với pha động (4.18). Dùng pipet lấy 100 µl dung dịch OTA gốc cho vào bình (ống) định mức, làm bay hơi dung dịch gốc bằng cách thổi nhẹ nitơ (4.21) ở 40 °C và thêm pha động (4.18) đến vạch.

CHÚ THÍCH: Để hòa tan hoàn toàn OTA trong pha động, đầu tiên chỉ cho pha động vào bình định mức khoảng 1/3 thể tích, hòa tan OTA và sau đó thêm pha động đến vạch và lắc.

4.23  Dung dịch hiệu chuẩn

Từ dung dịch chuẩn OTA trung gian (4.22) chuẩn bị sáu dung dịch hiệu chuẩn với 6 nồng độ bằng cách cho các thể tích dung dịch chuẩn OTA gốc pha loãng như trong Bảng 1 dưới đây vào 6 bình định mức và thêm pha động (4.18) đến vạch.

Bảng 1 - Các dung dịch hiệu chuẩn (4.23) được khuyến cáo để xác định OTA

4.24  IAC với kháng thể đặc hiệu cho OTA

IAC chứa kháng thể đặc hiệu cho OTA. Các cột OTA phải có khả năng giữ không nhỏ hơn 100 ng OTA. Mức độ thu hồi OTA không được nhỏ hơn 85 % khi áp dụng mức 5 ng OTA trong 50 ml hỗn hợp gồm 4 thể tích dung môi chiết (4.16) và 96 thể tích PBS sẵn để sử dụng (4.14).

4.25  Dung dịch thêm chuẩn

OTA trong dung dịch axeticitril/axit axetic băng theo tỷ lệ 99/1 (thể tích). Nồng độ OTA trong dung dịch thêm chuẩn phụ thuộc vào mức yêu cầu. Thể tích dung dịch thêm chuẩn nên ở khoảng 500 µl. Dung dịch thêm chuẩn có thể được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn OTA gốc (4.20) bằng cách tương tự như khi chuẩn bị dung dịch chuẩn OTA trung gian (4.22).

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các trang thiết bị thí nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm, như ống đong định mức, cốc, pipet định mức.

5.2  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.3  Máy lắc ngang hoặc lắc đứng.

5.4  Hệ thống hút chân không SPE tự động.

5.5  Bình định mức, dung tích 5 ml, 10 ml, 100 ml.

5.6  Giấy lọc đã được gấp nếp trước, giữ được hạt 30 µm.

5.7  Các bình có nút vặn, dung tích 250 ml và 500 ml.

5.8  Phễu thủy tinh, đường kính trong 9 cm.

5.9  Bình chứa, bằng polypropylen, thích hợp để gắn trên đỉnh cột IAC, dung tích từ 50 đến 75 ml.

5.10  Xyranh bằng chất dẻo, dung tích 5 ml.

5.11  Micropipet đã hiệu chuẩn, dung tích 100 µl, 500 µl và 1000 µl.

5.12  Hệ thống lọc dung môi hút chân không, phù hợp với bộ lọc 47 mm.

5.13  Bộ lọc vi sợi thủy tinh, giữ được hạt cỡ 1,6 µm.

5.14  Máy trộn vortex.

5.15  Xyranh lọc dùng cho HPLC, bằng nylon kích thước lỗ 0,45 µm.

5.16  Bể siêu âm.

5.17  Lọ thủy tinh màu hổ phách, dung tích khoảng 2 ml và có nắp vặn hoặc tương đương.

5.18  Hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC bao gồm:

- Bơm không xung, tốc độ bơm 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min;

- Hệ thống bơm mẫu, bằng tay hoặc bộ lấy mẫu tự động, có kim thích hợp để bơm 100 µl đến 300 µl;

- Detector huỳnh quang, thích hợp để đo ở bước sóng kích thích 333 nm và phát xạ ở 467 nm;

- Bộ máy vi tính.

5.19  Cột phân tích HPLC pha đảo, C18 cột pha đảo phù hợp để tách hiệu quả OTA ra khỏi các thành phần khác; Cột có đầy đủ các đặc tính về kích thước và đặc tính pha tĩnh dài 250 mm x đường kính trong 4,6 mm x cỡ hạt 5 µm.

5.20  Tiền cột (cột bảo vệ), có cùng vật liệu pha tĩnh như cột phân tích, đường kính trong 4,0 mm, pha tĩnh với cỡ hạt 5 µm.

5.21  Máy đo quang phổ UV.

6  Chuẩn bị mẫu

6.1  Chiết OTA

- Cân 25,0 g mẫu thử chính xác đến 0,1 g, cho vào một hộp chứa đủ lớn có nắp, ví dụ: Bình dung tích 500 ml có nắp vặn (5.7).

CHÚ THÍCH 1: Mẫu nghiên cứu liên phòng thí nghiệm^[1] được nghiền nhỏ đến kích thước hạt khoảng 0,5 mm.

- thêm 200,0 ml dung môi chiết (4.16), đóng chặt nắp và lắc mạnh bằng tay trong vài giây để cho vật liệu phân tán đều (kiểm tra trực quan).

- đặt hộp chứa lên máy lắc (5.3) trong 40 min, chọn tốc độ sao cho các thành phần được trộn đều mà không bị bám trên thành bình. Cách khác là dùng bể siêu âm xử lý trong 15 min; trong trường hợp này lắc nhanh hộp chiết bằng tay trong vài giây.

- để yên mẫu cho lắng xuống sau khi lắc.

- lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.6) và thu dịch chiết đã lọc vào bình có nắp vặn 250 ml (5.7), và

- lấy khoảng 10 ml dịch chiết đã lọc cho vào hệ thống lọc hút chân không và lọc qua bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.13) có sử dụng hút chân không nhẹ (5.12). Gạn bỏ lượng dịch chiết này và lọc một lần nữa tất cả phần dịch chiết còn lại và thu vào bình có nắp vặn 250 ml (5.7) có được dịch chiết trong suốt để phân tích tiếp. Tiến hành ngay công đoạn làm sạch qua cột IAC (6.2).

CHÚ THÍCH 2: Không sử dụng chân không mạnh lúc mới bắt đầu lọc để không làm vẩn đục dịch chiết sau lọc.

6.2  Làm sạch và dung dịch thử

- dùng một IAC (cột ái lực miễn dịch 4.24) cho từng dịch chiết;

- gắn cột vào bình chứa (5.9), không tháo dung dịch bảo quản cột ra khỏi cột;

- cho 4,00 ml dịch chiết đã lọc hai lần vào bình định mức 100 ml (5.5), thêm PBS sẵn để sử dụng (4.14) đến vạch và lắc;

- cho 50,0 ml dịch chiết đã pha loãng vào bình chứa đã gắn ở cột IAC; Lượng dịch này tương đương với 2,00 ml dịch chiết đã lọc hai lần chưa pha loãng;

- mở khóa của cột IAC;

- cho dịch chiết đi qua cột IAC với tốc độ dòng chảy ổn định cho đến khi toàn bộ dịch chiết đi hết qua cột ái lực miễn dịch và mẻ dung môi cuối cùng chạm đáy cột;

- sau khi dịch chiết đã chảy hết hoàn toàn qua cột, rửa cột IAC bằng 10 ml nước; đảm bảo nước có pH trung tính;

- thổi không khí qua IAC (ví dụ sử dụng một ống bơm lớn nối với cột) để thổi nước dư thừa;

- đặt bình định mức 5 ml (5.5) phía dưới IAC và thêm 0,75 ml metanol (4.2) vào IAC;

- thu dịch rửa giải vào bình định mức 5 ml;

- sau khi những giọt metanol cuối cùng đi qua IAC, để cho metanol ở lại trong IAC trong khoảng 1 min; sau đó cho thêm 0,75 ml metanol (4.2) vào cột và tiếp tục thu lấy dịch rửa giải, cho thêm 0,50 ml nước (nước loại 1 trong TCVN 4851);

- cẩn thận thổi không khí qua IAC để thu lấy tối đa lượng metanol và nước đã thêm vào cột;

- thêm ngay 1,5 ml dung dịch axit axetic (4.17) vào bình định mức; và

- thêm nước (nước loại 1 trong TCVN 4851) vào đầy đến vạch bình định mức và lắc bằng máy vortex. Trong trường hợp dịch chiết mẫu bị đục, tiến hành lọc các dung dịch thử qua bộ lọc xyranh dùng cho HPLC (5.15). Dung dịch này có thể được sử dụng trực tiếp làm dung dịch thử.

9  Độ chụm

9.1  Nghiên cứu cộng tác

Chi tiết của việc nghiên cứu liên phòng thí nghiệm về độ chụm của phương pháp được thể hiện trong [1]. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thí nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

9.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, trên cùng một chất liệu thử, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Bảng 2 - Độ chụm của dữ liệu giới hạn lặp lại

Mối tương quan giữa r và  có thể được ước lượng một cách đầy đủ bằng công thức sau:

có nghĩa là độ lệch chuẩn lặp lại tương đối là không đổi trong dải làm việc.

9.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, trên cùng một mẫu thử do hai phòng thí nghiệm khác nhau thực hiện, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Bảng 3 - Độ chụm của dữ liệu giới hạn tái lập

Mối tương quan giữa R và  có thể được ước lượng một cách đầy đủ bằng công thức sau:

nghĩa là độ lệch chuẩn tương đối tái lập không đổi trong dải làm việc.

10  Báo cáo kết quả thử nghiệm

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải ghi rõ:

a) thông tin cần thiết để xác định đầy đủ mẫu (loại mẫu, mẫu gốc, mẫu chỉ định;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và việc xử lý mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày phân tích;

f) kết quả thử nghiệm thu được và đơn vị biểu thị kết quả;

g) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được;

h) các tình huống bất thường quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

i) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Ví dụ về các sắc đồ

Hình A.1 - Ví dụ sắc đồ (~ 200 µg/kg OTA trong thức ăn chăn nuôi)

Phụ lục B

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thí nghiệm

Các dữ liệu nêu trong Bảng B.1 và Bảng B.2 thu được trong một nghiên cứu liên phòng thí nghiệm [1] theo Hướng dẫn của AOAC về nghiên cứu hợp tác để đánh giá xác nhận các đặc tính của phương pháp phân tích [2], [3]. Mẫu thử được nêu trong Bảng B.3.

Bảng B.1 - Đặc tính hiệu năng từ nghiên cứu hợp tác OTA trong thức ăn chăn nuôi

Bảng B.2 - Đặc tính hiệu năng từ nghiên cứu liên phòng về OTA trong thức ăn chăn nuôi (đã hiệu chính về độ thu hồi - chỉ để biết thông tin)

Bảng B.3 - Thành phần vật liệu thử của phép thử liên phòng thử nghiệm^[1]

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Stroka, J., Ambrosio, M., Donchva, I., Lerda, D., Mischke, C., Breidbach, A., (2009) Validation of an Analytical Method to Determine the Content of Ochratoxin A in Animal Feed - Report EUR 23657 EN -ISBN 978-92-79-11063-4, LA-NA-23657-EN-C, 10.2787/94797, JRC49205, European Commission, Brussels, Belgium

[2] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, p. 23-51

[3] Horwitz, W. (1995), Pure and Applied Chemistry, 67, p. 331-343

[4] Thompson, M. (2000), Analyst, 125 p. 385-386