Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12385:2018 về Thực phẩm - Xác định hàm lượng cholesterol - Phương pháp sắc ký khí

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12385:2018

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Foodstuffs - Determination of cholesterol - Gas chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 12385:2018 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 994.10 Cholesterol in Foods. Direct Saponification-Gas Chromatographic Method;

TCVN 12385:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Foodstuffs - Determination of cholesterol - Gas chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký khí để xác định hàm lượng cholesterol trong thực phẩm.

Giới hạn định lượng của phương pháp là 1 mg/100 g.

2  Nguyên tắc

Lipid trong phần mẫu thử được xà phòng hóa ở nhiệt độ cao bằng dung dịch kali hydroxit trong etanol. Phần không thể xà phòng hóa có chứa cholesterol và các sterol khác được chiết với toluen. Các sterol được tạo dẫn xuất thành các ete trimethylsilyl (TMS) và sau đó được định lượng bằng sắc ký khí.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.

3.1  Dimethylformamide (DMF), được chưng cất trong dụng cụ thủy tinh.

3.2  Hexamethyldisilane (HMDS).

3.3  Dung dịch nội chuẩn 5α-cholestan, 0,1 mg/ml trong n-heptan.

3.4  Chất chuẩn cholesterol

3.4.1  Dung dịch chuẩn gốc, 2,0 mg/ml DMF.

3.4.2  Dung dịch chuẩn làm việc

Pha loãng dung dịch gốc (3.3.1) với DMF để thu được 6 dung dịch có nồng độ 0,0025 mg/ml đến 0,2 mg/ml.

3.5  Dung dịch kali hydroxit (KOH), 50 % (tính theo khối lượng).

Hòa tan 500 g kali hydroxit trong 500 g nước.

3.6  Dung dịch kali hydroxit (KOH), 1 M.

Pha loãng 56 g kali hydroxit trong khoảng 800 ml nước nguội đựng trong bình định mức 1 L (4.6), sau đó thêm nước đến vạch

3.7  Dung dịch kali hydroxit (KOH), 0,5 M.

Pha loãng một phần thể tích dung dịch kali hydroxit (3.6) với một phần thể tích nước.

3.8  Trimethylchlorosilane (TMCS) (Ví dụ No. 88531, Pierce Chemical Co., hoặc loại tương đương).

3.9  Toluen, được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh.

3.10  Natri sulfat (Na₂SO₄), khan

3.11  Etanol (C₂H₅OH), 95 %.

3.12  Axeton (C₃H₆O).

3.13  Axit flohydric (HF), 10 %.

3.14  Metanol (CH₃OH), khan.

3.15  Bông thủy tinh.

4  Thiết bị, dụng cụ

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thiết bị và dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Ống ly tâm, dung tích 15 ml, ví dụ: Pyrex No. 14.

Silan hóa các ống như sau:

Đổ đầy axit flohydric 10 % (3.13) vào các ống ly tâm và để yên 10 min. Rửa kỹ ống bằng nước, sau đó bằng metanol khan (3.14). Làm khô ống dưới dòng nitơ. Đổ đầy HMDS (3.2) 10 % trong toluen (3.9) vào các ống này và để yên 1 h. Tráng kỹ ống bằng toluen (3.9), sau đó bằng metanol khan (3.14). Trước khi sử dụng, làm khô ống ở nhiệt độ 100 °C.

Ngoài ra, có thể sử dụng thuốc thử silan thương mại. Trước mỗi lần sử dụng lại, làm sạch các ống lần lượt bằng nước, etanol, hexan và axeton, sau đó sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 100 °C. Các ống có thể tái sử dụng mà không phải silan hóa lại nếu không tráng rửa bằng kiềm mạnh.

Silan hóa lại các ống ít nhất 6 tháng một lần.

4.2  Máy sắc ký khí (GC), gồm có:

- detector ion hóa ngọn lửa hydro, có chế độ chia dòng;

- cột mao quản kích thước 25 m x 0,32 mm x 0,17 µm, phenyl-methyl silicon 5 % liên kết ngang hoặc methyl silicon (ví dụ: Hewlett Packard No. HP-5, Ultra 2 hoặc HP-1);

- ống lót chia dòng được đổ đầy bằng SP 2100 10 % lên cột nhồi Superelco 80 mesh đến 100 mesh;

- 2 chương trình tăng nhiệt độ sấy (ví dụ: Hewlett Packard Model 5890A là phù hợp).

4.3  Bộ cô quay.

4.4  Bếp điện có máy khuấy từ, có kiểm soát nhiệt độ và tốc độ khuấy.

4.5  Bình nón, dung tích 125 ml và 250 ml.

4.6  Bình định mức, dung tích 1 L.

4.7  Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.

4.8  Cân phân tích, có thể cần chính xác đến 0,0001 g.

4.9  Phễu chiết, dung tích 500 ml.

4.10  Bình đun sôi đáy phẳng, 125 g.

4.11  Micropipet, có khả năng phân phối 100 µl và 200 µl.

4.12  Máy lắc trộn, dùng cho ống nghiệm.

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

6  Cách tiến hành

6.1  Xà phòng hóa

Dùng cân (4.8) cân phần mẫu thử (W₁, thường từ 2 g đến 3 g), chính xác đến 0,001 g, cho vào bình nón 250 ml (4.5). Phần mẫu thử chứa tối đa 1 g chất béo hoặc tối đa 5 g nước (nghĩa là cân 1 g dầu thực vật tinh khiết, 1,5 g salad trộn và tối đa 5 g mẫu có độ ẩm cao). Đặt thanh khuấy từ vào bình. Thêm vào bình 40 ml etanol 95 % (3.11) và 8 ml dung dịch kali hydroxit 50 % (3.5).

CHÚ THÍCH: Một phần etanol có thể được giữ lại và dùng để tráng rửa sau khi thêm kali hydroxit 50 %, (4.5.1). Điều này giúp ngăn các khớp nối thủy tinh mài của bình và bình sinh hàn đính với nhau.

Đặt bình lên bếp điện có máy khuấy từ (4.4), lắp bình sinh hàn, bật bếp và cho đối lưu trong 70 min ± 10 min. Để đảm bảo xà phòng hóa hoàn toàn, thỉnh thoảng dùng đũa thủy tinh để đánh tan các cục vón hoặc thêm dung dịch kali hydroxit vào phần mẫu thử trong khi vẫn khuấy.

Tắt nguồn nhiệt và thêm 60 ml etanol 95 % (3.11) qua đỉnh của bình sinh hàn trong khi khuấy dung dịch. Sau 15 min lấy bình ra khỏi bình sinh hàn, đậy nắp bình và để nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng. Dung dịch này có thể bền đến 24 h.

6.2  Chiết

Bổ sung 100 ml (V₁) toluen (3.9) vào phần mẫu thử đã được xà phòng hóa (xem 6.1) trong khi vẫn khuấy. Đậy bình và khuấy trong 30 s. Rót dung dịch vào phễu chiết 500 ml (4.9) mà không rửa. Thêm 110 ml dung dịch kali hydroxit 1 M (3.6) và lắc mạnh trong 10 s. Để cho tách pha và loại bỏ pha nước (phía dưới) (sẽ bị đục). Bổ sung 40 ml dung dịch kali hydroxit 0,5 M (3.7) vào phễu chiết, lật ngược phễu, và lắc nhẹ trong 10 s. Loại bỏ pha nước (phía dưới).

Rửa lớp toluen bằng 40 ml nước bằng cách xoay nhẹ phễu chiết. Để cho tách pha và loại bỏ pha nước. Lặp lại việc rửa bằng nước rửa ít nhất 3 lần, lắc mạnh hơn sau mỗi lần rửa. Nếu xuất hiện nhũ tương thì thêm một lượng nhỏ etanol 95 % (3.11), khuấy lượng chứa trong phễu để cho tách pha và tiếp tục rửa bằng nước. Sau lần rửa cuối cùng, lớp toluen phải trong.

Rót lớp toluen từ miệng của phễu chiết qua phễu thủy tinh có chứa nút bông thủy tinh (3.15) và khoảng 20 g natri sulfat khan (3.10) vào bình nón 125 ml (4.5) chứa khoảng 2 g natri sulfat (3.10). Đậy nắp và khuấy lượng chứa bên trong. Để yên hỗn hợp tối đa 15 min. Dung dịch thử có thể bền trong 24 h nếu được đậy kín khí.

Dùng pipet (4.7) lấy 25 ml (V₂) dịch chiết cho vào bình đun sôi đáy phẳng 125 g (4.10) sau đó làm bay hơi lượng chứa bên trong đến khô trên bộ cô quay (4.3) ở 40 °C ± 3 °C. Thêm khoảng 3,0 ml axeton (3.12) và làm bay hơi lượng chứa trong bình đến khô. Hòa tan phần còn lại trong 3,0 ml (V₃) DMF (3.1). Nồng độ cholesterol cuối cùng trong DMF phải nằm trong dải các dung dịch chuẩn làm việc (3.4.2).

CHÚ THÍCH: Nếu sau khi định lượng bằng sắc ký khí, nồng độ phần mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì thay đổi lượng dịch chiết trong toluen được làm bay hơi hoặc thể tích của DMF dùng để hòa tan lượng cặn còn lại, hoặc kết hợp cả hai, vì vậy nồng độ cholesterol cuối cùng trong DMF nằm trong dải tiêu chuẩn. Nếu phần mẫu thử chứa ít hoặc không chứa cholesterol thì 75 ml dịch chiết trong toluen được làm khô và hòa tan lại trong 2 ml DMF là đủ để phát hiện cholesterol với nồng độ 1 mg/100 g trong 1 g phần mẫu thử.

6.3  Tạo dẫn xuất

Dùng pipet (4.7) lấy các lượng 1,0 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.4.2) và dung dịch thử (xem 6.2) cho vào các ống ly tâm 15 ml (4.1) riêng rẽ. Bổ sung vào mỗi ống 0,2 ml HMDS (3.2) và 0,1 ml TMCS (3.8). Đậy nắp và lắc mạnh trên máy lắc trộn (4.12) hoặc lắc bằng tay trong 30 s. Để yên dung dịch 15 min. Thêm vào mỗi ống 1,0 ml dung dịch nội chuẩn 5α-cholestan (3.3) và 10 ml nước. Đậy nắp ống, lắc mạnh 30 s và ly tâm khoảng 2 min.

Chuyển lớp phía trên vào lọ bơm. Đảm bảo không có pha nước nào được chuyển lẫn vào.

Các chuẩn và dung dịch thử đã được tạo dẫn xuất phải được phân tích trong vòng 24 h.

6.4  Phân tích sắc ký khí

Bơm 1 µl hoặc một lượng thích hợp khác vào máy sắc ký khí (4.2).

Các điều kiện vận hành máy sắc ký khí sau đây cho thấy thích hợp:

- Nhiệt độ:

+ Nhiệt độ bơm: 250 °C;

+ Nhiệt độ detector: 300 °C;

+ Nhiệt độ cột: 190 °C;

- Chương trình nhiệt độ cột: Giữ trong 2 min; tăng tốc độ 20 °C/min đến 230 °C, giữ trong 3 min; tăng tốc độ 40 °C/min đến 255 °C, giữ trong 25 min;

Tốc độ dòng: khí heli, khoảng 2 ml/min;

Tốc độ đường xả khí chia dòng: khoảng 30 ml/min;

Tốc độ đường xả khí làm sạch buồng bơm mẫu: khoảng 3 ml/min;

Tốc độ khí hỗ trợ: khoảng 20 ml/min;

Tốc độ khí hydro: khoảng 35 ml/min;

Tốc độ không khí: khoảng 280 ml/min.

Xác định diện tích pic của 5α-cholestan và cholesterol bằng cách sử dụng phép đo chiều rộng và chiều cao hoặc bộ tích phân kỹ thuật số.

CHÚ THÍCH  5α-cholestan và cholesterol phải được rửa giải trong khoảng 11 min đến 13 min và từ 16 min đến 18 min, tương ứng. Nếu không đáp ứng được thời gian lưu này thì điều chỉnh tốc độ và nhiệt độ của chất mang.

6.5  Dựng đường chuẩn

Chia diện tích pic cholesterol cho diện tích pic của chất nội chuẩn để thu được tỷ lệ đáp ứng chuẩn. Dựng tỷ lệ đáp ứng của 4 chất chuẩn có nồng độ cao (từ 0,01 mg/ml đến 0,20 mg/ml) so với nồng độ cholesterol. Đồ thị tỷ lệ đáp ứng chuẩn cần tương đồng với tỷ lệ đáp ứng dung dịch thử. Nếu cần, dựng đường chuẩn thấp (0,0025 mg/ml đến 0,05 mg/ml) đối với các dung dịch thử có nồng độ thấp. Pha loãng dung dịch thử có nồng độ cao đến dải nồng độ của chất chuẩn.

7  Tính kết quả

a) Lượng phần mẫu thử tương ứng với 1 ml dung dịch thử được tạo dẫn xuất, A, biểu thị bằng gam trên mililit (g/ml) được tính bằng Công thức (1):

 (1)

Trong đó:

W₁ là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V₁ là thể tích toluen được dùng để chiết, tính bằng mililit (trường hợp này là 100 ml);

V₂ là thể tích dịch chiết được lấy để làm khô (xem 6.2), tính bằng mililit (trường hợp này là 25 ml);

V₃ là thể tích của DMF dùng để hòa tan phần còn lại sau khi làm khô dịch chiết, tính bằng mililit (trường hợp này là 3,0 ml).

b) Hàm lượng cholesterol trong phần mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên 100 gam (mg/100 g), được tính bằng Công thức (2):

 (2)

Trong đó:

C là hàm lượng cholesterol trong dung dịch thử thu được từ đường chuẩn (6.5), tính bằng miligam trên mililit (mg/ml);

A là lượng phần mẫu thử tương ứng với 1 ml dung dịch thử được tạo dẫn xuất, tính bằng gam trên mililit (g/ml) theo Công thức (1).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định cholesterol trong thực phẩm bằng phương pháp xà phòng hóa trực tiếp