Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12382:2018 về Thực phẩm - Xác định hàm lượng tinh bột và sản phẩm phân hủy bằng enzym của tinh bột - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12382:2018

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT VÀ SẢN PHẨM PHÂN HỦY BẰNG ENZYM CỦA TINH BỘT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs - Enzymatic determination of starch and its degradation products - Method using high performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 12382:2018 được xây dựng trên cơ sở tham khảo EU No 118/2010, Annex I, Enzymatic determination of starch and its degradation products including glucose in food products using high performance liquid chromatography;

TCVN 12382:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT VÀ SẢN PHẨM PHÂN HỦY BẰNG ENZYM CỦA TINH BỘT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs - Enzymatic determination of starch and its degradation products - Method using high performance liquid chromatography

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng tinh bột và các sản phẩm phân hủy bằng enzym của tinh bột, kể cả glucose, trong các sản phẩm thực phẩm.

Hàm lượng tinh bột được xác định theo glucose bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau khi dùng enzym để chuyển hóa tinh bột và các sản phẩm phân hủy tinh bột thành glucose.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1

Hàm lượng glucose tổng số (total glucose content)

Phần khối lượng glucose xác định được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Hàm lượng glucose tổng số được biểu thị bằng gam trên 100 g (g/100 g).

2.2

Hàm lượng tinh bột và sản phẩm phân hủy bằng enzym của tinh bột (content of starch and its degradation products)

Hàm lượng glucose tổng số biểu thị theo tinh bột (total glucose content expressed as starch)

Phần khối lượng tinh bột tính được từ hàm lượng glucose tổng số (2.1) nhân với hệ số chuyển đổi.

CHÚ THÍCH: Hàm lượng tinh bột và sản phẩm phân hủy bằng enzym của tinh bột được biểu thị bằng gam trên 100 g (g/100 g).

3  Nguyên tắc

Mẫu được đồng hóa và huyền phù hóa trong nước. Tinh bột và sản phẩm phân hủy của tinh bột có trong mẫu, được enzym chuyển thành glucose qua hai bước:

a) Tinh bột và các sản phẩm phân hủy của tinh bột được chuyển một phần thành các chuỗi glucose hòa tan sử dụng alpha-amylase chịu nhiệt ở 90 °C. Để chuyển đổi hiệu quả, các mẫu cần được hòa tan hoàn toàn hoặc ở dạng huyền phù chứa một phần rất nhỏ chất rắn.

b) Các chuỗi glucose hòa tan được chuyển thành glucose khi sử dụng amyloglucosidase ở 60 °C.

Các sản phẩm chứa hàm lượng protein hoặc chất béo cao được làm trong rồi lọc.

Phép xác định đường được thực hiện bằng phân tích HPLC.

Vì có thể xuất hiện chuyển hóa một phần saccarose trong quá trình xử lý bằng enzym, nên việc xác định đường tự do cũng được thực hiện bằng phép phân tích HPLC để tính hàm lượng glucose đã được hiệu chỉnh.

4  Thuốc thử

Sử dụng các thuốc thử loại đạt chất lượng phân tích và nước đã loại khoáng.

4.1  Glucose, độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.2  Fructose, độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.3  Saccarose, độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.4  Maltose-ngậm một phân tử nước, độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.5  Lactose-ngậm một phân tử nước, độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.6  Dung dịch alpha-amylase chịu nhiệt (1,4-alpha-D-glucan-glucanohydrolase) có hoạt độ khoảng 31 000 U/ml (1 U sẽ giải phóng 1,0 mg maltose ra khỏi tinh bột trong 3 min ở pH 6,9 và 20 °C). Enzym này có thể có chứa một lượng tạp chất thấp (ví dụ glucose hoặc saccarose) và các enzym gây nhiễu khác. Bảo quản dung dịch ở khoảng 4 °C. Ngoài ra, có thể sử dụng các nguồn alpha-amylase khác để tạo ra dung dịch cuối cùng có hoạt độ enzym tương đương.

4.7  Amyloglucosidase (1,4-alpha-D-Glucan glucohydrolase) từ Aspergillus niger

Dạng bột có hoạt độ khoảng 120 U/mg hoặc khoảng 70 U/mg (1 U sẽ giải phóng 1 µmol glucose ra khỏi tinh bột trong 1 min ở pH 4,8 và 60 °C). Enzym này có thể chứa một lượng nhỏ tạp chất (ví dụ glucose hoặc saccarose) và các enzym gây nhiễu khác (ví dụ, invertase). Bảo quản dung dịch ở khoảng 4 °C. Ngoài ra, có thể sử dụng các nguồn amyloglucosidase khác để cho dung dịch cuối cùng có hoạt độ enzym tương đương.

4.8  Kẽm axetat ngậm hai phân tử nước [Zn(CH₃COO)₂.2H₂O], tinh khiết phân tích.

4.9  Kali hexacyanoferrat (II) (K₄[Fe(CN)]₆.3H₂O), độ tinh khiết cao.

4.10  Natri axetat, khan, tinh khiết phân tích.

4.11  Axit axetic băng, độ tinh khiết (tối thiểu) 96 % (thể tích).

4.12  Đệm natri axetat, 0,2 mol/l

Cân 16,4 g natri axetat (4.10) vào cốc thủy tinh có mỏ. Hòa tan trong nước và tráng cốc cho nước tráng vào bình định mức 1 000 ml. Pha loãng với nước và chỉnh pH đến 4,7 bằng axit axetic, sử dụng máy đo pH (5.7). Dung dịch này có thể được sử dụng tối đa trong 6 tháng khi được bảo quản ở 4 °C.

4.13  Dung dịch amyloglucosidase

Chuẩn bị dung dịch từ bột amyloglucosidase (4.7) sử dụng đệm natri axetat (4.12). Hoạt độ của enzym phải đủ và phù hợp với hàm lượng tinh bột trong lượng mẫu [ví dụ: hoạt độ khoảng 600 U/ml thu được từ 0,5 g bột amyloglucosidase 120 U/mg (4.7) trong thể tích cuối cùng 100 ml đối với 1 g tinh bột trong mẫu]. Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng.

4.14  Dung dịch chuẩn

Chuẩn bị các dung dịch glucose, fructose, saccarose, maltose và lactose trong nước, như quy ước được sử dụng trong phân tích đường bằng HPLC.

4.15  Thuốc thử để làm trong dung dịch (Carrez I)

Hòa tan 219,5 g kẽm axetat (4.8) bằng nước đựng trong cốc có mỏ bằng thủy tinh. Tráng và cho vào bình định mức 1 000 ml và thêm 30 ml axit axetic (4.11). Trộn đều và thêm nước đến vạch. Dung dịch này có thể được sử dụng tối đa 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ môi trường. Có thể sử dụng các thuốc thử để làm trong khác, tương đương với dung dịch Carrez.

4.16  Thuốc thử để làm trong dung dịch (Carrez II)

Hòa tan 106,0 g kali hexacyanoferrat (II) (4.9) bằng nước đựng trong cốc thủy tinh có mỏ. Tráng cốc và cho nước rửa vào bình định mức 1 000 ml. Trộn đều và pha loãng với nước. Dung dịch này có thể được sử dụng tối đa 6 tháng trong khi được bảo quản ở nhiệt độ môi trường. Có thể sử dụng các thuốc thử khác để làm trong, tương đương với dung dịch Carrez.

4.17  Pha động dùng cho HPLC

Chuẩn bị pha động quy ước được sử dụng trong phân tích các loại đường bằng HPLC. Trong trường hợp sử dụng cột silica gel aminopropyl, ví dụ: pha động thông thường là hỗn hợp của nước dùng cho HPLC và axetonitril.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

5.1  Dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thử nghiệm.

5.2  Giấy lọc gấp nếp, ví dụ: đường kính 185 mm.

5.3  Bộ lọc xyranh, cỡ lỗ 0,45 µm, thích hợp cho các dung dịch nước.

5.4  Lọ mẫu phù hợp với bộ lấy mẫu tự động của HPLC.

5.5  Bình định mức, dung tích 100 ml.

5.6  Xyranh, bằng chất dẻo, dung tích 10 ml.

5.7  Máy đo pH.

5.8  Cân phân tích.

5.9  Nồi cách thủy có bộ ổn nhiệt, có thể chỉnh đến nhiệt độ 60 °C đến 90 °C.

5.10  Thiết bị phân tích HPLC, thích hợp để phân tích đường.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu của một số loại sản phẩm

Đồng hóa mẫu.

6.2  Phần mẫu thử

Lượng mẫu được ước tính từ các thành phần được công bố và các điều kiện phân tích HPLC (nồng độ dung dịch chuẩn glucose) và không được vượt quá lượng mẫu, m, tính bằng gam (g) trong Công thức (1):

Trong đó:

V  là thể tích của bình định mức, tính bằng mililit (ví dụ, 100 ml);

m₁  là hàm lượng tinh bột ước tính, tính bằng phần trăm (%).

Cân lượng mẫu chính xác đến 0,1 mg.

6.3  Xác định mẫu trắng

Xác định mẫu trắng bằng cách thực hiện phép phân tích hoàn chỉnh (như trong 6.4) mà không cần thêm mẫu. Kết quả của phép xác định mẫu trắng được sử dụng để tính hàm lượng tinh bột (7.2).

6.4  Cách tiến hành

6.4.1  Chuẩn bị mẫu

Đồng hóa mẫu bằng cách lắc hoặc khuấy. Cân phần mẫu thử được chọn (6.2) vào bình định mức (5.5) và bổ sung khoảng 70 ml nước ấm.

Sau khi hòa tan hoặc tạo huyền phù, thêm 50 µl alpha-amylase chịu nhiệt (4.6) và đun nóng 30 min ở 90 °C trong nồi cách thủy (5.9). Làm nguội càng nhanh càng tốt về 60 °C trong nồi cách thủy và bổ sung 5 ml dung dịch amyloglucosidase (4.13). Đối với các mẫu có thể ảnh hưởng đến pH của dung dịch phản ứng thì kiểm soát độ pH và chỉnh pH 4,6 đến 4,8, nếu cần. Cho phép phản ứng trong vòng 60 min ở 60 °C. Làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng.

6.4.2  Làm trong

Đối với các mẫu có hàm lượng protein hoặc chất béo cao thì cần làm trong bằng cách thêm 1 ml Carrez I (4.15) vào dung dịch mẫu. Sau khi lắc, thêm 1 ml Carrez II (4.16). Lắc lại mẫu.

6.4.3  Tiến hành phân tích bằng HPLC

Mẫu đựng trong bình định mức được pha loãng bằng nước đến vạch, đồng hóa và lọc qua giấy lọc gấp nếp (5.2). Thu lấy dịch chiết mẫu.

Dùng xyranh (5.6) lọc các dịch chiết qua bộ lọc xyranh (5.3) đã được rửa trước bằng chất chiết. Thu lấy dịch lọc vào lọ (5.4).

6.5  Chạy sắc ký

Thực hiện phân tích đường bằng phương pháp HPLC. Nếu phân tích HPLC cho thấy các vết của maltose thì tinh bột chưa được chuyển đổi hoàn toàn, dẫn đến việc thu hồi glucose quá thấp.

7  Tính và biểu thị kết quả

7.1  Tính kết quả phân tích HPLC

Để tính hàm lượng tinh bột, cần có kết quả của hai phép phân tích HPLC, cụ thể là đường có trong mẫu trước xử lý (“đường tự do”) và sau khi xử lý bằng enzym (như mô tả trong phương pháp này). Cũng cần tiến hành phép xác định mẫu trắng (6.3) để hiệu chỉnh hàm lượng đường.

Trong phép phân tích HPLC, diện tích pic được xác định sau khi tích phân và nồng độ tính được sau khi hiệu chuẩn với các dung dịch chuẩn (4.14). Lấy nồng độ glucose (g/100 ml) sau khi xử lý bằng enzym, trừ đi nồng độ glucose (g/100 ml) trong mẫu trắng. Cuối cùng, hàm lượng các loại đường (biểu thị bằng gam trên 100 g mẫu) được tính theo lượng mẫu đã cân.

a) Phân tích HPLC trước khi xử lý bằng enzym, cho các hàm lượng đường (g/100g) tự do:

- glucose, G

- fructose, F

- saccarose, S.

b) Phân tích HPLC sau khi xử lý bằng enzym cho các hàm lượng (g/100 g) đường:

- glucose sau khi hiệu chỉnh mẫu trắng, G_{e cor}

- fructose, F_e

- saccarose, S_e.

7.2  Tính hàm lượng tinh bột

7.2.1  Tính hàm lượng glucose tổng số

Nếu hàm lượng fructose sau khi xử lý bằng enzym (F_e) cao hơn hàm lượng fructose trước khi xử lý bằng enzym (F) thì một phần saccarose có trong mẫu thử đã được chuyển thành fructose và glucose. Khi đó, phải hiệu chỉnh kết quả theo hàm lượng glucose được giải phóng (F_e - F).

Hàm lượng glucose tổng số (hàm lượng glucose cuối cùng sau khi hiệu chỉnh), Z, biểu thị bằng gam trên 100 g (g/100 g), được tính bằng Công thức (2):

Trong đó:

G_{e cor}  là hàm lượng glucose sau khi hiệu chỉnh mẫu trắng, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g);

F  là hàm lượng fructose trước khi xử lý bằng enzym, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g);

F_e  là hàm lượng fructose sau khi xử lý bằng enzym, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g).

7.2.2  Tính hàm lượng glucose tổng số biểu thị theo tinh bột

Hàm lượng glucose tổng số biểu thị theo tinh bột, E, biểu thị bằng gam trên 100 g (g/100 g), được tính bằng Công thức (3):

8  Độ chụm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm liên quan đến dữ liệu về độ chụm của phương pháp được thực hiện trên 2 mẫu đã cho, phản ánh các yêu cầu về hiệu suất đối với phương pháp mô tả trong Phụ lục A.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Phép thử liên phòng thử nghiệm đã được thực hiện trong năm 2008 với sự tham gia của các phòng thử nghiệm của Hải quan Châu Âu.

Dữ liệu của độ chụm được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm