Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12365-2:2018 (ISO 16140-2:2016) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp - Phần 2: Quy trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12365-2:2018

ISO 16140-2:2016

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP - PHẦN 2: QUY TRÌNH XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ SO VỚI PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Microbiology of the food chain - Method validation - Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method

Lời nói đầu

TCVN 12365-2:2018 hoàn toàn tương đương với ISO 16140-2:2016;

TCVN 12365-2:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 12365 (ISO 16140) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp gồm các tiêu chuẩn sau:

- TCVN 12365-1:2018 (ISO 16140-1:2016), Phần 1 - Thuật ngữ và định nghĩa

- TCVN 12365-2:2018 (ISO 16140-2:2016), Phần 2 - Quy trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn

Lời giới thiệu

Ngày nay có rất nhiều phương pháp thay thế, chủ yếu là các phương pháp độc quyền được sử dụng để đánh giá chất lượng vi sinh của nguyên liệu thô, thành phẩm và tình trạng vi sinh của quy trình sản xuất. Các phương pháp này thường nhanh hơn và dễ thực hiện hơn so với phương pháp chuẩn tương ứng. Các nhà xây dựng phương pháp, người sử dụng cuối cùng và các cơ quan chức năng cần có quy trình phổ biến đáng tin cậy để xác nhận giá trị sử dụng các phương pháp thay thế này. Dữ liệu thu được sẽ cung cấp cho người sử dụng cuối cùng về dữ liệu hiệu năng của phương pháp đưa ra, do đó, cho phép họ chọn phương pháp cụ thể. Các dữ liệu thu được cũng có thể được dùng làm cơ sở cho việc chứng nhận phương pháp bởi một tổ chức độc lập.

Tiêu chuẩn này:

- nhằm cung cấp quy trình cụ thể và hướng dẫn xác nhận giá trị sử dụng phương pháp độc quyền được sử dụng như một phương pháp nhanh và/hoặc dễ dàng thực hiện hơn so với phương pháp chuẩn tương ứng,

- cũng có thể được sử dụng để xác nhận giá trị sử dụng các phương pháp không độc quyền khác được sử dụng thay cho phương pháp chuẩn,

- được dự định là sự kế thừa của quy trình xác nhận được xuất bản trong phiên bản đầu tiên của ISO 16140 (ISO 16140:2003), và

- được xây dựng chủ yếu để xác nhận giá trị sử dụng các phương pháp có khả năng nuôi cấy vi sinh vật đích, nhưng cũng có thể áp dụng cho các phương pháp vi sinh vật không thể nuôi cấy như virus (ví dụ: Norovirus) và đơn bào ký sinh (ví dụ: Cryptosporidium hoặc Giardia). Trong những trường hợp này, một số từ ngữ cần được diễn giải để phù hợp với tình huống áp dụng cho sinh vật không thể nuôi cấy được.

Việc sử dụng tiêu chuẩn này liên quan đến chuyên môn về các lĩnh vực liên quan như vi sinh học, thiết kế thống kê, phân tích như được nêu trong các phần tương ứng. Thực tế thống kê bao gồm tổng quan về lý thuyết lấy mẫu và thiết kế các thực nghiệm, phân tích thống kê dữ liệu vi sinh (định tính và định lượng) và tổng quan về các khái niệm thống kê về lấy mẫu ngẫu nhiên, tính không đồng nhất của mẫu, tính ổn định của mẫu, thiết kế các thực nghiệm và các thành phần phương sai.

Khi tiêu chuẩn này được xem xét tiếp theo, sẽ phải tính đến tất cả các thông tin sẵn có liên quan đến mức độ tuân thủ các quy trình và lý do sai lệch đối với các sản phẩm cụ thể.

Việc hài hòa hóa các phương pháp xác nhận giá trị sử dụng không thể có ngay và đối với một số nhóm sản phẩm cụ thể thì tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc các tiêu chuẩn quốc gia có thể đang hiện hành mà không phù hợp với tiêu chuẩn này. Hy vọng rằng khi các tiêu chuẩn đó được soát xét, sẽ được thay đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, nếu không thì chỉ vì các lý do kỹ thuật. Ví dụ: ISO 16297 ^[3] đề cập đến xác nhận giá trị sử dụng cho một đối tượng riêng (tình trạng vệ sinh của mẫu sữa tươi nguyên liệu) và sẽ tồn tại như một tiêu chuẩn xác nhận bên cạnh tiêu chuẩn này. Nếu phải xác nhận thì tiêu chuẩn cụ thể này phải được ưu tiên riêng.

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP - PHẦN 2: QUY TRÌNH XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ SO VỚI PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Microbiology of the food chain - Method validation - Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chung và quy trình kỹ thuật để đánh giá các phương pháp thay thế, phần lớn là phương pháp độc quyền trong phân tích vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm. Các nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng theo tiêu chuẩn này được dùng cho các tổ chức đánh giá, xác nhận giá trị sử dụng phương pháp.

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng để xác nhận giá trị sử dụng các phương pháp phân tích (phát hiện hoặc định lượng) vi sinh vật trong:

- các sản phẩm thực phẩm;

- các sản phẩm thức ăn chăn nuôi;

- các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, xử lý thực phẩm và thức ăn chăn nuôi;

- các mẫu từ giai đoạn sản xuất ban đầu.

Tiêu chuẩn này trong trường hợp cụ thể có thể áp dụng cho vi khuẩn và nấm. Một số điều trong tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho các phương pháp xác định vi sinh vật khác hoặc các chất chuyển hóa của chúng tùy theo từng trường hợp. Trong tương lai, hướng dẫn cho các sinh vật khác (ví dụ: virus và ký sinh trùng) sẽ được đưa vào trong tiêu chuẩn này hoặc được tách thành một tiêu chuẩn riêng của bộ TCVN 12365 (ISO 16140).

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12365-1 (ISO 16140-1), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp - Phần 1: Thuật ngữ và định nghĩa.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa trong TCVN 12365-1 (ISO 16140-1).

4  Quy trình chung đối với việc xác nhận giá trị sử dụng các phương pháp thay thế

Quy trình xác nhận giá trị sử dụng bao gồm hai giai đoạn:

- nghiên cứu so sánh phương pháp của phương pháp thay thế (độc quyền) so với phương pháp chuẩn được thực hiện trong phòng thử nghiệm tổ chức;

- nghiên cứu liên phòng thử nghiệm của phương pháp thay thế (độc quyền) so với phương pháp chuẩn được thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau.

Các quy trình kỹ thuật để thực hiện nghiên cứu so sánh phương pháp và nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được quy định tại Điều 5 và Điều 6 tùy thuộc vào bản chất của phương pháp thay thế (độc quyền) là định tính hay định lượng. Dữ liệu thu được trong một số phần của nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng được đánh giá bằng cách sử dụng Giới hạn chấp nhận (AL) và không đánh giá thống kê về dữ liệu. Các AL này dựa trên ý kiến của các chuyên gia và dữ liệu thu được trong các nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng hiện hành.

5  Phương pháp định tính - Quy trình kỹ thuật về xác nhận giá trị sử dụng

5.1  Nghiên cứu so sánh phương pháp

5.1.1  Xem xét chung

Nghiên cứu so sánh phương pháp là một phần của quá trình xác nhận giá trị sử dụng được thực hiện trong phòng thử nghiệm tổ chức. Nghiên cứu này bao gồm ba phần sau:

- nghiên cứu so sánh các kết quả của phương pháp chuẩn với kết quả của phương pháp thay thế trong các mẫu nhiễm (tự nhiên và/hoặc nhân tạo) (cũng được gọi là nghiên cứu độ đáp ứng);

- nghiên cứu so sánh để xác định mức phát hiện tương đối (RLOD) trong các mẫu gây nhiễm nhân tạo (còn gọi là nghiên cứu RLOD):

- nghiên cứu mục tiêu/loại trừ của phương pháp thay thế.

Các kết quả (trong các bảng và các phép tính) của các phần khác nhau và việc giải thích kết quả, bao gồm các kết quả khác nhau, phải được nêu trong báo cáo nghiên cứu.

Cỡ phần mẫu thử phải được nêu rõ trong phương pháp chuẩn.

5.1.2  Nghiên cứu cặp đôi hoặc không cặp đôi

Các phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế phải được thực hiện chính xác trên cùng một mẫu (cùng một phần mẫu thử) càng nhiều càng tốt. Tuy nhiên, có sự phân biệt giữa các nghiên cứu, sử dụng cùng một phần mẫu thử cho cả phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế, vì cả hai phương pháp đều có cùng bước đầu tiên trong quy trình (tăng sinh), và cần sử dụng các phần mẫu thử khác nhau cho phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế (ví dụ: do canh thang tăng sinh khác nhau). Trong trường hợp cả hai phương pháp đều sử dụng cùng một phần mẫu thử, các kết quả của hai phương pháp này sẽ có liên quan nhiều đến nhau. Ví dụ, khi mẫu không bị nhiễm, cả hai phương pháp đều cho kết quả mẫu âm tính. Do mối quan hệ này, mà dữ liệu thu được từ phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế được gọi là cặp đôi hoặc thích hợp. Trong tiêu chuẩn này, cụm từ “nghiên cứu cặp đôi” sẽ được sử dụng cho loại hình nghiên cứu này.

Tình huống ngược lại, cũng có thể không có bước ban đầu (tăng sinh) giống nhau cho cả phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế. Trong trường hợp này, cần sử dụng các phần mẫu thử khác nhau từ cùng lô hàng hoặc mẻ sản phẩm cho cả hai phương pháp và dữ liệu kết quả thu được gọi là không cặp đôi hoặc không so sánh. Trong tiêu chuẩn này, cụm từ “nghiên cứu không cặp đôi” được sử dụng cho loại hình nghiên cứu này. Việc chọn nghiên cứu cặp đôi hoặc không cặp đôi phụ thuộc vào các quy trình của phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế. Nếu có bước ban đầu trong cách tiến hành (tăng sinh) thì thiết kế nghiên cứu cặp đôi là bắt buộc.

Điều này mô tả nghiên cứu so sánh phương pháp nếu phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế có bước ban đầu chung trong cách tiến hành (tăng sinh) (nghiên cứu cặp đôi) và nếu phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế không có bước ban đầu chung (nghiên cứu không cặp đôi). Sự khác biệt giữa cả hai loại nghiên cứu được chỉ ra trong phần nội dung khi thích hợp.

5.1.3  Nghiên cứu độ đáp ứng

Nghiên cứu độ đáp ứng nhằm xác định chênh lệch độ đáp ứng giữa phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế. Nghiên cứu này được tiến hành sử dụng mẫu nhiễm tự nhiên và/hoặc nhân tạo. Các nhóm và các kiểu/loại khác nhau phải được kiểm tra về điều này. Giới hạn chấp nhận được xác định về sự chênh lệch tối đa có thể chấp nhận được tùy thuộc vào loại hình nghiên cứu (cặp đôi/không cặp đôi) và số lượng nhóm được thử nghiệm.

5.1.3.1  Chọn các nhóm để thử nghiệm

Việc chọn nhóm và kiểu/loại sử dụng trong xác nhận giá trị sử dụng sẽ phụ thuộc vào loại hoặc nhóm vi sinh vật và phạm vi xác nhận.

Nếu phương pháp được áp dụng cho nhiều loại thực phẩm thì phải nghiên cứu ít nhất 5 nhóm thực phẩm. Báo cáo nghiên cứu xác nhận phải nêu rõ các nhóm thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu. Nếu phương pháp cần xác nhận đối với một số có hạn các nhóm thực phẩm, ví dụ: “các sản phẩm thịt ăn ngay, sản phẩm thịt cần đun lại trước khi ăn” và “sữa chế biến nhiệt và các sản phẩm sữa”, thì chỉ những nhóm này được nghiên cứu. Ngoài thực phẩm, mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu môi trường, và mẫu giai đoạn sản xuất ban đầu có thể được đưa vào làm các nhóm bổ sung. Điều này sẽ mở rộng việc áp dụng phương pháp thay thế cho các nhóm bổ sung này.

Đối với tất cả các nhóm được chọn (thực phẩm và các sản phẩm khác), ít nhất phải nghiên cứu ba loại khác nhau cho mỗi nhóm. Phụ lục A trình bày tổng quan về các nhóm và kiểu/loại có liên quan với các vi sinh vật đặc trưng có thể có liên quan đến việc xác nhận. Phụ lục A cần được sử dụng để tạo điều kiện cho việc chọn các nhóm, kiểu/loại và các sản phẩm và vi sinh vật đặc trưng. Điều này không phải là việc chọn bắt buộc.

Khi chọn mẫu cho nghiên cứu, ưu tiên cao nhất là tìm những mẫu bị nhiễm tự nhiên. Nếu không thể có được đủ số mẫu bị nhiễm tự nhiên thì cho phép sử dụng mẫu nhiễm nhân tạo (xem Phụ lục B và Phụ lục C). Chi tiết về việc chuẩn bị mẫu đã nuôi cấy nhân tạo phải được nêu trong báo cáo nghiên cứu xác nhận. Tốt nhất là các mẫu thực phẩm thu được từ dải phân bố càng rộng càng tốt để giảm mọi sai lệch do mẫu cục bộ và mở rộng phạm vi xác nhận.

Phải bảo đảm rằng với việc chọn các kiểu/loại khác nhau, cả hệ vi khuẩn nền cao và thấp (tự nhiên), các loại ức chế (stress) khác nhau do chế biến và nguyên liệu thô (chưa chế biến) đều được đưa vào nghiên cứu.

VÍ DỤ: Để xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phát hiện Listeria monocytogene và nhóm “các sản phẩm thịt ăn ngay, sản phẩm thịt xử lý nhiệt trước khi ăn”, các loại sản phẩm có thể là (1) các sản phẩm thịt đã nấu chín (hệ vi khuẩn nền thấp, ức chế nhiệt), (2) các sản phẩm thịt lên men hoặc sấy khô (hệ vi khuẩn cao, ức chế pH) và (3) sản phẩm đã xử lý (hun khói) [a_w<0,92] (hệ vi khuẩn nền trung bình, ức chế a_w).

Ví dụ, trong một số trường hợp, đối với phương pháp thay thế áp dụng cho nhiều loại thực phẩm, có thể kết hợp các nhóm “ăn ngay” và “nguyên liệu” từ cùng một nhóm sản phẩm. Ví dụ, các nhóm thịt nguyên liệu và thịt ăn ngay (sản phẩm) có thể được gộp vào một nhóm có ba loại chia ra các loại thực phẩm ăn ngay và nguyên liệu. Việc chọn nhóm thực phẩm (kết hợp) phải dựa trên phân tích nguy cơ.

5.1.3.2  Số lượng mẫu

Đối với mỗi nhóm cần kiểm tra, phải kiểm tra tối thiểu 60 mẫu đơn lẻ, ít nhất là ba loại với ít nhất 20 mẫu đại diện cho mỗi loại (ba loại x 20 mẫu cho mỗi loại = 60 mẫu). Phải có được phần kết quả phân tích dương tính bằng phương pháp chuẩn hoặc phương pháp thay thế (nghĩa là không phải là tất cả các mẫu đều dương tính hoặc âm tính) cho mỗi loại được kiểm tra. Trong tình huống lý tưởng, mỗi loại thử nghiệm có 10 mẫu (50 %) dương tính và 10 mẫu âm tính, nhưng nên nằm trong khoảng từ 25 % đến 75 %. Đối với mỗi nhóm, ít nhất 30 mẫu phải cho kết quả dương tính bằng phương pháp chuẩn và/hoặc phương pháp thay thế.

5.1.3.3  Kết quả của phương pháp thay thế và khẳng định

Nhiều quy trình của phương pháp thay thế gồm hai bước, bước đầu tiên là bước tăng sinh, phát hiện và bước thứ hai là khẳng định kết quả phát hiện từ bước một. Kết quả cuối cùng của phương pháp thay thế là kết quả thu được sau bước hai. Kết quả cuối cùng sẽ giống như kết quả sau khi tăng sinh và phát hiện trong trường hợp không có bước xác nhận trong quy trình phương pháp thay thế.

Kết quả (cuối cùng) của phương pháp thay thế phải khẳng định được phần nghiên cứu độ đáp ứng. Tất cả các kết quả thu được bằng phương pháp thay thế trong nghiên cứu không cặp đôi phải được khẳng định. Trong nghiên cứu cặp đôi, chỉ các kết quả dương thu được bằng phương pháp thay thế, tương ứng với kết quả của phương pháp chuẩn là âm tính, thì phải được khẳng định. Việc khẳng định này cần để xác định liệu kết quả có phải là dương tính thực hay dương tính giả. Phép thử khẳng định hoặc các phép thử phải có khả năng phục hồi và khẳng định việc nhận dạng của chủng phân lập là đích của phương pháp. Các phép thử này có thể được dựa trên quy trình khẳng định của phương pháp chuẩn, bước khẳng định của phương pháp thay thế trong trường hợp này có thể phân lập và khẳng định việc nhận dạng của chủng đích, sự kết hợp của cả hai hoặc bất kỳ quy trình nào khác có thể phân lập và khẳng định sự nhận dạng của chủng đích.

Nếu bước tăng sinh của các phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế khác nhau về số lần tăng sinh (nghĩa là: bước đầu/không chọn lọc và bước thứ hai/có chọn lọc) hoặc tổng thời gian ủ ấm, cần có cách khẳng định bổ sung cho nghiên cứu xác nhận. Cách thứ nhất phải được sử dụng với phương pháp thay thế theo đúng quy trình/hướng dẫn của nó (điều kiện kiểm tra thông thường bằng phương pháp thay thế theo quy trình đi kèm bộ thử, việc này không bao gồm các các phép thử bổ sung mà có thể được thực hiện trong quá trình nghiên cứu xác nhận). Cách thứ hai phải chuyển phần nuôi cấy tăng sinh của phương pháp thay thế sang phần tương ứng của phương pháp chuẩn sao cho giảm thiểu tổng thời gian ủ ấm của bước tăng sinh của phương pháp chuẩn được dự kiến. Kết quả của hai cách khẳng định phải được báo cáo riêng rẽ.

5.1.3.4  Tính và diễn giải độ đáp ứng

Nhìn chung, dữ liệu phải được nêu trong báo cáo để có tổng quan về các dữ liệu thô thu được. Thông tin phải được nêu rõ cho loại nhiễm (nhiễm tự nhiên hoặc gây nhiễm nhân tạo) của các mẫu được sử dụng, loại thiết kế nghiên cứu đã được sử dụng (ví dụ: nghiên cứu cặp đôi hoặc nghiên cứu không cặp đôi) và các phép thử khẳng định được sử dụng để khẳng định kết quả của phương pháp thay thế. Đối với các mẫu gây nhiễm nhân tạo, quy trình (tham khảo) sử dụng để chuẩn bị phải được quy định (xem thêm Phụ lục C).

Các kết quả thu được đối với các phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế có nguồn gốc từ cùng một mẫu, có nghĩa là từ một phần mẫu thử trong trường hợp nghiên cứu cặp đôi hoặc hai phần mẫu thử trong trường hợp nghiên cứu không cặp đôi, phải được nêu cụ thể đối với nghiên cứu cặp đôi theo Bảng 1 và nghiên cứu không cặp đôi theo Bảng 2. Bảng 3 được chuẩn bị cho các kết quả mẫu tổng hợp cho tất cả các loại của nhóm (≥ 60 mẫu) và cho mỗi loại (≥ 20 mẫu) đối với nghiên cứu cặp đôi và không cặp đôi.

Bảng 1 - So sánh và giải thích các kết quả mẫu giữa phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế cho nghiên cứu cặp đôi

Bảng 2 - So sánh và diễn giải các kết quả mẫu giữa các phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế đối với nghiên cứu không cặp đôi

Bảng 3 - Tóm tắt các kết quả thu được bằng phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế của tất cả các mẫu đối với từng nhóm

Dựa trên dữ liệu thống kê trong Bảng 3 đối với các nhóm kết hợp theo nhóm và theo kiểu/loại, tính giá trị độ đáp ứng của phương pháp thay thế (1) và của phương pháp chuẩn (2) độ đúng tương đối (3) và tỷ số dương tính giả đối với phương pháp thay thế sau khi khẳng định thêm các kết quả (4) như sau:

Độ đáp ứng của phương pháp thay thế:              (1)

Độ đáp ứng của phương pháp chuẩn:                 (2)

Độ đúng tương đối:                                                       (3)

Tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp thay thế:               (4)

Trong đó: N là số lượng mẫu tổng số (NA + PA + PD + ND) và FP là các kết quả dương tính giả. Các phần giải thích từ viết tắt được sử dụng, xem Bảng 1 đến Bảng 3.

Các kết quả của phương pháp thay thế đã khẳng định phải được sử dụng để xác định xem có tương thích với kết quả của phương pháp chuẩn hay không.

Tính chênh lệch giữa (ND - PD) đối với cả nghiên cứu cặp đôi và không cặp đôi và tổng của (ND + PD) đối với các nghiên cứu cặp đôi. Kiểm tra xem chênh lệch và/hoặc tổng của PD và ND phù hợp với giới hạn chấp nhận (AL) trong Bảng 4 đối với loại nghiên cứu (cặp đôi và không cặp đôi) hay không và số lượng nhóm được sử dụng trong đánh giá.

CHÚ THÍCH: Giới hạn chấp nhận (AL) được dựa trên dữ liệu và sự thống nhất của chuyên gia. AL không dựa trên phân tích thống kê dữ liệu.

Việc diễn giải các kết quả phải được thực hiện theo từng nhóm và đối với tất cả các nhóm được sử dụng trong nghiên cứu xác nhận. Việc diễn giải các kết quả cũng phải thực hiện theo từng cách tăng sinh trong trường hợp các quy trình khác nhau được sử dụng cho các loại mẫu khác nhau. AL không đáp ứng khi giá trị quan sát được cao hơn AL. Khi AL không đáp ứng thì tiến hành điều tra (ví dụ: phân tích nguyên nhân gốc) để diễn giải các kết quả quan sát được. Dựa vào AL và thông tin bổ sung, quyết định xem phương pháp thay thế có được coi là không phù hợp với mục đích đối với nhóm hoặc các nhóm có liên quan hay không. Các lý do chấp nhận phương pháp thay thế trong trường hợp AL không đạt yêu cầu phải được nêu rõ trong báo cáo nghiên cứu.

Bảng 4 - Các thông số giới hạn chấp nhận và các giá trị đối với thiết kế nghiên cứu cặp đôi và không cặp đôi liên quan đến số lượng nhóm được sử dụng

CHÚ THÍCH: Thông tin về sự khác biệt quan sát được giữa các kết quả của phương pháp thay thế trước và sau khẳng định kết quả (bước 1 và bước 2) theo phương pháp thay thế cần được nêu trong báo cáo xác nhận giá trị sử đụng như thông tin bổ sung, nhưng không được sử dụng trong đánh giá tổng thể hiệu năng của phương pháp thay thế.

5.1.4  Mức phát hiện tương đối của nghiên cứu

Nghiên cứu so sánh được tiến hành để đánh giá mức phát hiện (LOD) của phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn. Việc đánh giá được dựa trên việc tính mức phát hiện tương đối (RLOD). Trong nghiên cứu này, sử dụng lặp lại các mẫu nhiễm nhân tạo ở ba mức nhiễm hoặc nhiều mức nhiễm hơn. Tốt nhất là các mức đã biết để tính LOD. Tuy nhiên điều này là không bắt buộc.

5.1.4.1  Chọn nhóm, số lượng mẫu và phép thử lặp lại

Đối với việc chọn nhóm và kiểu/loại, xem 5.1.3.1. Sử dụng cùng các nhóm như được chọn cho nghiên cứu độ đáp ứng (xem 5.1.3). Đối với mỗi nhóm, chọn một loại có liên quan. Để tính đại diện cao hơn cho nhóm được đánh giá, kiểu/loại này nên khác với loại dùng trong nghiên cứu độ đáp ứng (nếu có thể). Các mẫu phải được nuôi cấy nhân tạo. Các quy trình chuẩn bị mẫu nuôi cấy nhân tạo được nêu trong Phụ lục C. Mỗi kiểu/loại được nuôi cấy với một chủng khác.

Chuẩn bị tối thiểu ba mức cho mỗi loại bao gồm ít nhất một mức kiểm chứng âm, một mức thấp và cấp mức cao hơn. Tốt nhất, mức thấp là mức phát hiện lý thuyết (tức là 0,7 cfu/phần mẫu thử) và mức cao hơn là mức chỉ trên mức phát hiện lý thuyết (ví dụ: 1 cfu đến 1,5 cfu/phần mẫu thử). Ít nhất mức thấp cần có độ phục hồi từng phần theo phương pháp chuẩn (độ phục hồi từng phần ở mức thấp cần trong khoảng từ 25 % đến 75 % số mẫu được kiểm tra). Cần ước tính mức độ nhiễm (trừ kiểm chứng âm). Ở mức kiểm chứng âm, cần kiểm tra ít nhất năm mẫu lặp lại bằng cả hai phương pháp. Đối với mức thứ hai (thấp) (mức phát hiện lý thuyết), cần kiểm tra ít nhất 20 mẫu lặp lại và ở mức thứ ba (cao hơn), phải kiểm tra ít nhất 5 mẫu lặp lại theo cả hai phương pháp. Mức kiểm chứng âm không được cho kết quả dương tính. Khi thu được các kết quả dương tính, cần lặp lại các thực nghiệm cho tất cả các mức.

Các kết quả thử nghiệm sai lệch dương thu được bằng phương pháp thay thế phải được khẳng định thêm (xem 5.1.3.3). RLOD phải được đánh giá sau khi khẳng định.

CHÚ THÍCH 1: Để có được sự bảo đảm tốt hơn cho việc phục hồi từng phần, có thể tạo và thử nghiệm nhiều mức nhiễm hơn.

CHÚ THÍCH 2: Cần có mức nhiễm đối với LOD của phương pháp chuẩn nếu phương pháp thay thế có LOD tháp hơn phương pháp chuẩn.

5.1.4.2  Tính và diễn giải RLOD

RLOD được xác định là tỷ số của các LOD của phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn:

                                                                       (5)

Đối với mỗi nhóm, ít nhất các RLOD phải được ước tính bằng cách lắp mô hình bổ sung-log-log (CLL) vào, kết hợp dữ liệu có mặt/không có mặt của cả hai phương pháp. Các mức nhiễm không cần tính toán RLOD vì chúng đã bao gồm trong mô hình kết quả các đường đồ thị xác suất phát hiện so với liều log (mức nhiễm). Mô hình thống kê và các phép tính được nêu trong Phụ lục D. Các phép tính có thể được thực hiện với các bảng Excel^®1) của tiêu chuẩn này. Bảng tính Excel^® để tính các giá trị RLOD có sẵn để tải về miễn phí tại http://standards.iso.org/iso/16140 và sau đó chọn tệp RLOD. Đối với các phép tính sử dụng bảng tính Excel^® này, phải chọn “chưa biết nồng độ”. Tính RLOD_i cho mỗi hạng mục thứ i. Tóm lại kết quả được nêu trong Bảng 5.

Bảng 5 - Trình bày RLOD trước và sau khi khẳng định các kết quả của phương pháp thay thế

Giới hạn chấp nhận (AL) đối với RLOD dựa trên các kết quả của phương pháp thay thế đã khẳng định quy định mức tăng tối đa LOD của phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn không được coi là có liên quan trong việc xem xét tính phù hợp cho mục đích của phương pháp. Do đó, giá trị AL sẽ > 1. Cần diễn giải cho từng hạng mục.

AL đối với dữ liệu nghiên cứu cặp đôi được thiết lập ở mức 1,5, nghĩa là LOD đối với phương pháp thay thế không được cao hơn 1,5 lần LOD của phương pháp chuẩn. Giá trị LOD đối với phương pháp thay thế nhỏ hơn giá trị LOD của phương pháp chuẩn luôn được chấp nhận vì điều này có nghĩa là phương pháp thay thế có khả năng phát hiện ra mức nhiễm thấp hơn so với phương pháp chuẩn.

AL đối với dữ liệu nghiên cứu không cặp đôi ở mức 2,5, nghĩa là LOD đối với phương pháp thay thế không được cao hơn 2,5 lần LOD của phương pháp chuẩn. Giá trị LOD đối với phương pháp thay thế nhỏ hơn giá trị LOD đối với phương pháp chuẩn luôn được chấp nhận vì điều này có nghĩa là phương pháp thay thế có khả năng phát hiện ra mức nhiễm thấp hơn so với phương pháp chuẩn.

AL không được đáp ứng khi giá trị quan sát được cao hơn AL. Khi AL không đáp ứng, cần tiến hành điều tra (ví dụ: phân tích nguyên nhân gốc) để giải thích về các kết quả quan sát được. Dựa trên AL và thông tin bổ sung, quyết định xem phương pháp thay thế có được coi là không phù hợp với mục đích của nhóm hoặc kiểu/loại có liên quan cần nghiên cứu hay không. Các lý do chấp nhận phương pháp thay thế trong trường hợp AL không đáp ứng phải được nêu trong báo cáo nghiên cứu.

Ngoài việc tính RLOD, dữ liệu có thể được đánh giá sử dụng mô hình xác suất phát hiện (POD) của AOAC nêu trong Tài liệu tham khảo [14] và có trong các hướng dẫn xác nhận giá trị sử dụng của AOAC^[6]. Việc đánh giá sử dụng mô hình POD có thể cung cấp thêm thông tin về sự tương đương của các phương pháp.

5.1.5  Nghiên cứu mục tiêu và loại trừ

5.1.5.1  Chọn và số lượng các chủng

Cần sử dụng một loạt các chủng. Các tiêu chí chọn các chủng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục E. Các chủng được sử dụng cần được tính đến nguyên tắc đo của phương pháp thay thế (ví dụ: dựa vào dịch cấy, dựa trên thử nghiệm miễn dịch và phân tử). Các nguyên tắc đo khác nhau có thể cần sử dụng các bảng thử nghiệm các chủng khác nhau.

Mỗi chủng được sử dụng phải được mô tả các đặc tính sinh hóa và/hoặc huyết thanh học và/hoặc biến đổi di truyền với đầy đủ chi tiết để nhận dạng đã biết, cần ưu tiên sử dụng các chủng phân lập từ thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, môi trường chế biến thực phẩm hoặc sản xuất ban đầu có tính đến phạm vi xác nhận. Tuy nhiên, có thể sử dụng các chủng của bộ sưu tập chủng phân lập từ bệnh viện và môi trường. Cần biết nguồn gốc của tất cả các chủng và được lưu giữ nội bộ (ví dụ: phòng thử nghiệm chuyên ngành), bộ sưu tập chủng cấy của quốc gia hoặc quốc tế có thể được sử dụng trong tương lai, nếu cần.

Đối với phép thử mục tiêu, phải thử nghiệm ít nhất 50 mẫu thuần của vi sinh vật (đích). Với thử nghiệm mục tiêu của các phương pháp xác định Salmonella, phải thử nghiệm ít nhất 100 chủng thuần của các typ huyết thanh khác nhau của Salmonella.

Đối với phép thử loại trừ, phải thử nghiệm ít nhất 30 chủng thuần vi sinh vật (không phải đích).

Một số vi sinh vật sẽ khó hoặc không thể nuôi cấy như virus hoặc đơn bào ký sinh. Trường hợp sinh vật đích không thể nuôi cấy được, cần sử dụng các huyền phù thuần các chủng thử nghiệm bổ sung ở bước thích hợp sớm nhất của phương pháp.

CHÚ THÍCH 1: Đối với một số vi sinh vật, sẽ rất khó để thu được số lượng chủng yêu cầu đối với các phép thử mục tiêu và phép thử loại trừ. Trong những trường hợp này, các bên tham gia nghiên cứu xác nhận phải thống nhất chọn một bộ chủng thử nghiệm.

CHÚ THÍCH 2: Các hướng dẫn bảo quản và duy trì các chủng trong các bộ sưu tập (nội bộ) có thể có trong TCVN 8128 (ISO 11133)^[2].

5.1.5.2  Nuôi cấy các chủng đích (mục tiêu)

Mỗi phép thử được thực hiện một lần và chỉ với phương pháp thay thế (bao gồm cả bước khẳng định nếu được quy định trong quy trình của phương pháp thay thế). Nuôi cấy dịch pha loãng của từng chủng thử nghiệm thuần trong môi trường phát triển thích hợp. Chủng cấy này được sử dụng cho phép thử mục tiêu. Không thêm mẫu.

Chủng cấy thuần trong canh thang không chọn lọc cần được phát triển trong điều kiện tối ưu để có được mật độ tế bào cao trong pha tĩnh. Mức nồng độ của chủng cấy phải cao gấp 10 lần đến 100 lần so với mức phát hiện tối thiểu của phương pháp thay thế đang được xác nhận giá trị sử dụng và phải tiến hành tất cả các bước (tăng sinh) đã được chi tiết trong hướng dẫn của phương pháp thay thế. Nếu phương pháp thay thế có nhiều hơn một bước (tăng sinh) hướng dẫn (ví dụ: đối với các loại mẫu khác nhau), khi đó sử dụng một bước nghiêm ngặt nhất (khó khăn nhất) cho toàn bộ các chủng thử nghiệm. Khi thu được các kết quả nghi ngờ hoặc âm tính, cần lặp lại thử nghiệm với phương pháp chuẩn thì cần kiểm tra xem có thể phát hiện được với phương pháp chuẩn thích hợp hay không. Nếu kết quả là âm tính, có thể phải xem xét để lặp lại phép thử với mặt hàng thực phẩm bổ sung. Nếu phương pháp thay thế có cả bước khẳng định thì các phép thử khẳng định phải bao gồm trong thử nghiệm các chủng được chọn.

5.1.5.3  Nuôi cấy các chủng không phải đích (loại trừ)

Mỗi phép thử được thực hiện một lần và chỉ với phương pháp thay thế (bao gồm cả bước khẳng định nếu được quy định trong quy trình phương pháp thay thế). Nuôi cấy dịch pha loãng của từng chủng thử nghiệm thuần trong môi trường phát triển thích hợp. Chủng cấy này được sử dụng cho phép thử loại trừ. Không thêm mẫu.

Chủng thuần cần cấy trong canh thang không chọn lọc phải được phát triển trong các điều kiện tối ưu để cho mật độ tế bào cao trong pha tĩnh. Nếu phương pháp này có bước phát triển trong môi trường chọn lọc trước bước phát hiện thì với các mục đích thử nghiệm loại trừ, cần thay môi trường chọn lọc bằng môi trường không chọn lọc. Nếu phương pháp thay thế cho kết quả nghi ngờ hoặc dương tính thì lặp lại phép thử sử dụng hướng dẫn hoàn chỉnh (tăng sinh) của phương pháp thay thế, tiến hành tăng sinh chọn lọc nếu được nêu trong hướng dẫn. Nếu phương pháp thay thế bao gồm nhiều hơn một bước tăng sinh (ví dụ: đối với nhiều loại mẫu khác nhau) thì mỗi bước cần sử dụng tất cả các chủng thử nghiệm. Ngoài ra, nên sử dụng phương pháp chuẩn để kiểm tra các chủng không thể phát hiện được bằng phương pháp chuẩn.

5.1.5.4  Biểu thị và diễn giải kết quả

Các kết quả được nêu trong Bảng 6. Phòng thử nghiệm tham gia nghiên cứu so sánh phương pháp có trách nhiệm diễn giải kết quả. Báo cáo phải nêu rõ mọi bất thường so với kết quả dự kiến.

Bảng 6 - Trình bày các kết quả của phép thử mục tiêu và loại trừ

5.2  Nghiên cứu liên phòng

5.2.1  Xem xét chung

Mục đích của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm là xác định chênh lệch về độ đáp ứng giữa phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế khi được thử nghiệm bởi các cộng tác viên khác nhau sử dụng các mẫu giống nhau (điều kiện tái lập). Các điều kiện để tiến hành nghiên cứu liên phòng thử nghiệm cần phản ánh càng nhiều càng tốt các điều kiện thưởng được các phòng thử nghiệm riêng rẽ sử dụng để đạt được điều kiện tái lập. Sự khác biệt giữa các nghiên cứu cặp đôi và không cặp đôi được nêu rõ trong văn bản. Tuy nhiên, không đưa ra các mục riêng ảnh hưởng đối với quy trình đo và phân tích dữ liệu bị hạn chế. Nghiên cứu liên phòng được phòng thử nghiệm tổ chức quản lý.

Các kết quả (các bảng và các phép tính) của các phần khác nhau và việc giải thích các kết quả, bao gồm các kết quả khác nhau, phải được nêu trong báo cáo nghiên cứu.

5.2.2  Quy trình đo

Nghiên cứu liên phòng phải tạo ra ít nhất 10 bộ dữ liệu hợp lệ từ ít nhất 10 cộng tác viên. Các cộng tác viên phải đến từ tối thiểu năm tổ chức khác nhau, nhưng tốt nhất là 10 tổ chức không bao gồm phòng thử nghiệm tổ chức. Tối đa có thể có ba bộ dữ liệu từ một tổ chức. Các kỹ thuật viên tham gia chuẩn bị mẫu để dùng trong nghiên cứu liên phòng sẽ không tham gia vào thử nghiệm các mẫu này trong nghiên cứu liên phòng.

CHÚ THÍCH: Các phòng thử nghiệm ở các địa điểm khác nhau, nhưng thuộc một công ty hoặc viện nghiên cứu, thì được chấp nhận là các tổ chức khác nhau.

Quy trình như sau:

- trong trường hợp đối với phương pháp thay thế có các quy trình khác nhau (tăng sinh), phải chọn một quy trình (tăng sinh), ví dụ: quy trình có thời gian ủ ấm ngắn nhất hoặc điều kiện chọn lọc tốt nhất. Sản phẩm đã chọn phải phù hợp với quy trình được chọn. Việc này (để chọn xem Phụ lục A) được sử dụng để chuẩn bị các mẫu thử cần có hệ vi khuẩn nền tự nhiên;

- mẫu thử này phải được cấy vi sinh vật đích. Quy trình cấy mẫu phải phù hợp với sản phẩm đã chọn. Các mẫu thử phải do phòng thử nghiệm tổ chức chuẩn bị để đảm bảo sự đồng nhất giữa các mẫu sử dụng các quy trình chuẩn bị có trong Phụ lục B và Phụ lục C;

- phải sử dụng ít nhất 3 mức nhiễm khác nhau: kiểm chứng âm (L₀) và hai mức (L₁ và L₂). Ít nhất một trong số này sẽ cho các kết quả dương tính từng phần. Mức nhiễm cần thiết để thu được độ phục hồi từng phần phải dựa trên số liệu nghiên cứu RLOD của phương pháp chuẩn trong nghiên cứu so sánh phương pháp. Theo lý thuyết, mức độ nhiễm trung bình 1 cfu/mẫu là đủ để thu được độ phục hồi từng phần;

- mỗi cộng tác viên phân tích ít nhất 8 mẫu mù lặp lại ở mỗi mức nhiễm theo cả hai phương pháp, vì vậy tổng cộng tối thiểu là 48 kết quả (8 lần lặp lại x 3 mức x hai phương pháp) cho mỗi cộng tác viên;

- đối với các phép thử cho kết quả cặp đôi [kết quả cặp đôi xảy ra khi bước ban đầu (tăng sinh) là giống nhau đối với phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế], cần có một mẫu để thu được một kết quả đối với phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn. Đối với phép thử cho kết quả không cặp đôi [kết quả không cặp đôi xảy ra khi các phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn bắt đầu từ các bước ban đầu (tăng sinh) khác nhau], cần đến các phần mẫu thử khác nhau từ cùng một mẫu. Một phần mẫu thử được phân tích bằng phương pháp thay thế và một phần mẫu thử khác được phân tích bằng phương pháp chuẩn;

- dữ liệu được báo cáo trong hai bảng, bảng đầu tiên cho các kết quả thu được bằng phương pháp chuẩn và bảng thứ hai cho các kết quả thu được bằng phương pháp thay thế trước và sau khi khẳng định kết quả. Nếu kết quả của phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn thu được từ cùng một canh thang (tăng sinh) ban đầu (dữ liệu cặp đôi) thì việc khẳng định phương pháp chuẩn cũng khẳng định được phương pháp thay thế. Trong các trường hợp phương pháp chuẩn cho kết quả âm tính và phương pháp thay thế cho kết quả dương tính, cần khẳng định lại kết quả dương tính. Nếu kết quả của phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn thu được từ các bước (tăng sinh) khác nhau (không cặp đôi) thì tất cả các kết quả thu được bằng phương pháp thay thế phải khẳng định. Quy trình khẳng định phải bao gồm trong quy trình nghiên cứu và phải có thể thu hồi và khẳng định việc nhận biết của chủng phân lập đúng là đích của phương pháp;

- phòng thử nghiệm tổ chức phải giữ lại canh thang, các đĩa môi trường và/hoặc các chủng phân lập trong một khoảng thời gian nhất định để có thể khẳng định kết quả thu được của cộng tác viên, nếu cần;

- mỗi cộng tác viên phải thực hiện phân tích mẫu vào đúng thời gian quy định;

- trong cả hai trường hợp, việc kết hợp “số mức nhiễm/số phân tích lặp lại/số cộng tác viên không hợp lệ” sẽ được chọn sao cho thu được ít nhất 480 kết quả (240 cho mỗi phương pháp) sử dụng để tính toán cho mỗi phương pháp.

Phòng thử nghiệm tổ chức sử dụng tất cả các dữ liệu ghi lại để xác định kết quả phù hợp sử dụng trong việc phân tích dữ liệu. Phòng thử nghiệm tổ chức phải kiểm tra dữ liệu thô và thông tin cần thiết khác trong bảng dữ liệu để đảm bảo rằng tất cả các cộng tác viên đã thực hiện phân tích bằng phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn như đã lập thành văn bản. Khi có bằng chứng cho thấy kết quả có thể đạt được trong các điều kiện không thích hợp và/hoặc các phương pháp không được tuân thủ nghiêm ngặt thì tất cả hoặc tất cả các kết quả từ cộng tác viên đều bị loại ra để phân tích tiếp.

Khi nghiên cứu liên phòng thử nghiệm kết thúc, tất cả các thông tin về bảng dữ liệu và kết quả phải được chuyển đến phòng thử nghiệm tổ chức và kiểm tra như sau:

- bỏ qua dữ liệu của các cộng tác viên nếu điều kiện và thời gian vận chuyển nằm ngoài giới hạn cho phép (các giới hạn về thời gian và nhiệt độ vận chuyển phải được quy định trước khi vận chuyển mẫu);

- bỏ qua dữ liệu của các cộng tác viên nhận được mẫu/bộ thử nghiệm v.v... đã bị hư hỏng trong quá trình vận chuyển;

- bỏ qua dữ liệu của các cộng tác viên sử dụng công thức môi trường nuôi cấy không phù hợp với phương pháp (chuẩn);

- bỏ qua dữ liệu của các cộng tác viên nếu các câu hỏi cho thấy rằng phòng thử nghiệm đã thực hiện lệch khỏi quy trình chuẩn hoặc các điều kiện thử nghiệm quyết định.

5.2.3  Tính toán và tóm tắt dữ liệu

Kết quả thu được từ các cộng tác viên độc lập trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được tóm tắt trong Bảng 7 và trong Bảng 8.

Bảng 7 - Kết quả dương tính bằng phương pháp chuẩn

Bảng 8 - Các kết quả dương tính (trước và sau khẳng định) bằng phương pháp thay thế

Tính phần trăm độ đặc hiệu (SP) của phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế, sử dụng dữ liệu sau khi khẳng định, dựa trên các kết quả của mức L₀ như sau:

Độ đặc hiệu của phương pháp chuẩn:

                                              (6)

Độ đặc hiệu của phương pháp thay thế:

                                            (7)

Trong đó:

N_- là số phép thử L₀;

P₀ là tổng số lượng kết quả dương tính giả thu được với các mẫu trắng trước khi khẳng định;

CP₀ là tổng số kết quả dương tính giả thu được với các mẫu trắng.

Đối với mỗi mức L₁ và L₂, kết quả của tất cả các cộng tác viên được nêu trong Bảng 9 đối với thiết kế nghiên cứu cặp đôi và trong Bảng 10 đối với thiết kế nghiên cứu không cặp đôi. Bảng 11 được chuẩn bị cho các dữ liệu tổng hợp từ tất cả các cộng tác viên đối với nghiên cứu cặp đôi và không cặp đôi.

Bảng 9 - Kết quả tóm tắt của tất cả cộng tác viên về nghiên cứu cặp đôi

Bảng 10 - Tóm tắt các kết quả của tất cả các cộng tác viên về nghiên cứu không cặp đôi

Bảng 11 - Thống kê các kết quả đối với tất cả các cộng tác viên thu được với phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế với mức L₁ hoặc L₂

Dựa trên dữ liệu thống kê trong Bảng 11, tính giá trị độ đáp ứng của phương pháp thay thế (8) và của phương pháp chuẩn (9), độ đúng tương đối (10) và tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp thay thế sau khi khẳng định thêm các kết quả (4) như sau:

Độ đáp ứng của phương pháp chuẩn:                 (8)

Độ đáp ứng của phương pháp chuẩn:                 (9)

Độ đúng tương đối:                                                       (10)

Tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp thay thế:               (11)

Trong đó: N là tổng số mẫu (NA + PA + PD + ND) và FP là các kết quả dương tính giả. Các phần giải thích từ viết tắt được sử dụng, xem Bảng 9, Bảng 10 và Bảng 11.

Các kết quả của phương pháp thay thế đã khẳng định phải được sử dụng để xác định xem kết quả của phương pháp thay thế có tương thích với kết quả của phương pháp chuẩn hay không.

5.2.4  Giải thích dữ liệu

5.2.4.1  Nghiên cứu cặp đôi

Đối với nghiên cứu cặp đôi, tính chênh lệch giữa (ND - PD) và tổng của (ND + PD) đối với mức có độ thu hồi từng phần (L₁ và có thể L₂). Các giá trị tìm thấy đối với (ND - PD) và (ND + PD) không được vượt quá giới hạn chấp nhận (ALs) nêu trong Bảng 12 với số phòng thử nghiệm tham gia (N_lab).

Bảng 12 - Giới hạn chấp nhận được đối với thiết kế nghiên cứu cặp đôi liên quan đến số lượng phòng thử nghiệm hợp tác

AL không đáp ứng được khi giá trị quan sát cao hơn AL. Khi AL không đáp ứng được, cần tiến hành điều tra (ví dụ, phân tích nguyên nhân gốc) để cung cấp lời giải thích về các kết quả quan sát được. Dựa vào thông tin AL và thông tin bổ sung, quyết định xem phương pháp thay thế có được coi là không phù hợp với mục đích hay không. Các lý do chấp nhận phương pháp thay thế trong trường hợp AL không đáp ứng được thì phải được nêu trong báo cáo nghiên cứu.

5.2.4.2  Nghiên cứu không cặp đôi

Đối với nghiên cứu không cặp đôi, tính chênh lệch giữa (ND - PD) với mức thu hồi từng phần thu được (L­₁ và có thể là L­₂). Giá trị quan sát được đối với (ND - PD) không được cao hơn AL. AL được xác định là ((ND - PD)max] và được tính theo mức có độ thu hồi từng phần thu được như mô tả dưới đây sử dụng ba tham số sau:

(p+)_ref =                                                                               (12)

Trong đó:

P_x = số mẫu có kết quả dương tính thu được bằng phương pháp chuẩn ở mức x (L­₁ hoặc L­₂) đối với tất cả các phòng thử nghiệm;

N_x = số mẫu thử nghiệm ở mức x (L­₁ hoặc L­₂) thu được bằng phương pháp chuẩn của tất cả các phòng thử nghiệm.

(p+)_alt =                                                                             (13)

Trong đó:

CP_x = số mẫu có kết quả dương tính đã được khẳng định thu được bằng phương pháp thay thế ở mức x (L₁ hoặc L₂) đối với tất cả các phòng thử nghiệm;

N_x = số mẫu đã thử nghiệm ở mức x (L₁ hoặc L₂) theo phương pháp thay thế được thực hiện tại tất cả các phòng thử nghiệm.

Trong đó:

N_x = số mẫu đã thử nghiệm ở mức x [L₁ hoặc L₂) bằng phương pháp chuẩn được thực hiện tại tất cả các phòng thử nghiệm.

AL không đáp ứng được khi giá trị quan sát cao hơn AL. Khi AL không được đáp ứng, cần tiến hành điều tra (ví dụ, phân tích nguyên nhân gốc) để cung cấp lời giải thích về các kết quả quan sát được. Dựa vào thông tin AL và thông tin bổ sung, quyết định xem phương pháp thay thế có được coi là không phù hợp với mục đích hay không. Các lý do chấp nhận phương pháp thay thế khi AL không đáp ứng được phải nêu trong báo cáo nghiên cứu.

5.2.4.3  Sử dụng mức phát hiện tương đối

Ngoài ra, đối với nghiên cứu cặp đôi với cả nghiên cứu không cặp đôi, cũng cần đánh giá chênh lệch các mức phát hiện (RLOD) giữa các phòng thử nghiệm. Thực hiện việc đánh giá này theo Phụ lục E. Vì chưa đủ kinh nghiệm về diễn giải kết quả theo phương pháp này nên kết quả được sử dụng chỉ để tham khảo.

Ngoài ra, dữ liệu có thể được đánh giá sử dụng xác xuất mô hình phát hiện (POD) nêu trong Tài liệu tham khảo [14] và có trong hướng dẫn đánh giá trong tiêu chuẩn AOAC ^[6]. Đánh giá sử dụng mô hình POD có thể cho thông tin bổ sung về độ tương đương của các phương pháp.

6  Các phương pháp định lượng - Quy trình kỹ thuật về xác nhận giá trị sử dụng

6.1  Nghiên cứu so sánh phương pháp

6.1.1  Xem xét chung

Nghiên cứu so sánh phương pháp là một phần của quá trình xác nhận giá trị sử dụng được thực hiện trong phòng thử nghiệm tổ chức. Nghiên cứu này gồm có bốn phần:

- nghiên cứu so sánh các kết quả của phương pháp chuẩn với kết quả của phương pháp thay thế với nhiều thể loại mẫu bị nhiễm khác nhau (nhiễm tự nhiên và/hoặc nhiễm nhân tạo) (còn gọi là nghiên cứu độ đúng tương đối).

- nghiên cứu so sánh các kết quả của phương pháp chuẩn với kết quả của phương pháp thay thế trong các mẫu nhiễm nhân tạo, sử dụng các phép lặp lại của từng loại sản phẩm trong một nhóm. Dữ liệu được phân tích sử dụng cách tiếp cận sơ đồ độ chính xác (AP) (còn gọi là nghiên cứu AP).

- giới hạn của nghiên cứu định lượng (LOQ) của các kết quả của phương pháp thay thế trong các mẫu nhiễm nhân tạo sử dụng các phép lặp lại của từng mặt hàng sản phẩm trong một nhóm. Dữ liệu được sử dụng để tính LOQ của phương pháp thay thế. Nghiên cứu này chỉ thực hiện đối với các phương pháp công cụ (nghĩa là phương pháp không dựa trên số đếm khuẩn lạc riêng rẽ).

- nghiên cứu mục tiêu/loại trừ của phương pháp thay thế.

Các kết quả (các bảng và công thức tính) của các phần khác nhau và các diễn giải các kết quả, bao gồm các kết quả không phù hợp, phải được nêu rõ trong báo cáo nghiên cứu.

6.1.2  Nghiên cứu độ đúng tương đối

Nghiên cứu độ đúng tương đối là nghiên cứu so sánh giữa các kết quả thu được bằng phương pháp chuẩn và kết quả của phương pháp thay thế. Nghiên cứu này được thực hiện sử dụng các mẫu nhiễm tự nhiên và/hoặc nhiễm nhân tạo. Các nhóm, kiểu/loại và mặt hàng khác nhau được thử nghiệm về mục đích này.

6.1.2.1  Chọn các nhóm để sử dụng

Việc chọn các nhóm và kiểu/loại sử dụng trong xác nhận giá trị sử dụng phụ thuộc vào kiểu/loại hoặc nhóm vi sinh vật và phạm vi đánh giá.

Nếu phương pháp này được áp dụng cho nhiều loại thực phẩm thì phải nghiên cứu ít nhất 5 nhóm thực phẩm. Báo cáo nghiên cứu xác nhận phải nêu rõ các nhóm thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu. Nếu phương pháp này được xác nhận giá trị sử dụng cho một số lượng hạn chế các nhóm thực phẩm, ví dụ: “sản phẩm thịt ăn ngay, xử lý nhiệt trước khi ăn” và “sữa chế biến nhiệt và các sản phẩm sữa”, khi đó chỉ có thể nghiên cứu các nhóm này. Ngoài các nhóm thực phẩm, các mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu môi trường và mẫu trong giai đoạn sản xuất ban đầu có thể được đưa vào làm các nhóm bổ sung. Điều này sẽ mở rộng phạm vi sử dụng của phương pháp thay thế cho các nhóm bổ sung này.

Đối với tất cả các nhóm được chọn (thực phẩm và những sản phẩm khác), ít nhất phải có ba loại khác nhau cho mỗi nhóm được đưa vào nghiên cứu. Phụ lục A đưa ra tổng quan về các kiểu/loại và các nhóm liên quan cho mỗi loại vi sinh vật có thể liên quan đến việc xác nhận giá trị sử dụng. Phụ lục này cần được sử dụng để tạo điều kiện cho việc chọn các kiểu/loại và các hạng mục sản phẩm cho loại vi sinh vật có liên quan. Việc này không phải là lựa chọn bắt buộc.

Khi chọn mẫu để nghiên cứu, ưu tiên cao nhất là tìm những mẫu bị nhiễm tự nhiên. Nếu không có được đủ số mẫu nhiễm tự nhiên thì có thể dùng mẫu nhiễm nhân tạo (xem Phụ lục B và Phụ lục C). Đó là mong muốn rằng các mẫu thực phẩm đến từ dải nhiễm càng rộng càng tốt để giảm sai lệch bất kỳ so với mẫu thực phẩm cục bộ và mở rộng phạm vi xác nhận.

Cần đảm bảo rằng với việc chọn các loại nền mẫu có hệ vi khuẩn cao và thấp (tự nhiên) khác nhau, các kiểu/loại stress khác nhau do chế biến và nguyên liệu thô (chưa chế biến) được đưa vào nghiên cứu.

VÍ DỤ: Để xác nhận giá trị sử dụng phương pháp định lượng Listeria monocytogenes và nhóm thực phẩm “sản phẩm thịt ăn ngay, xử lý nhiệt trước khi ăn” các loại thực phẩm có thể là (1) các sản phẩm thịt nấu chín (hệ vi khuẩn nền thấp, ức chế nhiệt), (2) các sản phẩm thịt lên men hoặc sấy khô (hệ vi khuẩn nền cao, ức chế pH) và (3) sản phẩm đã xử lý (xông khói) (a_w < 0,92) (hệ vi khuẩn nền trung bình, a_w ức chế).

Ví dụ, trong một số trường hợp, đối với phương pháp thay thế có thể áp dụng cho nhiều loại thực phẩm, có thể kết hợp các nhóm “ăn ngay” và “nguyên liệu” từ cùng một nhóm sản phẩm. Ví dụ: các nhóm thịt nguyên liệu và sản phẩm ăn ngay vào một nhóm, có ba kiểu/loại được chia thành các loại nguyên liệu và ăn ngay. Việc chọn (kết hợp) các nhóm thực phẩm phải dựa trên phân tích nguy cơ.

6.1.2.2  Số lượng mẫu

Đối với mỗi nhóm cần được kiểm tra, tối thiểu phải thử nghiệm 15 mẫu và ít nhất phải sử dụng ba kiểu/loại trong nhóm đó. Đối với mỗi loại, phải thử nghiệm ít nhất 5 mẫu đại diện cho loại này. Điều này dẫn đến tối thiểu 15 mẫu cho mỗi nhóm đang được thử nghiệm bằng cách sử dụng tối thiểu ba loại khác nhau. Các mẫu cần nhiễm ở mức đại diện về biến thiên tự nhiên của mức nhiễm. Tất cả các mẫu kết hợp phải bao gồm phạm vi nồng độ thường thấy đối với loại vi sinh vật được sử dụng.

Một số mẫu bị nhiễm tự nhiên có thể chứa số lượng cao chất phân tích đích và điều này có thể làm khó khăn để có được dải nồng độ nhiễm yêu cầu. Trong trường hợp này, mẫu bị nhiễm tự nhiên có thể được “pha loãng” với các nguyên liệu không bị nhiễm của cùng một mặt hàng sản phẩm.

Các phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế phải được thực hiện với cùng một mẫu càng chính xác càng tốt.

6.1.2.3  Tính và diễn giải nghiên cứu độ đúng tương đối

Các kết quả thu được được phân tích sử dụng phương pháp Bland-Altman ^[7]. Vẽ đồ thị dữ liệu từng mẫu cho mỗi nhóm và cho mỗi mẫu trong tất cả các nhóm và vẽ đường nhận dạng trên đó có tất cả các điểm nếu hai phương pháp cho kết quả giống nhau đối với từng mẫu phân tích. Hình 1 cho thấy ví dụ về một nhóm cụ thể. Đồ thị của một nhóm cụ thể cần cho thấy các kết quả của mỗi loại được thử nghiệm bằng một biểu tượng khác biệt. Đồ thị của tất cả các nhóm cần cho thấy các kết quả của từng nhóm thử nghiệm với một biểu tượng khác biệt. Điều này cho phép đánh giá trực quan nhanh về mức độ mà hai phương pháp (không) thống nhất. Nếu kết quả bất kỳ (của phương pháp chuẩn hoặc phương pháp thay thế) nằm dưới giới hạn định lượng thì dữ liệu phải được vẽ bằng cách sử dụng giá trị thay thế của 1 log₁₀ nhỏ hơn giá trị quan sát thấy trong trường hợp giá trị thấp hơn (ví dụ: < 2 log₁₀ đơn vị sẽ được sửa đổi đến 1 đơn vị log₁₀). Tương tự, giá trị bất kỳ lớn hơn giới hạn trên cần sửa bằng cách thêm 1 log₁₀ đơn vị nữa (ví dụ: > 6 log₁₀ đơn vị sẽ được sửa đổi thành 7 log₁₀ đơn vị). Ví dụ, kết quả của phương pháp chuẩn 2,54 log₁₀ cfu/g và kết quả của phương pháp thay thế < 2 log₁₀ cfu/g sẽ được vẽ trên đồ thị là 2,54 đối với phương pháp chuẩn và 1,0 đối với phương pháp thay thế. Thông tin (dựa trên điều tra, ví dụ: phân tích nguyên nhân gốc) có thể được nêu trong báo cáo nghiên cứu để giải thích về các phát hiện khi một trong những phương pháp đưa ra một kết quả dưới mức giới hạn định lượng.

Các giá trị sửa đổi này sẽ không được sử dụng để tính các dữ liệu được trình bày trong Bảng 13, nhưng phải được bao gồm trong đồ thị về chênh lệch (xem Hình 2).

Hình 1 - Đồ thị của kết quả phương pháp chuẩn so với phương pháp thay thế đối với một nhóm sản phẩm riêng rẽ

Xác định giá trị trung bình của mỗi cặp dữ liệu và chênh lệch giữa các giá trị như trong Bảng 13 và vẽ đồ thị (xem Hình 2) cho mỗi nhóm và cho tất cả các nhóm để minh họa mức độ sai lệch và sự thiếu đồng nhất của dữ liệu. Hình 2 cho thấy đường nhận diện (chênh lệch zero), đường của độ chệch và giới hạn độ tin cậy (CL) trên và dưới 95 % của độ chệch.

Bảng 13 - Kết quả thống kê đối với tất cả các nhóm

Tính chênh lệch trung bình độ lệch chuẩn của các chênh lệch s_D và các giới hạn thống nhất đối với từng nhóm và tất cả các nhóm sử dụng Công thức sau:

Trong đó n là số cặp dữ liệu, T là phần trăm của phân bố Student-t đối với xác suất β của dải đã chọn và (n - 1) bậc tư do, đó là:

Vẽ đồ thị theo Hình 2 các chênh lệch của mẫu riêng lẻ so với các giá trị trung bình trên đồ thị thể hiện đường nhận dạng (chênh lệch zero), đường của độ chệch và giới hạn tin cậy trên và dưới 95 % của độ thống nhất (CL) của độ chệch đối với tất cả các nhóm. Điều này minh họa độ chệch và (mức độ thiếu) sự thống nhất của dữ liệu. Hình 2 cho thấy biểu đồ đối với từng giá trị cùng với đường nhận dạng (chênh lệch zero), đường độ chệch và các giới hạn độ tin cậy trên và dưới 95 % của độ chệch.

Hình 2 - Đồ thị chênh lệch Bland-Altman đối với tất cả các nhóm

Các kết quả của độ chênh lệch và đồ thị phân tán sẽ được giải thích dựa trên quan sát trực quan về số lượng độ chệch và kết quả cực đoan. Điều này được mong đợi rằng không nhiều hơn một trong 20 giá trị dữ liệu sẽ nằm ngoài các giá trị CL. Mọi sự bất đồng so với dự kiến cần được ghi lại.

6.1.3  Nghiên cứu độ chính xác

Nghiên cứu về độ chính xác là một nghiên cứu so sánh giữa các kết quả thu được bằng phương pháp chuẩn và kết quả của phương pháp thay thế. Nghiên cứu này được tiến hành bằng cách sử dụng các mẫu nhiễm nhân tạo. Một kiểu/loại cho mỗi nhóm sẽ được thử nghiệm.

6.1.3.1  Chọn các nhóm để sử dụng

Xem 6.1.2.1.

6.1.3.2  Số lượng mẫu

Đối với mỗi nhóm được kiểm tra, ít nhất một kiểu/loại phải được thử nghiệm, sử dụng 6 mẫu cho mỗi kiểu/loại. Trong số sáu mẫu, cần có hai mức thấp, hai mức trung cấp và hai mức nhiễm cao. Các mức này phải bao gồm toàn bộ dải nhiễm của kiểu/loại được chọn. Đối với mỗi mẫu, phải sử dụng 5 lần lặp lại cho 5 phần mẫu thử khác nhau từ cùng một mẫu.

CHÚ THÍCH: Sáu mẫu có thể khác nhau thuộc cùng một kiểu/loại, nhưng không nhất thiết là cùng một mặt hàng. Ví dụ, một mẫu có thể là sữa bột đủ béo, mẫu khác là thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh thuộc cùng một loại thực phẩm (sản phẩm sữa bột), nhưng không cùng một mặt hàng thực phẩm (xem Phụ lục A).

6.1.3.3  Tính và diễn giải về nghiên cứu độ chính xác

Lập bảng các kết quả như trong Bảng 14 dựa vào số đếm log được chuyển đổi.

Bảng 14- Kết quả của nghiên cứu độ chính xác (tính bằng log₁₀ cfu/g)

Độ chính xác được sử dụng để kiểm tra yêu cầu rằng phương pháp thay thế cho kết quả đối với mẫu khác với giá trị thu được bằng phương pháp chuẩn nhỏ hơn một tiêu chí chấp nhận cụ thể. Quy trình của độ chính xác được giải thích chi tiết hơn trong Phụ lục G.

Ký hiệu sau được sử dụng: i đề cập đến mẫu và q là số lượng mẫu (1 ≤ / ≤ q); j đề cập đến các phần mẫu thử và n là số lượng phần mẫu thử (1 ≤ j ≤ n). Các phép tính được thực hiện cho mỗi nhóm/kiểu/loại theo trình tự các thao tác sau:

- x_ij, kết quả thử nghiệm đã chuyển đổi log₁₀ của mẫu i đối với j lặp lại với 1 ≤ i ≤ q và 1 ≤ j ≤ n sử dụng phương pháp chuẩn;

- y_ij, kết quả thử nghiệm đã chuyển đổi log₁₀ của mẫu i để nhân bản j với 1 ≤ i ≤ q và 1 ≤ j ≤ n sử dụng phương pháp thay thế.

Đối với từng hạng mục mẫu hoặc mẫu, các phép đo được thực hiện trong các điều kiện lặp lại cho cả hai phương pháp, các giá trị y_i được coi là phân bố chuẩn. Khoảng dung sai dự kiến β(β-ETI) của các giá trị yi được tính theo Tài liệu tham khảo [8]. Giả sử rằng độ lệch chuẩn kết hợp có thể tính được cho tất cả các mẫu hạng mục.

Giới hạn chấp nhận được đặt ở: AL = ± 0,5 log₁₀ đơn vị. Điều này được thể hiện như chênh lệch giữa phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế.

Bước 1: Đối với mỗi mẫu i, tính giá trị trung bình X_i theo trung bình của các số chuyển đổi log₁₀ thu được bằng phương pháp chuẩn, x_ij. Các giá trị này là các giá trị của phương pháp chuẩn của các mẫu xác nhận giá trị sử dụng:

X_i = trung bình (x_ij)                                                                     (16)

Bước 2: Đối với từng mẫu i, tính giá trị trung bình Y_j theo trung bình của các số chuyển đổi log₁₀ thu được bằng phương pháp thay thế, y_ij. Các giá trị này là các giá trị thay thế của các mẫu xác nhận giá trị sử dụng:

Y_i = trung bình (y_ij)                                                                     (17)

Bước 3: Đối với mỗi mẫu i, tính độ lệch chuẩn s_alt,i như sau:

Bước 4: Tính độ lệch chuẩn kết hợp s_alt như sau:

Bước 5: Tính độ lệch chuẩn kết hợp của phương pháp chuẩn s_ref(tương tự Bước 3 và Bước 4), như sau:

Và

Bước 6: Đối với mỗi mẫu i, tính độ chệch tuyệt đối theo chênh lệch của các trung bình tính được đối với cả hai phương pháp B_i = Y_i - X_i. Đây là ước tính độ thiếu chính xác của phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn.

Bước 7: Đối với từng mẫu i, tính các giới hạn β-ETI. Đây là khoảng mà tỷ lệ dự kiến của các kết quả trong tương lai sẽ giảm là β. Đối với mỗi mẫu, β-ETI được biểu thị như sau:

Trong đó T là phần trăm của phân bố Student-t đối với β xác suất đã chọn và q · (n - 1) bậc tự do (24 trong cài đặt không yêu cầu), đó là:  . Với mục đích của tiêu chuẩn này, β là 80 %. T là hệ số phủ của β-ETI của mẫu xác nhận giá trị sử dụng. Điều này xác định giới hạn trên U_i và giới hạn dưới L_i:

Bước 8: Đối với mỗi nhóm, lập bảng các giá trị chênh lệch tính được cho các mẫu như trong Bảng 15.

Bảng 15 - Thể hiện các kết quả thống kê của nghiên cứu so sánh

Dựng đồ thị của các kết quả tính được như sau:

- trục hoành là các giá trị chuẩn X_i, tính theo các đơn vị log₁₀;

- trục tung là độ chệch, các giới hạn chấp nhận và giới hạn khoảng dung sai U_i - X_i và L_i - X_i tất cả tính bằng đơn vị log₁₀ theo chênh lệch giá trị chuẩn tương ứng của mẫu.

Vẽ biểu đồ như ví dụ nêu trong Hình 3. Các giới hạn khoảng dung sai trên và dưới được nối thành đường thẳng để nội suy các giới hạn giữa các mức khác nhau của các mẫu xác nhận giá trị sử dụng. Đường ngang thể hiện các giá trị chuẩn thu được với phương pháp chuẩn. Chênh lệch giữa các giá trị chuẩn và các mức nhiễm trung bình được thể hiện bằng các dấu chấm màu đen. Bất cứ khi nào không có độ chệch, các giá trị thu hồi này nằm trên đường tham chiếu nằm ngang. Ngoài ra, các giới hạn chấp nhận được thể hiện bằng hai đường ngang đứt và giới hạn β-ETI là các đường vạch liền.

Hình 3 - Ví dụ về độ chính xác đối với một nhóm trong nghiên cứu so sánh phương pháp

Nếu đối với tất cả i trong độ chính xác U_i ≤ AL và L_i ≥ - AL thì phương pháp thay thế được chấp nhận là tương đương với phương pháp chuẩn đối với các nhóm riêng lẻ và các nhóm kết hợp.

Nếu bất kỳ giới hạn trên hoặc giới hạn dưới vượt quá giới hạn chấp nhận và độ lệch chuẩn, S_ref > 0,125 thì thực hiện quy trình đánh giá bổ sung sau đây:

Bước 9: Tính các giới hạn chấp nhận mới theo hàm của độ lệch chuẩn: AL_s = 4 · s_ref. Nếu đối với tất cả i trong độ chính xác U_i ≤ AL_s và L_i ≥ - AL_s thì phương pháp thay thế được chấp nhận là tương đương với phương pháp chuẩn đối với kiểu/loại và nhóm kết hợp đã nêu.

CHÚ THÍCH: Nếu S_ref ≤ 0,125 thì giới hạn chấp nhận mới sẽ nhỏ hơn hoặc bằng 0,5. Đánh giá lần thứ hai cần cho kết quả tương tự như trong trường hợp trước đó.

Phương pháp thay thế được chấp nhận là tương đương với phương pháp chuẩn nếu tương đương với tất cả các nhóm riêng lẻ và các nhóm kết hợp. Ví dụ về việc sử dụng độ chính xác được nêu trong Phụ lục H. Cần điều tra (ví dụ, phân tích nguyên nhân gốc) để giải thích các phát hiện khi các phương pháp không tương đương đối với các nhóm riêng lẻ hoặc các nhóm kết hợp. Dựa vào các điều tra, quyết định xem các phương pháp được coi là tương đương hay không cho một nhóm hoặc các nhóm có liên quan. Kết quả đánh giá phải được nêu rõ trong báo cáo nghiên cứu.

Đối với việc tính toán độ chính xác, có sẵn bảng tính Excel^® tại: http://standards.iso.org/iso/16140 và chọn tập tin AP cho nghiên cứu so sánh phương pháp.

6.1.4  Giới hạn nghiên cứu định lượng

6.1.4.1  Xem xét chung

Đối với một số phương pháp thay thế, nên xác định giới hạn định lượng (LOQ). LOQ chỉ có liên quan khi quy trình đo của phương pháp thay thế không dựa trên số đếm các khuẩn lạc có thể nhìn thấy được của vi sinh đích và do đó phải xác định trong những trường hợp này. Các ví dụ về các phương pháp mà LOQ cần được xác định là đo tính dẫn điện hoặc huỳnh quang liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật.

6.1.4.2  Chọn nhóm để sử dụng

Chọn cùng các nhóm và các kiểu/loại được sử dụng trong nghiên cứu độ chính xác (xem 6.1.2.1 và 6.1.3.2).

6.1.4.3  Số lượng mẫu

Nếu LOQ cần được xác định thì các mẫu trắng được kiểm tra đối với mỗi nhóm/kiểu/loại được sử dụng. Những mẫu trắng này được sử dụng để xác định giới hạn định lượng của phương pháp thay thế. Phải sử dụng ít nhất 10 phần mẫu thử từ cùng một mẫu. Kiểm tra các phần mẫu thử với phương pháp thay thế.

6.1.4.4  Tính và giải thích giới hạn của nghiên cứu định lượng

10 kết quả cho mỗi nhóm/kiểu/loại được sử dụng để ước tính độ lệch chuẩn ngưỡng hoặc độ lệch chuẩn đường nền. Tính độ lệch chuẩn s₀ của n kết quả như sau:

Trong đó:

n  là tổng số phần mẫu thử được sử dụng;

y_i  là kết quả chuyển đổi log₁₀ của phần mẫu thử j;

 là kết quả trung bình chuyển đổi log₁₀ của tất cả các phần mẫu thử.

Giới hạn định lượng được tính bằng LOQ = 10 s₀.

6.1.5  Nghiên cứu mục tiêu và loại trừ

Phép thử mục tiêu và loại trừ không bắt buộc đối với các phương pháp đếm tổng quát như đếm đĩa tổng sổ (TPC), phương pháp đếm nấm men và nấm mốc (Y & M). Thử nghiệm này cần thiết cho các phương pháp đếm được thiết kế cho các vi sinh vật cụ thể (ví dụ: Listeria).

6.1.5.1  Lựa chọn và số lượng các chủng thử nghiệm

Phải sử dụng một dãy các chủng. Các tiêu chí lựa chọn các chủng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục E. Các chủng được sử dụng phải tính đến quy trình đo của phương pháp thay thế (ví dụ: nuôi cấy, phân tích miễn dịch và phân tử). Các quy trình đo khác nhau yêu cầu sử dụng các kênh thử nghiệm các chủng thử nghiệm khác nhau.

Mỗi chủng được sử dụng phải đặc trưng về sinh hóa và/hoặc huyết thanh học và/hoặc di truyền với đầy đủ chi tiết nhận dạng đã biết. Các chủng được sử dụng ưu tiên phải được phân lập từ thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hoặc môi trường chế biến thực phẩm, hoặc sản xuất ban đầu có tính đến phạm vi xác nhận giá trị sử dụng. Tuy nhiên, cũng có thể sử dụng các chủng của bộ sưu tập các chủng bệnh viện và môi trường. Nguồn gốc xuất xứ của tất cả các chủng phân lập cần được biết và phải được lưu giữ nội bộ (ví dụ: phòng thử nghiệm chuyên ngành), bộ sưu tập chủng cấy của quốc gia hoặc quốc tế để có thể sử dụng để kiểm tra sau này, nếu cần.

Đối với phép thử mục tiêu, cần kiểm tra ít nhất 50 chủng thuần của vi sinh vật (đích).

Đối với phép thử loại trừ, cần kiểm tra ít nhất 30 chủng thuần của vi sinh vật (không phải đích).

Một số vi sinh vật sẽ khó hoặc không thể nuôi cấy như virus hoặc đơn bào ký sinh. Trường hợp sinh vật đích không thể nuôi cấy được, nên sử dụng các huyền phù của các chủng thử nghiệm để thêm chủng ở bước thích hợp sớm nhất của phương pháp.

Đối với một số vi sinh vật, sẽ rất khó khăn để có được số lượng yêu cầu của các chủng đối với phép thử mục tiêu và phép thử loại trừ. Trong những trường hợp này, các bên tham gia nghiên cứu xác nhận phải chọn một bộ các chủng thử nghiệm.

CHÚ THÍCH: Các hướng dẫn để bảo quản và duy trì các chủng trong các bộ sưu tập (địa phương) có thể được tìm thấy trong TCVN8128 (ISO 11133)^[2].

6.1.5.2  Các vi sinh vật đích (mục tiêu)

Mỗi phép thử được thực hiện một lần và bằng phương pháp thay thế, phương pháp chuẩn và một loại thạch không chọn lọc. Mức chủng cấy ít nhất phải cao hơn 100 lần so với mức tối thiểu để định lượng của phương pháp thay thế được xác nhận giá trị sử dụng. Khi sử dụng phương pháp đổ đĩa làm phương pháp thay thế, mức chủng cấy phải chứa số có thể đếm được trên đĩa. Nếu kết quả là âm tính, có thể xem xét để lặp lại các thử nghiệm với việc bổ sung một loại thực phẩm.

6.1.5.3  Các vi sinh vật không phải đích (loại trừ)

Mỗi phép thử được thực hiện một lần và với phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn. Mức chủng cấy phải tương tự như mức nhiễm cao nhất dự kiến có trong bất kỳ nhóm nào được sử dụng. Không bổ sung thêm mẫu. Chủng cấy thuần cần phát triển trong canh thang không chọn lọc thích hợp ở các điều kiện sinh trưởng tối ưu ít nhất 24 h và được pha loãng đến mức thích hợp trước khi bắt đầu thử nghiệm.

Nếu sinh vật không thể nuôi cấy được, nên pha loãng huyền phù gốc đến mức thích hợp trước khi sử dụng.

6.1.5.4  Biểu thị và diễn giải kết quả

Lập bảng các kết quả như trong Bảng 16 đối với các phép thử mục tiêu và Bảng 17 đối với các phép thử loại trừ. Việc diễn giải do phòng thử nghiệm phụ trách nghiên cứu so sánh phương pháp thực hiện. Báo cáo cần nêu rõ mọi bất thường so với kết quả dự kiến.

Bảng 16 - Trình bày các kết quả đối với các phép thử mục tiêu

Việc giải thích dữ liệu của phép thử mục tiêu đối với phương pháp thay thế sử dụng môi trường đổ đĩa được thực hiện trên cơ sở định tính. Tuy nhiên, dữ liệu định lượng cần tạo thuận lợi cho việc giải thích dữ liệu.

Bảng 17 - Trình bày các kết quả đối với các phép thử loại trừ

6.2  Nghiên cứu liên phòng

6.2.1  Xem xét chung

Mục đích của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm là so sánh hiệu quả của phương pháp thay thế với phương pháp chuẩn do các cộng tác viên khác nhau thực hiện, sử dụng các mẫu giống nhau trong các điều kiện tái lập và để so sánh các kết quả này với các tiêu chí đã được xác định trước về chênh lệch có thể chấp nhận được giữa phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế. Khi có thể, các điều kiện nghiên cứu cần phản ánh biến thiên chuẩn giữa các phòng thử nghiệm. Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm do phòng thử nghiệm tổ chức thiết lập.

Kết quả (các bảng và các phép tính) của các bộ phận khác nhau và việc giải thích kết quả, bao gồm các kết quả khác nhau, phải được nêu rõ trong báo cáo nghiên cứu.

6.2.2  Quy trình đo

Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm phải tạo ra ít nhất tám bộ dữ liệu hợp lệ từ ít nhất tám cộng tác viên. Các cộng tác viên tối thiểu phải đến từ bốn tổ chức khác nhau, nhưng tốt hơn là từ tám tổ chức không bao gồm phòng thử nghiệm tổ chức. Tối đa ba bộ dữ liệu có thể được tạo ra từ một tổ chức. Các kỹ thuật viên tham gia vào việc chuẩn bị các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm sẽ không tham gia vào phép thử các mẫu này trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm.

CHÚ THÍCH: Các phòng thử nghiệm ở các địa điểm khác nhau, nhưng thuộc một công ty hoặc viện nghiên cứu, được chấp nhận là các tổ chức khác nhau.

Độ chính xác và độ chụm cần được tính từ một số lượng lớn các kết quả thử nghiệm lặp lại. Con số này phải là tối thiểu 96 kết quả đối với một hạng mục được chọn bao gồm tám cộng tác viên, ba mức nhiễm, hai phương pháp định lượng (chuẩn và thay thế) và các phép đo lặp lại, ví dụ: 8 x 3 x 2 x 2 = 96.

Các hướng dẫn chung để tiến hành các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được nêu trong TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Người tổ chức chịu trách nhiệm soạn thảo quy trình thử nghiệm và bảng dữ liệu để ghi lại tất cả dữ liệu thực nghiệm và điều kiện thử nghiệm quan trọng được sử dụng bởi mỗi phòng thử nghiệm. Mỗi cộng tác viên cần chứng tỏ năng lực của mình trong việc sử dụng phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn trước khi tham gia nghiên cứu thích hợp.

Quy trình như sau:

- hạng mục phù hợp (để chọn xem phụ lục A) được sử dụng để chuẩn bị các mẫu thử nghiệm. Hạng mục này cần chứa hệ vi khuẩn nền tự nhiên.

- hạng mục được chọn có thể được nuôi cấy với vi sinh vật đích. Quy trình nuôi cấy mẫu phải phù hợp với hạng mục đã chọn. Các mẫu phải được chuẩn bị để đảm bảo sự đồng nhất giữa các mẫu sử dụng các quy trình chuẩn bị có trong Phụ lục B và Phụ lục C. Nhìn chung, mẫu dạng lỏng (được so sánh với mẫu dạng rắn) đảm bảo sự đồng nhất hơn. Các mẫu phải được phòng thử nghiệm tổ chức đồng hóa. Các phép thử đổng hóa và các tiêu chí chấp nhận được nêu trong TCVN 9331 (ISO/TS 22117)^[4].

- phải sử dụng ít nhất ba mức nhiễm khác nhau. Nồng độ chất phân tích phải được chọn để bao trùm tối thiểu các mức thấp, trung bình và cao của toàn bộ dải đo của phương pháp thay thế. Cần bao gồm thêm mức kiểm chứng âm.

- các mẫu lặp được thử nghiệm bởi mỗi phòng thử nghiệm cộng tác ở ba mức nhiễm. Tất cả các mẫu phải được mã hóa mù để đảm bảo rằng các nhà phân tích không biết mức nhiễm của chúng.

- việc phân tích mẫu phải được thực hiện tại mỗi phòng thử nghiệm vào thời điểm quy định.

Phòng thử nghiệm tổ chức sử dụng tất cả các dữ liệu được ghi lại, phải xác định kết quả phù hợp sử dụng để phân tích dữ liệu. Phòng thử nghiệm tổ chức kiểm tra dữ liệu thô và các thông tin khác yêu cầu trong bảng dữ liệu để đảm bảo rằng tất cả các cộng tác viên đã thực hiện phân tích theo cả phương pháp thay thế và phương pháp chuẩn bằng văn bản. Khi có bằng chứng cho thấy kết quả có thể đã thu được trong các điều kiện không thích hợp và/hoặc các phương pháp không được tuân thủ nghiêm ngặt thì các kết quả này hoặc tất cả các kết quả từ cộng tác viên đó đều bị loại ra để phân tích thêm. Không có phép thử ngoại lệ nào được thực hiện trên dữ liệu đã chọn.

6.2.3  Tính toán, thống kê và diễn giải dữ liệu

Các kết quả thử nghiệm đã chuyển đổi sang log₁₀ của các cộng tác viên khác nhau cho cả hai phương pháp chuẩn và thay thế được nêu trong Bảng 18. Ghi lại các dữ liệu như sau:

- x_jjk, kết quả thử nghiệm đã chuyển đổi sang log₁₀ ở mức i đối với độ lặp lại j của cộng tác viên k với 1 ≤ i ≤ q, 1 ≤ j ≤ n và 1 ≤ k ≤ p sử dụng phương pháp chuẩn;

- y_ijk, kết quả thử nghiệm đã chuyển đổi sang log₁₀ ở mức i đối với độ lặp lại j của cộng tác viên k với 1 ≤ i ≤ q, 1 ≤ j ≤ n và 1 ≤ k ≤ p sử dụng phương pháp thay thế.

Bảng 18 - Kết quả thống kê của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên mỗi mức phân tích (k)

Các phép tính được thực hiện theo trình tự các thao tác bắt đầu với sự chuyển đổi sang log₁₀ của tất cả các kết quả thử nghiệm. Các ký hiệu sau đây được sử dụng: i dùng để chỉ mức và q là số lượng các mức (1 ≤ i ≤ q); j là độ lặp lại và n là số lần lặp lại (1 ≤ j ≤ n); k là cộng tác viên và p là số lượng cộng tác viên (1 ≤ k ≤ p). Các phép tính chi tiết được nêu trong Tài liệu tham khảo [9] hoặc Tài liệu tham khảo [13].

Bước 1: Đối với mỗi mức nhiễm, tính X_i là mức trung bình tổng thể của các kết quả lặp lại được chuyển sang log₁₀ thu được bằng phương pháp chuẩn x_jjk đối với mẫu đã cho. Các giá trị trung bình này được gán các giá trị chuẩn của các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng:

Bước 2: Tính đối với mỗi mức i (sử dụng y_ijk), độ lệch tiêu chuẩn tái lập s_Ri như sau:

Quy trình này được mô tả chi tiết trong TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)^[1]

Bước 3: Đối với mỗi mức, tính , trung bình tổng thể của phép đo được thực hiện bằng phương pháp thay thế.

Bước 4: Đối với mỗi mức, tính độ chệch tuyệt đối là  - X_i. Đây là ước tính độ thiếu chính xác của phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn.

Bước 5: Đối với mỗi mức, tính các giới hạn β-ETI theo Tài liệu tham khảo [12]. β-ETI là khoảng mà tỷ lệ dự kiến của các kết quả sau này sẽ giảm là β.

a) với mỗi mức, β-ETI có thể được biểu thị như sau:

Trong đó k_Mi biểu thị hệ số phủ và s_Tli độ lệch chuẩn của khoảng dung sai của mức i đã cho.

b) độ lệch chuẩn của khoảng dung sai bằng:

c) hệ số phủ đối với mức i bằng k_Mi = T

Trong đó: T = T(1/2 (1- β), v), nghĩa là phần trăm phân bố t-student, β xác suất được chọn, p số lượng cộng tác viên, n số lặp lại và v số bậc tự do. Đối với tiêu chuẩn này thì β = 80 %. Các thông số trung gian  và

Số lượng bậc tự do được tính như sau: v =

CHÚ THÍCH 1: G, H và v sẽ có các giá trị khác nhau cho mỗi mức i và cần được lập chỉ số. Vì lý do dễ đọc, chỉ số i không được sử dụng ở đây.

CHÚ THÍCH 2: Số bậc tự do (dof) v không phải là một số nguyên và cần thiết để có được giá trị T đối với (dof) không phải số nguyên. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng bảng thống kê mở rộng hoặc bằng cách nội suy giữa hai giá trị trên và giá trị dưới được làm tròn của v.

CHÚ THÍCH 3: Cần sử dụng một phương pháp khác để tính β-ETI so với nghiên cứu so sánh phương pháp (xem 6.1.3.3) do các phép đo được thực hiện trong điều kiện tái lập lại của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm và trong các điều kiện lặp lại của nghiên cứu so sánh phương pháp.

Bước 6: Đối với mỗi mức i, tính các giới hạn của β-ETI được biểu thị như sau:

Việc này xác định giới hạn trên U_i và giới hạn dưới L_i: U_i =  và L_i =

Bước 7: Dựng biểu đồ của kết quả tính được như sau:

- trục hoành cho các giá trị đích X_i tính bằng đơn vị log₁₀;

- trục tung cho giá trị độ chệch , các giới hạn chấp nhận AL (± 0,50 đơn vị log) và giới hạn khoảng dung sai U_i - X_i và L_i - X_i đều tính bằng log₁₀ là chênh lệch tương ứng giá trị chuẩn của mẫu.

Các kết quả được minh họa trong đồ thị mô tả độ chính xác như ví dụ nêu trong Phụ lục I (Hình I.2). Biểu đồ này được sử dụng như một công cụ hỗ trợ quyết định đồ họa. Giới hạn khoảng dung sai trên và dưới được nối với nhau thành đường thẳng để nội suy các mức chênh lệch của các mẫu xác nhận giá trị sử dụng. Đường ngang biểu thị các giá trị chuẩn thu được bằng phương pháp chuẩn. Chênh lệch giữa các giá trị chuẩn và mức nhiễm trung bình xác định được bởi phương pháp thay thế _­ được biểu thị bởi các chấm màu đen. Khi không có độ chệch, các giá trị thu hồi này nằm trên đường chuẩn nằm ngang. Ngoài ra, giới hạn chấp nhận thể hiện bằng hai đường ngang bị cắt ngang và các giới hạn β-ETI là các đường kẻ đứt đoạn. Giới hạn chấp nhận được cài đặt ở ± 0,5 log₁₀.

Phương pháp thay thế được coi là tương đương với phương pháp chuẩn khi các giá trị β-ETI nằm trong các giới hạn chấp nhận đối với tất cả các mức nhiễm.

Bước 8: Nếu bất kỳ giá trị nào của β-ETI nằm ngoài giới hạn chấp nhận thì thực hiện quy trình đánh giá bổ sung. Tính độ lệch chuẩn tái lập trung bình của phương pháp chuẩn s_R,ref =

Bước 9: Tính các giới hạn chấp nhận mới là hàm số của độ lệch chuẩn: AL_s = 3,3 . s_R,ref.

Nếu tất cả i trong độ chính xác U_i - X_i ≤ ALs và L_i - X_i ≥ - ALs thì phương pháp thay thế được chấp nhận là tương đương với phương pháp chuẩn.

AL không đáp ứng khi giá trị quan sát được cao hơn AL. Khi AL không được đáp ứng, nên tiến hành điều tra (ví dụ, phân tích nguyên nhân gốc) để cho lời giải thích về các kết quả quan sát được. Dựa vào thông tin AL và thông tin bổ sung, quyết định xem phương pháp thay thế có được coi là không phù hợp với mục đích của nhóm hoặc các nhóm liên quan không. Các lý do chấp nhận phương pháp thay thế trong trường hợp AL không đạt yêu cầu phải được nêu trong báo cáo nghiên cứu.

Để tính độ chính xác, xem bảng tính Excel^® tại http: // standards.iso.org/iso/16140 và sau đó chọn tập tin AP cho nghiên cứu liên phòng thử nghiệm.

Một ví dụ về việc áp dụng độ chính xác cho các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục I.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Phân loại mẫu và các kết hợp đích đề xuất cho nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng

Bảng A.1 đưa ra việc phân loại các thực phảm chủ yếu để hướng dẫn các nhà phát triển phương pháp xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thay thế. Các đặc tính nội tại của thực phẩm như mức hệ vi sinh vật vốn có, hàm lượng chất béo, độ pH, hàm lượng muối, hoạt độ nước và sự có mặt của các hợp chất kháng khuẩn có thể có ảnh hưởng đáng kể đến kết quả của phương pháp. Do đó, tính chất nội tại của thực phẩm đã được xem xét trong phạm vi có thể khi phân loại thực phẩm, nhưng tính đa dạng của thực phẩm sẵn có làm cho việc xem xét này khó áp dụng cho kiểu/loại thực phẩm vượt quá mức.

Các cơ quan quản lý khác nhau thường có những yêu cầu hơi khác nhau về phân loại thực phẩm. Những khác biệt này đã được bao gồm trong phần chú thích của Bảng A.1 càng nhiều càng tốt.