Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-10:2022 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng (FMD)
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 10: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG (FMD)
Vaccine testing procedure - Part 10: Foot and mouth disease vaccine, inactivated
Lời nói đầu
TCVN 8685-10:2022 thay thế TCVN 8685-10:2014.
TCVN 8685-10:2022 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:
- TCVN 8685-1:2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc,
- TCVN 8685-2:2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;
- TCVN 8685-3:2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;
- TCVN 8685-4:2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;
- TCVN 8685-5:2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;
- TCVN 8685-6:2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;
- TCVN 8685-7:2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;
- TCVN 8685-8:2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;
- TCVN 8685-9:2022, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh cúm gia cầm;
- TCVN 8685-10:2022, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng (FMD);
- TCVN 8685-11:2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);
- TCVN 8685-12:2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);
- TCVN 8685-13:2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);
- TCVN 8685-14:2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;
- TCVN 8685-15:2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;
- TCVN 8685-16:2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;
- TCVN 8685-17:2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;
- TCVN 8685-18:2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;
- TCVN 8685-19:2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;
- TCVN 8685-20:2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;
- TCVN 8685-21:2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;
- TCVN 8685-22:2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;
- TCVN 8685-23:2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella enteritidis ở gà;
- TCVN 8685-24:2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;
- TCVN 8685-25:2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn;
- TCVN 8685-26:2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;
- TCVN 8685-27:2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà;
- TCVN 8685-28:2019, Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng ở lợn;
- TCVN 8685-29:2019, Phần 29: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) ở gà;
- TCVN 8685-30:2019, Phần 30: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm não tủy truyền nhiễm ở gà;
- TCVN 8685-31:2019, Phần 31 Vắc xin phòng bệnh Dại ở chó;
- TCVN 8685-32:2019, Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma gallisepticum ở gia cầm;
- TCVN 8685-33:2019, Phần 33: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Riermerella anatipestifer;
- TCVN 8685-34:2020, Phần 34: Vắc xin phòng bệnh tiêu chảy thành dịch do Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây ra ở lợn;
- TCVN 8685-35:2020, Phần 35: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;
- TCVN 8685-36:2020, Phần 36: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng và bệnh đóng dấu ở lợn;
- TCVN 8685-37:2020, Phần 37: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà;
- TCVN 8685-38:2020, Phần 38: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh do Leptospira gây ra;
- TCVN 8685-39:2020, Phần 39: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng còi cọc do Circovirus gây ra ở lợn.
QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 10: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG (FMD)
Vaccine testing procedure - Part 10: Foot and mouth disease vaccine, inactivated
Tiêu chuẩn này quy định quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng dạng nhũ dầu hoặc keo phèn cho động vật móng guốc chẵn.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8684 Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y- Phép thử độ thuần khiết
TCVN 12682:2019 Thuốc thú y - Lấy mẫu
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay): Phản ứng miễn dịch gắn enzym
TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50): Liều gây nhiễm 50% tế bào
VNT (Viral Neutralization Test): Phản ứng trung hòa vi rút
Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu độ an toàn và hiệu lực được đánh giá trên động vật thí nghiệm khỏe mạnh, không có kháng thể lở mồm long móng.
5.1 Lợn từ 3 tuần tuổi đến 4 tuần tuổi, 11 con, lợn khỏe, không có kháng thể lở mồm long móng.
5.2 Bò 6 tháng tuổi, 11 con, bò khỏe, không có kháng thể lở mồm long móng.
5.3 Kit ELISA định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng.
5.4 Nước muối sinh lý vô trùng, nồng độ từ 0,85 % đến 0,9 %.
Lấy mẫu vắc xin và chế phẩm sinh học theo quy định tại 3.6.4 TCVN 12682:2019.
- Lắc nhẹ lọ vắc xin và quan sát độ đồng đều của hỗn dịch bằng mắt thường.
- Đánh giá kết quả:
Vắc xin đạt yêu cầu về cảm quan khi:
+ Vắc xin dạng nhũ dầu có hỗn dịch đồng đều, không đông vón, không lắng cặn, không có hiện tượng tách pha nước;
+ Vắc xin dạng keo phèn có hỗn dịch đồng đều, không đông vón, không có hiện tượng tách pha nước, sau khi để yên từ 1 min đến 2 min có lắng cặn ở đáy chai.
- Kiểm tra các chỉ tiêu tạp nhiễm vi khuẩn, tạp nhiễm nấm mốc, tạp nhiễm Mycoplasma, tạp nhiễm Salmonella theo TCVN 8684.
- Đánh giá kết quả: vắc xin đạt yêu cầu về độ vô trùng khi không có bất cứ tạp khuẩn, nấm mốc, Mycoplasma hay Salmonella nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
7.3.1 Trên lợn
Chọn 1 trong 2 cách sau:
a) Tiêm bắp hoặc tiêm dưới da cho 03 lợn (5.1), mỗi lợn được tiêm 02 liều vắc xin ghi trên nhãn.
- Sau khi tiêm, theo dõi lợn thí nghiệm trong 14 ngày.
- Đánh giá kết quả: vắc xin đạt yêu cầu về độ an toàn khi 03 lợn được tiêm vắc xin sống khỏe mạnh, không có bất kỳ biểu hiện triệu chứng của bệnh lở mồm long móng trong thời gian theo dõi.
b) Tiêm vào vành móng bàn chân trước bên trái tại 2 vị trí cho 03 lợn (5.1), mỗi vị trí tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn cho mỗi lợn.
- Sau khi tiêm, theo dõi lợn thí nghiệm trong 14 ngày.
- Đánh giá kết quả: vắc xin đạt yêu cầu về độ an toàn khi 03 lợn được tiêm vắc xin sống khỏe mạnh, không có bất kỳ biểu hiện triệu chứng của bệnh lở mồm long móng trong thời gian theo dõi.
7.3.2 Kiểm tra trên bò
Chọn 1 trong 2 cách sau:
a) Tiêm bắp cho 03 bò (5.2) mỗi bò được tiêm 02 liều vắc xin ghi trên nhãn.
- Sau khi tiêm, theo dõi bỏ thí nghiệm trong 14 ngày.
- Đánh giá kết quả: vắc xin đạt yêu cầu về độ an toàn khi 03 bò được tiêm vắc xin sống khỏe mạnh, không có bất kỳ biểu hiện triệu chứng của bệnh lở mồm long móng trong thời gian theo dõi.
b) Tiêm vắc xin vào nội bì lưỡi cho 03 bò (5.2), mỗi bò được tiêm ở 20 vị trí, mỗi vị trí tiêm 0,1 ml vắc xin.
- Sau khi tiêm, theo dõi bò thí nghiệm trong 4 ngày, nếu không có các triệu chứng bệnh tích điển hình của bệnh lở mồm long móng thì tiêm nhắc lại theo đường tiêm như lần một cho cả 03 bò, mỗi bò được tiêm 03 liều vắc xin ghi trên nhãn.
- Sau khi tiêm vắc xin lần hai, theo dõi bò thí nghiệm trong 6 ngày.
- Đánh giá kết quả: vắc xin đạt yêu cầu về độ an toàn khi 03 bò được tiêm vắc xin sống khỏe mạnh, không có bất kỳ biểu hiện triệu chứng của bệnh lở mồm long móng trong thời gian theo dõi.
7.4.1 Trên lợn
7.4.1.1 Cách tiến hành
- Sử dụng 08 lợn (5.1), chia làm 2 nhóm:
+ Nhóm 1: gồm 05 lợn, mỗi lợn được tiêm bắp hoặc tiêm dưới da 1 liều vắc xin ghi trên nhãn;
+ Nhóm 2: gồm 03 lợn làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý vô trùng (5.4) với liều lượng và đường tiêm như lợn nhóm 1.
- 28 ngày sau khi tiêm vắc xin, 05 lợn nhóm 1 và 03 lợn nhóm 2 được tiêm nhắc lại với liều lượng và đường tiêm như lần một.
- 28 ngày sau khi tiêm vắc xin lần hai, 05 lợn nhóm 1 và 03 lợn nhóm 2 được lấy máu để kiểm tra hiệu giá kháng thể lở mồm long móng bằng 1 trong 2 phương pháp sau:
+ Phương pháp VNT với chủng vi rút vắc xin hoặc chủng vi rút phân lập tại Việt Nam, các bước thực hiện phản ứng định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng bằng kỹ thuật trung hòa vi rút trên tế bào được nêu tại Phụ lục A.
+ Phương pháp ELISA (khi vắc xin có tính tương đồng kháng nguyên), sử dụng kit ELISA liquid phase định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng (5.3).
7.4.1.2 Đánh giá kết quả
- Đánh giá kết quả theo phương pháp VNT:
Vắc xin đạt yêu cầu về hiệu lực khi:
+ Nhóm 1: ít nhất 80 % lợn có hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 1/100;
+ Nhóm 2: 100 % lợn có hiệu giá kháng thể trung hòa < 1/45 (hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 1/45 được xem là dương tính).
- Đánh giá kết quả theo phương pháp ELISA:
Vắc xin đạt yêu cầu về hiệu lực khi:
+ Nhóm 1: ít nhất 80 % lợn có hiệu giá kháng thể ELISA ≥ 1/128;
+ Nhóm 2: 100 % lợn có hiệu giá kháng thể ELISA < 1/40.
7.4.2 Trên bò
7.4.2.1 Cách tiến hành
- Sử dụng 08 bò (5.2), chia làm 2 nhóm:
+ Nhóm 1: gồm 05 bò, mỗi bò được tiêm bắp hoặc tiêm dưới da 1 liều vắc xin ghi trên nhãn;
+ Nhóm 2: gồm 03 bò làm đối chứng, tiêm nước muối sinh lý vô trùng (5.4) với liều lượng và đường tiêm như bò nhóm 1.
- 28 ngày sau khi tiêm vắc xin, 05 bò nhóm 1 và 03 bò nhóm 2 được lấy máu để kiểm tra hiệu giá kháng thể lở mồm long móng bằng 1 trong 2 phương pháp sau:
+ Phương pháp VNT với chủng vi rút vắc xin hoặc chủng vi rút phân lập tại Việt Nam, các bước thực hiện phản ứng định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng bằng kỹ thuật trung hòa vi rút trên tế bào được nêu tại Phụ lục A.
+ Phương pháp ELISA (khi vắc xin có tính tương đồng kháng nguyên), sử dụng kit ELISA liquid phase định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng (5.3).
CHÚ THÍCH: Hiện nay, có nhiều bộ kit ELISA liquid phase định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ về phản ứng ELISA định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng sử dụng kit thương mại được nêu tại phụ lục B.
7.4.2.2 Đánh giá kết quả
- Đánh giá kết quả theo phương pháp VNT:
Vắc xin đạt yêu cầu về hiệu lực khi:
+ Nhóm 1: ít nhất 80 % bò có hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 1/100;
+ Nhóm 2: 100 % bò có hiệu giá kháng thể trung hòa < 1/45 (hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 1/45 được xem là dương tính).
- Đánh giá kết quả theo phương pháp ELISA:
Vắc xin đạt yêu cầu về hiệu lực khi:
+ Nhóm 1: ít nhất 80 % bò có hiệu giá kháng thể ≥ 1/128;
+ Nhóm 2: 100 % bò có hiệu giá kháng thể < 1/40.
Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, độ vô trùng, độ an toàn và hiệu lực như đã nêu lần lượt ở 7.1, 7.2, 7.3 và 7.4.
Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:
- Mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
- Kết quả thử nghiệm thu được.
Định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng bằng kỹ thuật trung hòa vi rút trên tế bào
A.1.1 Môi trường EMEM (Eagle’s Minimum Essential) 1X.
A.1.2 Huyết thanh cần kiểm tra, là huyết thanh thu được sau khi lấy máu động vật thí nghiệm ở mục 7.4.1.1 và 7.4.2.1.
A.1.3 FBS (Fetal bovine serum) huyết thanh bào thai bê.
A.1.4 Tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney) tế bào thận chuột sơ cấp, mật độ 106 tế bào/ ml trong môi trường chứa 10 % FBS.
A.1.5 Huyết thanh đối chứng (đã biết trước hiệu giá kháng thể).
A.1.6 Formol 10 %.
A.1.7 Dung dịch PBS 1 X, pH 7,2.
A.1.8 Xanh methylen 0.05 % có bổ sung 10 % formol.
A.2.1 Đĩa nhựa 96 giếng sạch, đáy chữ U (xem hình A.1).
A.2.2 Bể ủ nhiệt, duy trì nhiệt độ 56 °C.
A.2.3 Tủ ấm CO2, duy trì nhiệt độ 37 °C, có bổ sung từ 5 % đến 10 % CO2.
A.2.4 Kính hiển vi soi ngược có vật kính với độ phóng đại 10 X.
A.2.5 Pipet, dung tích từ 50 pl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl.
A.2.6 Pipet đa kênh, dung tích từ 50 µl đến 100 µl.
A.3.1 Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng với 100 TCID50/50 µl trong môi trường EMEM (A.1.1)
VÍ DỤ: Lượng dung dịch vi rút với 100 TCID50/50 µl cần cho một dĩa phản ứng là 6 ml.
A.3.2 Thực hiện trên đĩa nhựa 96 giếng
- Huyết thanh cần kiểm tra (A.1.2) được ủ ở bể ủ nhiệt (A.2.2) trong 30 min ở nhiệt độ 56 °C, sau đó được pha loãng theo cơ số 2, bắt đầu từ nồng độ pha loãng 1/4 đến 1/512, mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.
CHÚ DẪN:
Cột: từ cột 1 đến cột 12 Hàng: từ hàng A đến hàng H
Hình A.1 - Minh họa đĩa nhựa 96 giếng
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút với 100 TCID50/50 µl vào các giếng của đĩa nhựa 96 giếng (A.2.1).
- Ủ đĩa ở tủ ấm CO2 (A.2.3) trong 60 min.
- Sau khi ủ xong, dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl tế bào BHK 21 (A.1.4) vào tất cả các giếng.
- Ủ đĩa ở tủ ấm CO2 (A.2.3) trong 2 ngày đến 3 ngày.
- Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào chết nhiều).
A.3.3 Thực hiện trên đĩa đối chứng
a) Đối chứng huyết thanh
Huyết thanh đối chứng (A.1.5) được pha loãng theo cơ số 2, bắt đầu từ nồng độ pha loãng 1/4 đến 1/512, mỗi độ pha loãng huyết thanh được cho vào 2 giếng, mỗi giếng 50 µl.
- Dùng pipet (A.2.5) hút 150 µl môi trường EMEM (A.1.1) vào giếng A1.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 100 µl môi trường EMEM (A.1.1) vào các giếng từ B1 đến H1.
- Dùng pipet (A.2.5) hút 50 µl huyết thanh đối chứng vào giếng A1. Tiến hành pha loãng bậc hai từ A1 đến H1 và loại bỏ 100 µl ở giếng H1.
- Sau khi pha loãng xong, sử dụng pipet đa kênh (A.2.6) chuyển 50 µl mẫu huyết thanh đã pha loãng từ cột 1 sang cột 2.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút với 100 TCID50/50 µl vào các giếng của đĩa nhựa 96 giếng (A.2.1).
b) Đối chứng tế bào
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 100 µl môi trường EMEM (A.1.1) vào giếng A4 đến H5 .
c) Đối chứng môi trường
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 150 µl môi trường EMEM (A. 1.1) vào giếng A6 đến H7.
d) Chuẩn độ lại vi rút sử dụng
- Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng: từ nồng độ 10-1 đến nồng độ 10-8.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl môi trường EMEM (A.1.1) vào các giếng từ A9 đến H12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-1 vào các giếng từ A9 đến A12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-2 vào các giếng từ B9 đến B12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-3 vào các giếng từ C9 đến C12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-4 vào các giếng từ D9 đến D12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-5 vào các giếng từ E9 đến E12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-6 vào các giếng từ F9 đến F12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-7 vào các giếng từ G9 đến G12.
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl dung dịch vi rút pha loãng nồng độ 10-8 vào các giếng từ H9 đến H12.
e) Ủ đĩa ở tủ ấm CO2 (A.2.3) trong 60 min.
g) Sau khi ủ xong, dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl tế bào BHK 21 (A.1.4) vào tất cả các giếng từ A1 đến H2, từ A4 đến H5 và từ A9 đến H12.
h) Ủ đĩa ở tủ ấm CO2 (A.2.3) trong 2 ngày đến 3 ngày.
i) Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược (A.2.4) để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào chết nhiều).
A.3.4 Cố định và nhuộm
- Loại bỏ môi trường từ đĩa phản ứng cho vào lọ chứa chất khử trùng, sau đó cố định tế bào bằng 100 µl formol 10 % (A.1.6).
- Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 min.
- Loại bỏ dung dịch cố định và rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS (A.1.7).
- Dùng pipet đa kênh (A.2.6) hút 50 µl xanh methylen 0.05 % (A.1.8) vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng.
- Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 min.
- Loại bỏ xanh methylen và rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS (A.1.7).
A.3.5 Đọc và diễn giải kết quả
A.3.5.1 Đọc kết quả
Đọc kết quả sau khi nhuộm, bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi ngược (A.2.4) để ghi nhận bệnh lý tế bào trên từng giếng.
Kết quả dương tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi soi ngược không có bệnh tích tế bào (không có CPE), sau khi nhuộm các giếng dương tính có màu xanh
Kết quả âm tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi soi ngược có bệnh tích tế bào (có CPE), sau khi nhuộm các giếng âm tính sẽ trống (không có màu).
Ghi nhận bệnh tích tế bào và tính hiệu giá kháng thể trung hòa 50 % theo công thức sau:
Hiệu giá kháng thể trung hòa 50 % = x + 0,5 - ΣrI/n
Trong đó:
x: là độ pha loãng huyết thanh cao nhất không có bệnh tích tế bào;
rI: là số giếng có bệnh tích tế bào ở từng độ pha loãng;
n: là số giếng sử dụng cho một độ pha loãng.
A.3.5.2 Diễn giải kết quả
a) Phản ứng có giá trị khi:
- Đối chứng tế bào: bình thường;
- Đối chứng môi trường: bình thường;
- Hiệu giá của mẫu đối chứng huyết thanh dương chuẩn chỉ chênh lệch ± 2 độ pha loãng;
- Hiệu giá chuẩn độ lại vi rút (100 TCID50) phải nằm trong khoảng log101,5 đến log102,5.
b) Kết quả:
Hiệu giá kháng thể có trong mẫu huyết thanh được tính ở nồng độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh có trong hỗn hợp huyết thanh/vi rút là nơi 50 % số giếng được bảo hộ.
- Mẫu huyết thanh được xem là không có kháng thể (mẫu âm tính) nếu có hiệu giá kháng thể ≤ 1/16.
- Mẫu huyết thanh được xem là có kháng thể (mẫu dương tính) nếu có hiệu giá kháng thể ≥ 1/45.
- Mẫu huyết thanh được xem là nghi ngờ nếu có hiệu giá kháng thể từ 1/16 đến 1/32.
CHÚ THÍCH: Sự chứng nhận cho từng cá thể động vật với mục đích thương mại, nồng độ từ 1/16 đến 1/32 được xem là giới hạn nghi ngờ, và cần phải lấy thêm mẫu huyết thanh để kiểm tra; kết quả được xem là dương tính nếu mẫu kiểm tra lần 2 hiệu giá là 1/16 hoặc cao hơn. Với mục đích thống kê trên cơ sở dữ liệu huyết thanh là một phần của khảo sát thống kê về hiệu lực huyết thanh, ngưỡng 1/45 có thể xem là thích hợp. Ngưỡng hiệu giá để đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vắc xin phải được thiết lập từ các thí nghiệm về kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc xin liên quan và động vật mục tiêu.
Kết quả kiểm tra có thể khác nhau giữa các phòng thí nghiệm có liên quan đến ngưỡng giới hạn âm tính và dương tính.
Ví dụ về phản ứng ELISA định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng sử dụng kit thương mại
B.1.1 Huyết thanh cần kiểm tra, là huyết thanh thu được sau khi lấy máu động vật thí nghiệm ở mục 7.4.1.1 và 7.4.2.1.
B.1.2 Dung dịch PBS 1 X, pH 7,2.
B.1.3 Bộ kit FMDV Ab PIRBRIGHT (Liquid phase blocking enzyme immunoassay for detection of antibodies of foot-and-mouth disease virus).
B.2.1 Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.
B.2.2 Đĩa nhựa 96 giếng sạch, đáy chữ U.
B.2.3 Pipet, dung tích từ 50 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl.
B.2.4 Pipet đa kênh, dung tích từ 50 µl đến 100 µl.
B.2.5 Máy lắc tròn (vortex) có tốc độ lắc từ 50 vòng/phút đến 2400 vòng/phút.
B.2.6 Tủ ấm duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C.
B.2.7 Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng 492 nm.
B.3.1 Phủ đĩa
- Lấy kháng huyết thanh thỏ từ ngăn mát tủ lạnh, sau đó lắc đều và nhẹ nhàng để bảo đảm tính đồng nhất của nguyên liệu trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị pha loãng 1/1000 cho mỗi kháng huyết thanh thỏ serotype A trong dung dịch đệm gắn đĩa pH 9,6.
- Dùng pipet (B.2.3) cho 50 pl kháng huyết thanh thỏ đã pha loãng vào đĩa phản ứng (Maxisorp-NUNC) theo sơ đồ đã bố trí xét nghiệm.
- Đậy đĩa và ủ qua đêm ở tủ lạnh (B.2.1).
B.3.2 Ủ mẫu xét nghiệm và đối chứng kháng nguyên
B.3.2.1 Pha loãng mẫu xét nghiệm trong trường hợp định tính
- Lắc đều mẫu đối chứng và mẫu huyết thanh cần kiểm tra (B. 1.1) trước khi sử dụng.
- Mẫu huyết thanh cần kiểm tra và các mẫu đối chứng được pha loãng 1/16 bằng đệm A trong đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2).
VÍ DỤ: Lấy 15 µl mỗi huyết thanh đối chứng (C++, C+, C-) cho vào 225 µl đệm A và lấy 10 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra cho vào 150 µl đệm A.
- Dùng pipet (B.2.3) hút 50 µl mẫu đối chứng và 50 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra đã pha loãng vào các giếng tương ứng vào đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2).
- Dùng pipet (B.2.3) hút 50 µl đệm A vào các giếng kháng nguyên đối chứng (Ca) theo sơ đồ trong hình B.1.
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
C++ |
C++ |
1 |
1 |
9 |
9 |
17 |
17 |
25 |
25 |
33 |
33 |
|
B |
C++ |
C++ |
2 |
2 |
10 |
10 |
18 |
18 |
26 |
26 |
34 |
34 |
|
C |
C+ |
C+ |
3 |
3 |
11 |
11 |
19 |
19 |
27 |
27 |
35 |
35 |
|
D |
C+ |
C+ |
4 |
4 |
12 |
12 |
20 |
20 |
28 |
28 |
36 |
36 |
|
E |
C- |
C- |
5 |
5 |
13 |
13 |
21 |
21 |
29 |
29 |
37 |
37 |
|
F |
C- |
C- |
6 |
6 |
14 |
14 |
22 |
22 |
30 |
30 |
38 |
38 |
|
G |
Ca |
Ca |
7 |
7 |
15 |
15 |
23 |
23 |
31 |
31 |
39 |
39 |
|
H |
Ca |
Ca |
8 |
8 |
16 |
16 |
24 |
24 |
32 |
32 |
40 |
40 |
Hình B.1 - Sơ đồ bố trí mẫu trong trường hợp định tính
B.3.2.2 Pha loãng mẫu xét nghiệm trong trường hợp định lượng
Chọn 1 trong 2 cách pha loãng:
B.3.2.2.1 Pha loãng bậc 2
- Lắc đều mẫu đối chứng và mẫu huyết thanh cần kiểm tra (B.1.1) trước khi sử dụng.
- Mẫu huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng 1/8 và các mẫu đối chứng được pha loãng 1/16 bằng đệm A trong đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2).
VÍ DỤ: Lấy 15 µl mỗi huyết thanh đối chứng (C++, C+, C-) cho vào 225 µl đệm A và lấy 20 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra cho vào 140 µl đệm A.
- Dùng pipet đa kênh (B.2.4) hút 50 µl đệm A vào tất cả các giếng từ cột 3 đến cột 12 trong đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2). Cho 50 µl mẫu đối chứng đã pha loãng vào các giếng tương ứng như trong sơ đồ.
- Dùng pipet (B.2.3) hút 50 µl đệm A vào các giếng kháng nguyên đối chứng (Ca).
- Dùng pipet (B.2.3) hút 50 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra đã pha loãng 1/8 vào các giếng tương ứng của hàng A hoặc E, từ cột 3 đến cột 12, sau đó pha loãng theo cơ số 2 bằng cách trộn đều rồi chuyển 50 µl từ hàng A đến hàng B cứ như vậy đến hàng D rồi hút bỏ đi 50 µl. Tiếp tục cho các mẫu khác thì lặp lại như trên bắt đầu từ hàng E đến hàng H và loại bỏ 50 µl từ hàng H. Xem sơ đồ trong hình B.2.
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
C++ |
C++ |
1 |
1 |
3 |
3 |
5 |
5 |
7 |
7 |
9 |
9 |
|
B |
C++ |
C++ |
1 |
1 |
3 |
3 |
5 |
5 |
7 |
7 |
9 |
9 |
|
C |
C+ |
C+ |
1 |
1 |
3 |
3 |
5 |
5 |
7 |
7 |
9 |
9 |
|
D |
C+ |
C+ |
1 |
1 |
3 |
3 |
5 |
5 |
7 |
7 |
9 |
9 |
|
E |
C- |
C- |
2 |
2 |
4 |
4 |
6 |
6 |
8 |
8 |
10 |
10 |
|
F |
C- |
C- |
2 |
2 |
4 |
4 |
6 |
6 |
8 |
8 |
10 |
10 |
|
G |
Ca |
Ca |
2 |
2 |
4 |
4 |
6 |
6 |
8 |
8 |
10 |
10 |
|
H |
Ca |
Ca |
2 |
2 |
4 |
4 |
6 |
6 |
8 |
8 |
10 |
10 |
Hình B.2 - Sơ đồ bố trí mẫu trong trường hợp định lượng kháng thể
B.3.2.2.2 Pha loãng bậc 5
- Lắc đều mẫu đối chứng và mẫu huyết thanh cần kiểm tra (B.1.1) trước khi sử dụng.
- Mẫu huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng 1/5 và các mẫu đối chứng được pha loãng 1/16 bằng Buffer A trong đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2).
VÍ DỤ: Lấy 20 µl mỗi huyết thanh đối chứng (C++, C+, C-) cho vào 300 µl đệm A và lấy 20 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra cho vào 80 µl đệm A.
- Dùng pipet đa kênh (B.2.4) hút 60 µl đệm A vào tất cả các giếng từ cột 3 đến cột 12 trong đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2). Cho 60 µl mẫu đối chứng đã pha loãng vào các giếng tương ứng như trong sơ đồ.
- Dùng pipet (B.2.3) hút 60 µl đệm A vào các giếng kháng nguyên đối chứng (Ca).
- Dùng pipet (B.2.3) hút 15 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra đã pha loãng 1/5 vào các giếng tương ứng của hàng A hoặc E, từ cột 3 đến cột 12, sau đó pha loãng theo cơ số 5 bằng cách trộn đều rồi chuyển 15 µl từ hàng A đến hàng B, cứ như vậy đến hàng D rồi hút bỏ đi 15 µl. Tiếp tục cho các mẫu khác thì lặp lại như trên bắt đầu từ hàng E đến hàng H và loại bỏ 15 µl từ hàng H. Xem sơ đồ trong hình B.2.
B.3.3 Thêm kháng nguyên
- Chuẩn bị pha loãng 1/100 kháng nguyên lở mồm long móng serotype A22 IRAQ 24/64 trong đệm A.
- Với đĩa định lượng pha loãng bậc 2, cho 50 µl kháng nguyên đã pha loãng 1/100 vào tất cả các giếng của đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2). Đây là nồng độ pha loãng mẫu xét nghiệm, lúc này đạt nồng độ từ 1/32 đến 1/256 của phương pháp chuẩn độ.
- Với đĩa định lượng pha loãng bậc 5, cho 60 µl kháng nguyên đã pha loãng 1/100 vào tất cả các giếng của đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2). Đây là nồng độ pha loãng mẫu xét nghiệm, lúc này đạt nồng độ từ 1/50 đến 1/6250 của phương pháp chuẩn độ.
- Lắc đều hỗn hợp huyết thanh cần kiểm tra và kháng nguyên bằng tay hoặc bằng máy lắc (B.2.5), dán kín đĩa. Ủ ở tủ lạnh (B.2.1) qua đêm.
B.3.4 Chuyển hỗn hợp kháng nguyên và mẫu xét nghiệm
Lấy đĩa phản ứng (đĩa đã phủ kháng thể thỏ) và đĩa nhựa 96 giếng có chứa hỗn hợp mẫu xét nghiệm và kháng nguyên để ở nhiệt độ phòng.
Rửa đĩa phủ kháng thể thỏ 5 lần với nước rửa PBS 0,002 M, sau đó làm sạch đĩa trên khăn vải mềm.
Lắc đều hỗn hợp mẫu xét nghiệm-kháng nguyên, dùng pipet đa kênh (B.2.4) chuyển 50 µl hỗn hợp này vào đĩa phản ứng tương ứng với sơ đồ bố trí xét nghiệm.
Đậy nắp, ủ và lắc ở tủ ấm (B.2.6) trong 1 h.
B.3.5 Chuẩn bị đệm B
Thêm dung dịch đệm (Phosphate Buffered Saline with Tween 20 + Buffer A) vào sữa bột gầy (skim milk) sao cho nồng độ sữa gầy là 5 %. Lắc đều và điều chỉnh pH ở dãy pH 7,4 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 0,1 M.
VÍ DỤ: Để chuẩn bị 100 ml dung dịch đệm B thì cân 5 g sữa gầy cho vào 100 ml dung dịch Buffer A.
B.3.6 Thêm kháng huyết thanh chuột lang
Trước khi kết thúc giai đoạn ủ hỗn hợp kháng nguyên và huyết thanh cần kiểm tra, chuẩn bị pha loãng kháng huyết thanh chuột lang serotype A nồng độ 1/100 trong đệm B.
Sau khi ủ 1 h, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm (B.2.6) ra ngoài và rửa 5 lần với dung dịch PBS (B.1.2)
Dùng pipet đa kênh (B.2.4) cho 50 µl kháng huyết thanh chuột lang đã pha loãng 1/100 vào tất cả các giếng của đĩa nhựa 96 giếng (B.2.2).
Đậy nắp, ủ và lắc ở tủ ấm (B.2.6) trong 1 h.
B.3.7 Thêm phức hợp gắn kết
Trước khi kết thúc giai đoạn ủ kháng huyết thanh chuột lang, chuẩn bị pha loãng phức hợp gắn kết 1/200 trong đệm B.
Sau 1 h ủ kháng huyết thanh chuột lang, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm ra ngoài và rửa 5 lần với dung dịch PBS (B.1.2).
Dùng pipet đa kênh (B.2.4) cho 50 pl dung dịch phức hợp gắn kết đã pha loãng vào tất cả các giếng trên đĩa phản ứng.
Đậy nắp, ủ và lắc ở tủ ấm (B.2.6) trong 1 h.
B.3.8 Thêm dung dịch chất phát màu và dung dịch dừng phản ứng
Trước khi kết thúc giai đoạn ủ phức hợp gắn kết, chuẩn bị dung dịch chất phát màu OPD (Ortho- Phenylendiamine). Dung dịch này phải được giữ trong tối và nếu đã chuyển sang màu vàng thì nên loại bỏ.
Sau ủ phức hợp gắn kết trong 1 h, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm (B.2.6) ra ngoài và rửa 5 lần với dung dịch PBS (B.1.2).
Chuẩn bị chất phát màu cho một đĩa phản ứng như sau: lấy 30 µl cơ chất - H2O2 3 % pha trong 6 ml dung dịch chất phát màu OPD. Như vậy H2O2 3 % sử dụng là 1/200.
Dùng pipet đa kênh (B.2.4) cho 50 µl dung dịch chất phát màu vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, đậy nắp để ở nhiệt độ phòng trong tối.
Sau 15 min ủ dung dịch chất phát màu, dùng pipet đa kênh (B.2.4) cho 50 µl dung dịch dừng phản ứng (axit sulfuric 1,25 M) vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Lắc đều bằng máy lắc (B.2.5) (hoặc dùng tay vỗ nhẹ vào các thành giếng) để bảo đảm rằng hỗn hợp này đã được trộn đều.
B.3.9 Đọc đĩa phản ứng
Đặt đĩa vào máy đọc ELISA (B.2.7) ở bước sóng 492 nm để thu được các giá trị mật độ quang học (OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.Trước khi đọc đĩa, cần phải đảm bảo rằng không có bong bóng trong bất kỳ giếng nào, vì điều này sẽ gây ra sai số quang học và đảm bảo rằng không có dấu (ví dụ: dấu vân tay) hoặc ngưng tụ trên thành của đĩa phản ứng. Nếu cần thiết, làm vỡ bong bóng bất kỳ bằng một tip sạch.
Đĩa đọc được phân tích cho hai nhóm:
B.4.1 Phân tích các giá trị đối chứng
Giá trị phần trăm giá trị ức chế (percent inhibition) của mẫu đối chứng được dùng để chấp nhận kết quả. Tính phần trăm ức chế của mẫu đối chứng, PIR, theo công thức sau:
Trong đó:
ODR là mật độ quang của mẫu đối chứng:
ODCa là mật độ quang trung bình của đối chứng kháng nguyên.
Tính phần trăm giá trị ức chế của mẫu xét nghiệm, Pls, theo công thức sau:
Trong đó:
ODS là mật độ quang của mẫu cần kiểm tra;
ODCa là mật độ quang trung bình của đối chứng kháng nguyên.
B.4.2 Tính toán và chấp nhận các giá trị đối chứng
Các giá trị OD và Pl của đối chứng kháng nguyên và các giá trị Pl của ba đối chứng khác (C++, C+ và C-) được sử dụng để chấp nhận hoặc không chấp nhận kết quả khi so với bảng giới hạn bắt buộc của bảng dữ liệu, từ đó đưa ra kết luận chấp nhận cho từng đĩa phản ứng theo Bảng B.1.
Bảng B.1 - Các đối chứng Ca, C++, C+ và C-
|
Giá trị Pl |
Kết luận |
|
|
Trong a |
Ngoài b |
|
|
4 |
0 |
Chấp nhận |
|
3 |
1 |
Chấp nhận |
|
2 |
2 |
Làm lại |
|
1 |
3 |
Làm lại |
|
0 |
4 |
Làm lạl |
|
a Nằm trong khoảng giới hạn trên (UCL) và giới hạn dưới (LCL); b Nằm ngoài khoảng giới hạn trên (UCL) và giới hạn dưới (LCL). |
||
Với sự biến đổi trong giá trị OD và các giá trị Pl của các đối chứng được so sánh với giới hạn trên và giới hạn dưới về tính ổn định của các giá trị đối chứng theo Bảng B.2.
Bảng B.2 - Giới hạn trên và giới hạn dưới của các giá trị OD và Pl
|
Giá trị |
Giới hạn trên (UCL) |
Giới hạn dưới (LCL) |
|
Ca (OD) a |
1,9 |
0,8 |
|
Ca (Pl) a |
25 |
-25 |
|
C++ (Pl) b |
100 |
85 |
|
C+ (Pl) c |
85 |
50 |
|
C- (Pl) d |
49 |
0 |
|
a Ca là đối chứng kháng nguyên; b C++ là dương tính mạnh; c C+ là dương tính yếu; d C- là âm tính. |
||
Các giá trị đối chứng được xem xét một cách trình tự như sau:
a) Điều kiện đầu tiên để chấp nhận đĩa phản ứng Đối chứng kháng nguyên (Ca)
Đầu tiên tính giá trị PI, so sánh các giá trị OD của đối chứng kháng nguyên trong bảng giới hạn trên và giới hạn dưới. Cả hai giá trị OD trung gian (tức là hai giá trị còn lại sau khi loại bỏ các giá trị thấp nhất và cao nhất) phải nằm trong những dãy giới hạn này. Nếu hai giá trị trung gian không đạt thì đĩa phản ứng phải được làm lại. Khi đó, chỉ có hai giá trị OD trung gian này được sử dụng để tính toán giá trị trung bình ODCa và được sử dụng để tính toán cho các giá trị Pl tiếp theo.
b) Điều kiện tiếp theo để chấp nhận đĩa phản ứng
Đối chứng kháng nguyên (Ca), mẫu dương tính mạnh (C++), mẫu dương tính yếu (C+) và đối chứng âm (C-).
- Đối chứng kháng nguyên (Ca)
So sánh giá trị Pl của đối chứng kháng nguyên trong bảng giới hạn UCL và LCL và sử dụng Bảng B.1 để chấp nhận hoặc không chấp nhận kết quả cho từng đĩa phản ứng.
- Đối chứng C++, C+ và C-
So sánh giá trị Pl của các đối chứng C+, C+ và C- trong bảng giới hạn UCL và LCL và sử dụng Bảng B.1 để chấp nhận hoặc không chấp nhập kết quả cho từng đĩa phản ứng.
Phải làm lại đĩa phản ứng nếu có một vài giá trị đối chứng của Ca, C++, C+ và C- không đạt được các điều kiện của Pl.
B.4.3 Giải thích kết quả mẫu huyết thanh cần kiểm tra
Ngưỡng đánh giá cho phương pháp này là phần trăm giá trị ức chế 50 % (Pl = 50).
B.4.3.1 Trong trường hợp phát hiện kháng thể
- Nếu giá trị Pl của mẫu xét nghiệm dưới 50 % (Pl < 50 %) thì mẫu huyết thanh đó được xem là không có kháng thể (mẫu âm tính).
- Nếu giá trị Pl của mẫu xét nghiệm lớn hơn hoặc bằng 50 % (Pl ≥ 50) thì mẫu huyết thanh đó được xem lả có kháng thể (mẫu dương tính). Và mẫu huyết thanh dương tính này được đem ra chuẩn độ (xem sơ đồ 2 và 3) để biết được hiệu giá kháng thể.
B.4.3.2 Trong trường hợp chuẩn độ
a) Chuẩn độ pha loãng bậc 2
- Nếu tất cả giá trị Pl trong 2 giếng của mẫu huyết thanh cần kiểm tra nhỏ hơn 50 (Pl<50), thì mẫu này được xem là không có kháng thể (mẫu âm tính).
- Nếu có một trong 2 giếng đó có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 nhưng tất cả các giá trị Pl ở độ pha loãng kế tiếp có Pl < 50 thì mẫu xét nghiệm này có hiệu giá kháng thể là 1/32 .
- Nếu cả hai giếng có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 và tất cả các giá trị Pl ở độ pha loãng kế tiếp có Pl < 50 thì mẫu này có hiệu giá kháng thể là 1/45 và mẫu xét nghiệm này được xem là mẫu có kháng thể (mẫu dương tính).
- Hiệu giá kháng thể của các mẫu xét nghiệm có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl > 50) ở độ pha loãng 1/32 có thể tham khảo ở Bảng B.3. Nếu hiệu giá kháng thể lớn hơn 90 (> 90) cho biết rằng con vật này có khả năng bảo hộ với serotype vi rút Lở mồm long móng tương đồng với kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.
Bảng B.3 - Bảng tính hiệu giá kháng thể ở độ pha loãng bậc 2
|
Huyết thanh pha loãng |
Mẫu huyết thanh với những giá trị Pl khác nhau > 50 % |
|||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
|
32 |
+- |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
64 |
-- |
-- |
+- |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
128 |
-- |
-- |
-- |
-- |
+- |
++ |
++ |
++ |
|
256 |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
+- |
++ |
|
Hiệu giá kháng thể |
32 |
45 |
64 |
90 |
128 |
181 |
256 |
>256 |
b) Chuẩn độ pha loãng bậc 5
Hiệu giá kháng thể của huyết thanh xét nghiệm có giá trị Pl trên 50 có thể xem ở Bảng B.4. Hiệu giá kháng thể ≥ 112 cho biết rằng con vật này có khả năng bảo hộ với serotype vi rút lở mồm long móng tương đồng với kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.
Bảng B.4 - Bảng tính hiệu giá kháng thể ở độ pha loãng bậc 5
|
Huyết thanh pha loãng |
Mẫu huyết thanh với những giá trị Pl khác nhau > 50 % |
|||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
|
50 |
+- |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
250 |
-- |
-- |
+- |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
|
1250 |
-- |
-- |
-- |
-- |
+- |
++ |
++ |
++ |
|
6250 |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
+- |
++ |
|
Hiệu giá kháng thể |
50 |
112 |
250 |
560 |
1250 |
2800 |
6250 |
>6250 |
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] OIE Terrestrial Manual (2018). Chapter 3.1.8: Foot and Mouth Disease, Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2018.
[2] ASEAN, (2018). Asean standard Requirements for Foot and Mouth Disease Vaccine for Pigs, Inactivated. 3rd edition, p54 - 55.
[3] ASEAN, (2018). Asean standard Requirements for Foot and Mouth Disease Vaccine for Cattle and Buffaloes, Inactivated, p75 - 76.
Ý kiến bạn đọc
