Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-52:2022 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-52:2022

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 52: BỆNH NHIỆT THÁN Ở GIA SÚC

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 52: Anthrax in cattle

Lời nói đầu

TCVN 8400-52:2022 thay thế TCVN 5274:2010;

TCVN 8400-52:2022 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật- Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

- TCVN 8400-1:2019, Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2:2010, Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3:2010, Phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4:2010, Phần 4: Bệnh Niu cátxơn;

- TCVN 8400-5:2011, Phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6:2011, Phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7:2011, Phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8:2011, Phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9:2011, Phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10:2022, Phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11:2019, Phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12:2011, Phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13:2019, Phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14:2011, Phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15:2019, Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16:2011, Phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli;

- TCVN 8400-17:2011, Phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18:2014, Phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19:2014, Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20:2014, Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21:2014, Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22:2014, Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23:2014, Phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24:2014, Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25:2014, Phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26:2014, Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27:2014, Phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28:2014, Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29:2015, Phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30:2015, Phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31:2015, Phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32:2015, Phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33:2015, Phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34:2015, Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35:2015, Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36:2015, Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo vi rút typ 2;

- TCVN 8400-37:2015, Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38:2015, Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona vi rút;

- TCVN 8400-39:2016, Phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40:2016, Phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;

- TCVM 8400-41:2019, Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

- TCVN 8400-42:2019, Phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43:2019, Phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44:2019, Phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45:2019, Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46:2019, Phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47:2019, Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

- TCVN 8400-48:2020, Phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

- TCVN 8400-49:2020, Phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-50:2020, Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

- TCVN 8400-51:2020, Phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-52:2022, Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc;

- TCVN 8400-53:2022, Phần 53: Bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale ở gà;

- TCVN 8400-54:2022, Phần 54: Bệnh tỵ thư ở gia súc;

- TCVN 8400-55:2022, Phần 55: Bệnh u nhày ở thỏ.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 52: BỆNH NHIỆT THÁN Ở GIA SÚC

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 52: Anthrax in cattle

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh nhiệt thán ở gia súc do vi khuẩn Bacillus anthracis gây ra.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này.

TCVN 8128 (ISO 11133) Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy

3  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1.1

Bệnh nhiệt thán / bệnh than (anthrax)

Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Bacillus anthracis gây ra ở nhiều loài động vật và có thể lây sang người.

3.1.2

Bacillus anthracis

Trực khuẩn gram dương, hiếu khí, không di động, có hình thành giáp mô và nha bào, chiều rộng có kích thước từ 1 μm đến 1,2 μm và chiều dài có kích thước từ 3 μm đến 5 μm.

3.2  Các từ viết tắt

Từ viết tắt	Tên tiếng Anh	Tên tiếng Việt
ADN	Deoxyribonucleic acid	Axit deoxyribonucleic
B.	Bacillus	Bacillus
BHI	Brain heart infusion	Dịch tim não
CFU	Colony forming unit	Đơn vị hình thành khuẩn lạc
Ct	Threshold cycle	Chu kỳ ngưỡng
EDTA	ethylenediamine tetraacetic acid	axit etylendiamin tetraaxetic
PCR	Polymerase chain reaction	Phản ứng chuỗi polymerase
PFU	Plaque forming unit	Đơn vị hình thành mảng vô khuẩn
PLET	Polymyxin lysozyme EDTA thallium (I) acetate	Polymyxin lysozym EDTA tali (I) axetat
Realtime PCR	Realtime polymerase chain reaction	Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực
TAE	Tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic acid	Tris-axetat-axit etylendiamintetraaxetic
TBE	Tris-borate-ethylenediaminetetraacetic acid	Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic
TE	Tris-ethylendiamintetraacetic acid	Tris-axit etylendiamintetraaxetic
Tm	Melting curve	Đường cong nóng chảy

4  Thuốc thử, vật liệu thử và môi trường nuôi cấy

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ các trường hợp có quy định khác.

Thực hiện thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy theo quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133).

4.1  Bộ thuốc nhuộm Giemsa (xem Phụ lục A.1)

4.2  Bộ thuốc nhuộm M’Fadyean (xem Phụ lục A.2)

4.3  Bộ thuốc nhuộm Gram (xem Phụ lục A.3)

4.4  Môi trường BHI (xem Phụ lục B.1)

4.5  Môi trường thạch máu (xem Phụ lục B.2)

4.6  Môi trường thạch PLET (xem Phụ lục B.3)

4.7  Môi trường thạch máu bicacbonat (xem Phụ lục B.4)

4.8  Môi trường thạch lỏng (xem Phụ lục B.5)

4.9  Môi trường thạch kháng sinh (xem Phụ lục B.6)

4.10  Môi trường bảo quản và vận chuyển mẫu (xem Phụ lục B.7)

4.11  Khoanh giấy tẩm kháng sinh penicillin, nồng độ 30 μg, vô trùng,

4.12  Máu, máu cừu hoặc máu bê hoặc máu thỏ, vô trùng.

4.13  Nước muối sinh lý (natri clorua 0,9 %), vô trùng.

4.14  Nguyên liệu cho phương pháp PCR (xem Phụ lục E)

4.15  Nguyên liệu cho phương pháp Realtime PCR sử dụng Sybr Green (xem Phụ lục F)

4.16  Nguyên liệu cho phương pháp Realtime PCR sử dụng mẫu dò Taqman (xem Phụ lục G)

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Tủ ấm, duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C.

5.2  Kính hiển vi, có vật kính với độ phóng đại 10 X, 40 X, 100 X.

5.3  Nồi hấp, duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C.

5.4  Máy lắc, có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2 400 rpm.

5.5  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g, 8 000 g, 12 000 g.

5.6  Máy PCR

5.7  Máy Realtime PCR

5.8  Bộ điện di, gồm bộ nguồn điện di, bể điện di, khay điện di.

5.9  Máy đọc gel

5.10  Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C

5.11  Tăm bông, vô trùng.

5.12  Pipet các loại 100 μl, 200 μl, 1000 μl

5.13  Ống nghiệm, có thể tích từ 10 ml đến 15 ml, sạch và vô trùng.

5.14  Đĩa petri (hộp lồng), có đường kính từ 90 mm đến 100 mm, sạch và vô trùng.

5.15  Que cấy, vô trùng.

5.16  Bông cồn, bằng cottông được tẩm cồn 70 %

5.17  Bơm tiêm, loại 5 ml hoặc 10 ml, có gắn kim lấy máu loại 18 G hoặc 20 G hoặc 23 G, vô trùng.

5.18  Phiến kính, sạch.

5.19  Pank, kéo, vô trùng.

5.20  Máy dập mẫu (máy nghiền mẫu)

5.21  Ống ly tâm (hay ống eppendorf), có dung tích 0,2 ml, 1,5 ml, vô trùng.

5.22  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

5.23  Tủ an toàn sinh học cấp II

5.24  Dụng cụ đựng mẫu, là các ống, hộp có nắp kín, không rò rỉ, không dễ vỡ và vô trùng.

5.25  Máy ly tâm lạnh

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh thường xảy ra ở những vùng trước đó đã xuất hiện bệnh, hoặc do vận chuyển gia súc từ vùng có dịch nhiệt thán đến.

- Bệnh thường phát sinh vào mùa nóng ẩm, những tháng mưa nhiều hay cuối xuân đầu hè.

- Động vật ăn cỏ mẫn cảm nhất với bệnh. Lợn ít cảm nhiễm với bệnh hơn và thường mắc ở thể cục bộ. Người cũng dễ bị nhiễm bệnh.

- Bệnh lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa do ăn thức ăn, nước uống... có lẫn nha bào nhiệt thán. Bệnh cũng lây lan qua đường hô hấp hay các vết thương trên da.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

6.2.1  Đối với loài nhai lại

Triệu chứng của bệnh nhiệt thán ở loài nhai lại có 3 thể: Thể quá cấp tính, thể cấp tính, thể á cấp tinh.

6.2.1.1  Thể quá cấp tính

- Thể bệnh này thường gặp ở trâu, bò, dê, cừu và xảy ra ở đầu ổ dịch;

- Gia súc sốt cao từ 40,5 °C đến 42,5 °C, run rẩy, thở gấp, các niêm mạc đỏ ửng hay tím bầm, nghiến răng, thè lưỡi, đầu gục xuống, mắt đỏ, đi loạng choạng, đứng không vững;

- Gia súc chết nhanh sau khi xuất hiện triệu chứng từ một đến vài giờ;

- Sau khi chết, các lỗ tự nhiên chảy máu đen và khó đông.

6.2.1.2  Thể cấp tính

- Gia súc sốt cao từ 40 °C đến 42 °C, tim đập nhanh, thở nhanh, niêm mạc đỏ thẫm;

- Phân màu đen lẫn máu, nước tiểu lẫn máu;

- Mồm, mũi có bọt màu hồng lẫn máu;

- Hầu, ngực và bụng bị sưng, nóng;

- Gia súc thường chết sau từ 1 ngày đến 3 ngày mắc bệnh.

6.2.1.3  Thể á cấp tính

- Gia súc sốt cao, ăn ít hay bỏ ăn.

- Đặc trưng của thể này là hình thành những ung sưng thủy thũng ở những vùng da mỏng và có thể lan rộng. Ban đầu, trên da có các vùng sưng, sở thấy nóng, gia súc có biểu hiện đau. Tiếp sau, sờ thấy các ung không nóng, gia súc không đau, các ung loét ra, chảy nước vàng, lẫn máu;

- Niêm mạc mắt, miệng, hậu môn màu đỏ.

6.2.2  Đối với ngựa

Ngựa sốt từ 41 °C đến 42 °C, đau bụng dữ dội khó thở. Ngựa run rẩy, nước tiểu lẫn máu, phân lẫn máu và mủ. Mũi, miệng có thể chảy máu, con vật chết nhanh, sau khi chết bụng chướng to, lòi dom.

6.2.3  Đối với lợn

Lợn bị sưng hầu, có khi lan xuống cả ngực, bụng, lên mặt. Chỗ sưng có màu đỏ sẫm, tím bầm. Lợn khó nuốt, khó thở, không kêu được

6.3  Bệnh tích

- Xác gia súc trương to, có máu thâm đen không đông chảy ra từ các lỗ tự nhiên;

- Niêm mạc mắt, miệng, hậu môn tím tái và có nhiều điểm xuất huyết;

- Phù nề rõ ở vùng đầu, cổ, hầu, ngực, bụng. Xác chết mềm, không cứng;

- Trong trường hợp mổ khám thấy các vùng bị phù nề có nhiều điểm viêm tiết dịch và xuất huyết điểm;

- Lách sưng to, chảy máu màu thâm đen và không đông, nhanh thối và dễ nát;

- Hạch lâm ba ở các cơ quan hoặc tại vùng đó cũng sưng rất to, khi bổ đôi thấy chúng khô giòn, xuất huyết điểm tràn lan;

- Ruột có nhiều đám loét, ổ loét đen;

- Gan, thận, phổi, bị xung huyết.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Lấy mẫu, bảo quản, đóng gói và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

7.1.1  Lấy mẫu

Đối với gia súc còn sống, mẫu bệnh phẩm là: Máu, dịch ngoáy mũi, mẩu tai, các ung trên da hoặc các vết loét;

Đối với gia súc đã chết, mẫu bệnh phẩm là: Máu, dịch ngoáy mũi, dịch ngoáy ở các lỗ tự nhiên, mẩu tai, các ung trên da, các vết loét hoặc mẩu lách. Sau khi lấy mẫu, dùng bông cồn (5.16) nút vào lỗ tự nhiên hoặc dùng lửa đốt kỹ phần đã lấy mẫu;

Đối với gia súc chết lâu ngày, mẫu bệnh phẩm có thể là: da, lông, xương.

Cách lấy mẫu:

- Lấy mẫu máu: Sát trùng vị trí lấy mẫu bằng bông cồn (5.16). Dùng bơm tiêm (5.17) lấy máu ở tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch tai và sát trùng kỹ nơi lấy máu bằng bông cồn (5.16).

- Lấy dịch ngoáy mũi: Dùng tăm bông (5.11) đưa vào mũi gia súc, xoay tròn tăm bông và từ từ rút ra; Lấy tăm bông thứ 2 làm tương tự ở mũi còn lại. Cho cả 2 tăm bông vào ống đã có môi trường bảo quản (xem B.7).

- Lấy mẫu từ các ung trên da hoặc các vết loét: Dùng tăm bông (5.11) xoay tròn tăm bông vào các ung hoặc vết loét để lấy được dịch. Cho tăm bông có mẫu dịch vào ống đã có môi trường bảo quản (xem B.7).

- Lấy dịch ở các lỗ tự nhiên: Dùng bông hoặc tăm bông (5.11) hoặc bơm kim tiêm (5.17) hút lấy dịch. Cho tăm bông có mẫu dịch, dịch hút vào ống đã có môi trường bảo quản (xem B.7). Sát trùng tại nơi lấy mẫu bằng bông cồn (5.16) và dùng bông cồn nút lỗ tự nhiên.

- Lấy mẫu tai: Sát trùng vùng da tai bằng bông cồn (5.16), dùng pank, kéo (5.19) kẹp để cắt một mẩu tai (khoảng 3 cm²) rồi cho vào lọ hay ống nghiệm đã có môi trường bảo quản (xem B.7), đậy nút kín. Sát trùng lại nơi đã cắt bằng bông cồn (5.16).

CẢNH BÁO: Gia súc nghi mắc bệnh nhiệt thán, tuyệt đối không được mổ xác chết. Trong trường hợp bắt buộc phải lấy mẫu gửi về phòng thí nghiệm thi sinh thiết lách.

- Lấy mẫu lách: Sát trùng nơi định lấy mẫu bằng bông cồn (5.16) rồi dùng dao mổ rạch một đường nhỏ sau cung xương sườn thứ 8 bên trái để lấy một mẩu lách. Sau khi đã lấy được mẩu lách dùng lửa đốt kỹ chỗ mổ hoặc dùng bông cồn (5.16) nút vào chỗ vừa mổ.

LƯU Ý: Lấy bệnh phẩm cẩn thận, tránh để mầm bệnh vương vãi ra ngoài môi trường. Vị trí lấy mẫu phải được sát trùng cẩn thận; rác thải phát phát sinh trong quá trình lấy mẫu cần được thu gom để xử lý theo quy định và môi trường xung quanh phải được tiêu độc khử trùng theo hướng dẫn của cơ quan chuyên môn.

7.1.2  Bảo quản mẫu

- Mỗi bệnh phẩm được giữ trong dụng cụ đựng mẫu (5.24) có môi trường bảo quản, đóng kín, dán nhãn, ghi rõ bệnh phẩm nghi mắc bệnh nhiệt thán.

- Dụng cụ chứa mẫu bệnh phẩm được bảo quản lạnh khoảng 2 °C đến 8 °C.

- Mẫu bệnh phẩm phải có giấy yêu cầu xét nghiệm kèm theo ghi rõ bệnh sử, triệu chứng, bệnh tích, đặc điểm dịch tễ của gia súc.

7.1.3  Đóng gói và vận chuyển mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghi mắc bệnh nhiệt thán được đóng gói 3 lớp, đảm bảo an toàn sinh học trong quá trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm.

- Lớp thứ 1 (lớp đựng mẫu bệnh phẩm): Có thể là hộp nhựa cứng có nắp xoáy, đảm bảo không rò rỉ, không thấm nước, không dễ vỡ, được đóng kín, dán nhãn bên ngoài (loại mẫu, ngày, chủ gia súc, nơi lấy mẫu,..).

Lớp thứ nhất được bao bằng vật liệu dễ thấm hút (bông, giấy thấm,...) đặt vào trong lớp thứ 2. Nếu có nhiều ống đựng mẫu thì mỗi ống cần được bao, bọc riêng để tránh tiếp xúc và có lớp vật liệu thấm hút bên ngoài.

- Lớp thứ 2: bảo vệ lớp thứ 1, có thể là hộp nhựa hoặc túi ni-lon, đảm bảo không rò rỉ, không thấm nước, không dễ vỡ, được đóng kín, dán nhãn ghi thông tin mẫu ở bên ngoài (loại mẫu, ngày, chủ gia súc, nơi lấy mẫu,..). Giữa lớp thứ 1 và thứ 2 có lớp vật liệu thấm hút để tránh rò rỉ mẫu.

- Lớp thứ 3 (là lớp ngoài cùng): bao quanh lớp thứ 2, có thể là thùng bảo ôn hoặc hộp xốp, đảm bảo đủ cứng, không bục vỡ mẫu trong quá trình vận chuyển. Bên ngoài lớp thứ 3 cần được ghi nhãn đảm bảo các thông tin: Thông tin của người gửi mẫu (Tên, số điện thoại, địa chỉ); Thông tin của người nhận mẫu (Tên, số điện thoại, địa chỉ); Có thể thêm số điện thoại khẩn cấp của người chịu trách nhiệm mẫu bệnh phẩm; Nhãn cảnh báo mẫu.

CHÚ THÍCH: Trong quá trình đóng gói và vận chuyển, nếu dùng đá chuyên dụng để đảm bảo nhiệt độ bảo quản thì có thể để đá ở giữa lớp thứ 1 và lớp thứ 2 hoặc giữa lớp thứ 2 và lớp thứ 3.

7.2  Nuôi cấy mẫu và phân lập B. anthracis

7.2.1  Chuẩn bị và nuôi cấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm phải được xử lý trong buồng cấy an toàn sinh học cấp II (5.23). Với bệnh phẩm được lấy trong khoảng 48 h kể từ khi gia súc chết, cấy vào môi trường thạch máu (4.5) và ống môi trường BHI (4.4). Với bệnh phẩm được lấy sau 48 h kể từ khi gia súc chết, cấy vào môi trường thạch máu (4.5), ống môi trường BHI (4.4) và thạch PLET (4.6). Thực hiện như sau:

- Mẫu bệnh phẩm là máu: Dùng pipet (5.12) chuyển máu vào đĩa petri thạch máu (4.5), thạch PLET (4.6) và ống môi trường BHI (4.4) với lượng từ 30 μl đến 100 μl cho mỗi loại môi trường; sử dụng que cấy (5.15) để ria trên bề mặt thạch máu. Đặt ống môi trường BHI và đĩa thạch máu, thạch PLET đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm là dịch tiết: Lấy tăm bông đã có mẫu dịch hoặc dùng pank (5.19) kẹp bông đã được thấm mẫu dịch tiết phết lên đĩa petri thạch máu (4.5), thạch PLET (4.6), sau đó cho tăm bông vào ống môi trường BHI (4.4); sử dụng que cấy (5.15) để ria mẫu trên bề mặt thạch máu. Đặt ống môi trường BHI và đĩa thạch máu, thạch PLET đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm là da tai: Dùng pank và kéo (5.19) để cắt nhỏ mẫu da tai, thêm dung dịch muối sinh lý (4.13) hoặc dung dịch PBS vào mẫu da tai đã cắt nhỏ theo tỷ lệ thể tích 1 : 9 (1 phần bệnh phẩm và 9 phần dung dịch), đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (5.20) thành huyễn dịch. Dùng pipet (5.12) chuyển huyễn dịch vào đĩa petri thạch máu (4.5), thạch PLET (4.6) và ống môi trường BHI (4.4) với lượng từ 30 μl đến 100 μl cho mỗi loại môi trường: sử dụng que cấy (5.15) để ria mẫu trên bề mặt thạch máu. Đặt các ống môi trường BHI và đĩa thạch máu, thạch PLET đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm là lách: Dùng bông cồn (5.16) để khử trùng bề mặt ngoài của lách, dùng kéo (5.19) cắt 1 mẩu lách phết lên đĩa petri thạch máu (4.5), thạch PLET (4.6) và cho mẩu lách vào ống môi trường BHI (4.4); sử dụng que cấy (5.15) để ria mẫu trên bề mặt thạch máu. Đặt các ống môi trường BHI và đĩa thạch máu, thạch PLET đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm da, lông, xương: Cân mẫu, thêm dung dịch muối sinh lý (4.13) hoặc dung dịch PBS theo tỷ lệ thể tích 1 : 9 (1 phần bệnh phẩm và 9 phần dung dịch) đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (5.20) thành huyễn dịch:

+ Ria huyễn dịch trên bề mặt thạch máu (4.5), thạch PLET (4.6) bằng que cấy (5.15). Dùng que cấy (5.15) chuyển huyễn dịch vào ống môi trường BHI (4.4). Đặt các ống môi trường BHI và đĩa thạch máu, thạch PLET đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

+ Ria huyễn dịch trên bề mặt thạch máu bicacbonat (4.7) bằng que cấy (5.15). Ủ đĩa petri thạch máu bicacbonat đã cấy mẫu ở 37 °C trong 24 h, trong điều kiện có từ 10 % đến 20 % khí CO₂.

+ Làm sốc nhiệt phần huyễn dịch còn lại trong nồi cách thủy hoặc bể điều nhiệt (5.10) ở 62,5 °C ± 0,5 °C trong 15 min hoặc thêm một lượng tương đương etanol 95 % đến 100 % vào huyễn dịch và để trong vòng 1 h. Sau đó, dùng que cấy (5.15) ria huyễn dịch trên bề mặt thạch máu (4.5) và cấy huyễn dịch vào ống môi trường BHI (4.4). Đặt các ống môi trường BHI và đĩa thạch máu đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

7.2.2  Phân lập B. anthracis

Đọc kết quả nuôi cấy vi khuẩn sau 18 h đến 24 h (hoặc 24 h đến 48 h với nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu bicacbonat).

- Trên môi trường BHI: Sau khi nuôi cấy từ 18 h đến 24 h, B. anthracis mọc tạo thành cặn dính dưới đáy ống nghiệm, lắc có vẩn bông như sương mù, có mùi thơm của bánh bích quy bơ.

- Trên môi trường thạch máu: Sau 18 h đến 24 h, khuẩn lạc của B. anthracis có màu trắng xám, dạng R, không gây dung huyết. Dùng que cấy dễ dàng lấy toàn bộ khuẩn lạc lên khỏi mặt thạch.

- Trên môi trường thạch PLET: Sau 18 h đến 24 h khuẩn lạc của B. anthracis màu trắng kem, xù xì.

- Trên môi trường thạch máu bicacbonat: Sau 24 h đến 48 h nuôi cấy, khuẩn lạc của B. anthracis có dạng R hoặc dạng M.

CHÚ THÍCH: Khuẩn lạc dạng R - Rough là hình thái khuẩn lạc có bề mặt dẹt, nhám, xù xì; Khuẩn lạc dạng M - Mucous là hình thái khuẩn lạc có bề mặt hơi vồng, nhảy, ướt, rìa gọn.

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis đã mọc trên môi trường thạch máu, môi trường thạch PLET, môi trường thạch máu bicacbonat cấy lại lên môi trường thạch máu (4.5), môi trường BHI (4.4) để tiến hành xác định vi khuẩn.

7.3  Xác định hình thái B. anthracis

Việc làm tiêu bản để xác định hình thái B. anthracis phải được thực hiện trong buồng cấy an toàn sinh học cấp II (5.23).

7.3.1  Xác định hình thái B. anthracis từ bệnh phẩm

Làm tiêu bản:

- Tiêu bản máu: Dùng bơm tiêm (5.17) hoặc pipet (5.12) nhỏ một giọt máu lên phiến kính sạch (5.18). Sau đó dàn mỏng, đều bằng phiến kính khác, để khô.

- Tiêu bản lách: Dùng pank, kéo (5.19) cắt một mẩu lách nhỏ, rồi phết lên phiến kính (5.18), để khô.

- Tiêu bản da tai: Dùng pank, kéo (5.19) cắt một mẩu da tai, rồi phết lên phiến kính (5.18), để khô.

Cố định tiêu bản bằng cồn metanol nguyên chất (xem Phụ lục A.1)

Nhuộm tiêu bản: Bằng phương pháp Giemsa (xem Phụ lục A.1) hoặc phương pháp M’Fadyean (xem Phụ lục A.2) hoặc phương pháp Gram (xem Phụ lục A.3).

Đọc tiêu bản:

- Tiêu bản nhuộm Giemsa: B. anthracis có dạng trực khuẩn, hai đầu vuông, đứng thành cặp hay tập trung thành chuỗi ngắn. Giáp mô bắt màu hồng, vi khuẩn bắt màu xanh.

- Tiêu bản nhuộm M’Fadyean: B. anthracis thường đứng cặp đôi hay thành chuỗi ngắn, hai đầu vuông. Giáp mô bắt màu hồng, vi khuẩn bắt màu xanh đen.

- Tiêu bản nhuộm Gram: B. anthracis bắt màu tím, đứng cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu vuông.

7.3.2  Xác định hình thái B. anthracis từ môi trường nuôi cấy

Làm tiêu bản:

- Tiêu bản kiểm tra hình thái vi khuẩn: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (4.13) trên phiến kính (5.18), dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu hoặc thạch PLET (xem 7.2.2) và trộn đều, hoặc lấy một vòng que cấy (5.15) canh trùng từ ống môi trường BHI đã nuôi cấy mẫu (xem 7.2.2) dàn mỏng lên trên phiến kính (5.18). Để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.

- Tiêu bản kiểm tra giáp mô: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (4.13) trên phiến kính (5.18), dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch PLET hoặc môi trường thạch máu bicacbonat (xem 7.2.2) và trộn đều. Để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.

Nhuộm tiêu bản:

- Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A.3) để quan sát hình thái vi khuẩn.

- Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Giemsa (xem Phụ lục A.1) hoặc phương pháp M’Fadyean (xem Phụ lục A.2) để quan sát giáp mô.

Soi tiêu bản:

- Tiêu bản nhuộm Gram: B. anthracis bắt màu tím, đứng cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu vuông (tiêu bản làm từ canh trùng thấy vi khuẩn xếp thành chuỗi dài).

- Tiêu bản nhuộm Giemsa: B. anthracis có dạng trực khuẩn, hai đầu vuông, đứng thành cặp hay tập trung thành chuỗi ngắn. Giáp mô bắt màu hồng, vi khuẩn bắt màu xanh.

- Tiêu bản nhuộm M’Fadyean: B. anthracis thường đứng cặp đôi hay thành chuỗi, hai đầu vuông. Giáp mô bắt màu hồng, vi khuẩn bắt màu xanh đen.

7.4  Xác định đặc tính của B. anthracis

7.4.1  Xác định khả năng di động của B. anthracis

Cách tiến hành:

- Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis đã được nuôi cấy (7.2.2), chích thẳng xuống gần đáy ống nghiệm có môi trường thạch lỏng (xem Phụ lục B.5).

- Ủ môi trường đã cấy vào trong tủ ấm (5.1) ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, sau 18 h đến 24 h đọc kết quả nuôi cấy.

- Đọc kết quả:

Phản ứng dương tính (vi khuẩn có khả năng di động): Khi môi trường nuôi cấy bị đục, không nhìn thấy đường kính chích sâu;

Phản ứng âm tính (vi khuẩn không có khả năng di động): Khi môi trường nuôi cấy trong, nhìn thấy đường kính chích sâu.

CHÚ THÍCH: Xác định khả năng di động của vi khuẩn có thể dùng môi trường SIM (Sulfide Indole Motiliy) thương mại.

7.4.2  Xác định B. anthracis bằng phản ứng ly giải Gamma phage

Nguyên lý: Sử dụng Gamma phage (thực khuẩn thể gamma) là một loại virus có khả năng xâm nhập đặc hiệu vào tế bào vi khuẩn B. anthracis và gây phá hủy (ly giải) tế bào vi khuẩn.

Cách tiến hành: Xem Phụ lục D.

Đọc kết quả: Phản ứng dương tính khi trên bề mặt môi trường nuôi cấy B. anthracis xuất hiện các mảng vô khuẩn.

7.4.3  Xác định sự mẫn cảm của B. anthracis với penicillin

B. anthracis thường mẫn cảm với kháng sinh penicillin. Đây là đặc điểm khác với các loài Bacillus khác.

Cách tiến hành: Xem Phụ lục C.

Đọc kết quả: B. anthracis mẫn cảm với kháng sinh penicillin, vòng vô khuẩn đo được thường lớn hơn hoặc bằng 29 mm.

7.5  Xác định độc lực của B. anthracis bằng phương pháp PCR

7.5.1  Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện yếu tố pXO1 và pXO2. Hai yếu tố này cần thiết để B. anthracis gây bệnh. Plasmid pXO1 chứa các gen mã hóa cho độc tố và plasmid pXO2 chứa gen cho sự tổng hợp giáp mô của B. anthracis.

7.5.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu để tách chiết ADN của B. anthracis là canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis (xem 7.2.2).

7.5.3  Tách chiết ADN

Tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt (xem Phụ lục E.2) hoặc tách chiết ADN bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kit tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) 1).

7.5.4  Cách tiến hành

Xác định B. anthracis bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 1 và Bảng E.2 (xem Phụ lục E).

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được quy định tại Phụ lục E.

Bảng 1 - Cặp mồi xác định B. anthracis ^[2]

Gen đích	Tên mồi	Trình tự từ đầu 5’ tới 3’	Kích thước sản phẩm (bp)
Kháng nguyên bảo hộ (PA)	PA 5 3048-3029	TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG	596
	PA 5 2452-2471	GAG-GTA-GAA-GGA-TAT-ACG-GT
Giáp mô	1234 1411-1430	CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG	846
	1301 2257-2238	TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG

7.5.5  Đọc kết quả

Xem Phụ lục E.6

- Phản ứng được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương tính có vạch đúng kích cỡ sản phẩm (sản phẩm 596 bp đối với yếu tố pXO1 và 846 bp đối với yếu tố pXO2); mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm.

- Mẫu được coi là dương tính khi có vạch sản phẩm giống đối chứng dương; và âm tính khi không có vạch sản phẩm giống đối chứng âm.

- Đánh giá kết quả: Mẫu có B. anthracis được coi là có khả năng gây bệnh khi dương tính cả 2 yếu tố pXO1 và pXO2.

7.6  Xác định B. anthracis bằng phương pháp Realtime PCR sử dụng Sybr Green phát hiện gen rpoB

7.6.1  Nguyên tắc

Phát hiện plasmid pXO1 và plasmid pXO2 của các chủng B. anthracis đôi khi bị thiếu một plasmid hoặc thiếu cả hai plasmid nên rất khó khăn khi kết luận bệnh vì plasmid không ổn định. Do đó, việc sử dụng gen rpoB trên nhiễm sắc thể đặc hiệu (chromosomal marker) để cải thiện sự ổn định và phát hiện chính xác các chủng B. anthracis.

Phương pháp Realtime PCR sử dụng Sybr Green phát hiện gen rpoB dựa vào sự khuếch đại gen đích (gen rpoB) của B. anthracis. Sybr Green sẽ gắn vào sản phẩm ADN và tín hiệu huỳnh quang tăng tỷ lệ thuận với sản phẩm ADN khi được nhân lên.

7.6.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu để tách chiết ADN của B. anthracis là canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis (xem 7.2.2), hoặc từ bệnh phẩm nghi ngờ có B. anthracis.

7.6.3  Tách chiết ADN

Xem Phụ lục F.2.

Tách chiết ADN bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) 2).

7.6.4  Cách tiến hành

Xác định B. anthracis bằng phương pháp Realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu (xem Bảng F.1), các bước tiến hành, thành phần phản ứng (xem Bảng F.2) và chu trình nhiệt (xem Bảng F.3) được nêu tại Phụ lục F.

7.6.5  Đọc kết quả

Xem Phụ lục F.5.

Đánh giá kết quả: Mẫu kiểm tra có B. anthracis khi kết quả Realtime PCR dương tính.

7.7  Xác định độc lực của B. anthracis bằng phương pháp Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan

7.7.1  Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng cặp mồi và mẫu dò để phát hiện yếu tố gây chết (Lethal factor) gen nằm trên plasmid pXO1, giáp mô (capsule B - capB) gen nằm trên plasmid pXO2 và gen nằm trên nhiễm sắc thể (BA1 - chromosome) để phát hiện chính xác các chủng B. anthracis có trong mẫu bệnh phẩm hoặc vi khuẩn nghi ngờ là B. anthracis.

7.7.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu để tách chiết ADN B. anthracis là canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis (xem 7.2.2), hoặc từ bệnh phẩm nghi ngờ có B. anthracis.

7.7.3  Tách chiết ADN

Xem Phụ lục G.2.

Tách chiết ADN bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) 3).

7.7.4  Tiến hành

Xác định B. anthracis bằng phương pháp Realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu (xem bảng G.1), các bước tiến hành, thành phần phản ứng (xem Bảng G.2) và chu trình nhiệt (xem Bảng G.3) được nêu tại Phụ lục G.

7.7.5  Đọc kết quả

Xem Phụ lục G.5.

Đánh giá kết quả: Mẫu kiểm tra dương tính với Bacillus anthracis có độc lực khi kết quả Realtime PCR dương tính với cả 3 gen yếu tố gây chết, capB và BA1 - chromosome.

8  Kết luận

Gia súc được kết luận mắc bệnh nhiệt thán khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và một trong các kết quả xác định sau đây:

- Kết quả ở điều 7.3 xác định trên tiêu bản máu có nhiều vi khuẩn hình trực khuẩn, hai đầu vuông, có giáp mô và kết quả ở điều 7.4 xác định được khả năng không di động, phản ứng gamma phage dương tính và khả năng mẫn cảm với kháng sinh penicillin của B. anthracis:

- Kết quả ở điều 7.5 dương tính, xác định được độc tố của B. anthracis bằng phương pháp PCR;

- Kết quả ở điều 7.6 hoặc điều 7.7 dương tính, xác định được B. anthracis bằng phương pháp Realtime PCR.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Các phương pháp nhuộm Bacillus anthracis

A.1  Phương pháp nhuộm Giemsa

A.1.1  Thuốc thử

Giemsa dạng bột 1 g

Glyxerin [C₃H₅(OH)₃] 60 ml

Metanol tuyệt đối (99,5 % phần thể tích) 60 ml

Làm nóng glyxerin khoảng 55 °C đến 60 °C bằng nồi cách thủy. Thêm thuốc nhuộm Giemsa, trộn đều và ủ trong 2 h, để nguội và thêm metanol. Phải pha chế thuốc thử Giemsa trước khi sử dụng 02 tuần. Khi sử dụng, pha loãng thuốc thử Giemsa theo tỷ lệ 1/10 (phần thể tích) trong dung dịch đệm phosphat 0,01 M (pH 7,0) và để 30 min.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.1.2  Cách tiến hành

Phết bệnh phẩm lên phiến kính sạch, cố định tiêu bản bằng metanol tuyệt đối trong 10 min.

Rửa nhanh, khoảng 5 s bằng nước.

Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để trong 20 min đến 30 min, rửa nhanh bằng nước và sấy khô.

A.1.3  Soi tiêu bản

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100 X.

A.2  Phương pháp nhuộm M’Fadyean

A.2.1  Các loại thuốc thử

Thuốc thử M’Fadyean (thuốc thử polycrom xanh metylen)

Dung dịch A

Xanh metylen (C₁₆H₁₈N₃SCl) 0,3 g

Etanol 95 % (phần thể tích) 30 ml

Dung dịch B

Kali hydroxit (KOH) 0,01 g

Nước 100 ml

Trộn dung dịch A vào dung dịch B, lắc đều.

Hỗn dịch được để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc lên. Thuốc thử M’Fadyean phải được chuẩn bị trước khi sử dụng ít nhất 1 năm.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử M'Fadyean thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2.2  Cách tiến hành

Phiết bệnh phẩm hoặc khuẩn lạc lên phiến kính sạch, cố định tiêu bản bằng metanol tuyệt đối hoặc etanol tuyệt đối trong 30 min đến 60 min hoặc để khô và cố định bằng nhiệt.

Nhỏ dung dịch polycrom xanh metylen cho ngập tiêu bản, để trong 30 s đến 60 s.

Sau đó rửa với nước hypoclorit (NaOCl) và để khô.

A.2.3  Soi tiêu bản

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100 X.

A.3  Phương pháp nhuộm Gram

A.3.1  Các loại thuốc thử

A.3.1.1  Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C25H30N3Cl)	2,0 g
Etanol 95 % (phần thể tích)	20,0 ml
Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O]	0,8 g
Nước cất	80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.3.1.2  Dung dịch fuchsin đậm đặc

Fuchsin basic (C20H20CIN3)	1 g
Etanol 95 % (phần thể tích)	10 ml
Phenol (C6H6O)	5 g
Nước cất	100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỷ lệ 1 : 10 (thể tích).

A.3.1.3  Dung dịch lugol

Kali iodua (KI)	2 g
Iốt (I2) tinh thể	1 g
Nước cất	200 ml

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.3.1.4  Cồn axeton

Etanol 95 % (thể tích) 3 phần

Axeton (C₂H₆O) 1 phần

A.3.2  Cách tiến hành

Phiết bệnh phẩm hoặc khuẩn lạc lên phiến kính sạch rồi cố định bằng cách hơ nhanh tiêu bản qua ngọn lửa đèn cồn.

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nhanh bằng nước và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nhanh bằng nước và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đỏ rửa bằng nước, thấm khô hoặc để khô.

A.3.3  Soi tiêu bản

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100 X.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy Bacillus anthracis

B.1  Môi trường BHI

Thành phần:

Môi trường BHI	3,7 g
Nước cất vừa đủ	100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: Có thể dùng môi trường BHI của hãng Merck (Cat. No. 110493) 4)

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường BHI theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Lắc đều và phân phối môi trường vào các ống nghiệm (5.13), mỗi ống khoảng 5 ml môi trường BHI.

Hấp tiệt trùng các ống nghiệm chứa môi trường BHI ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Đặt ít nhất một ống môi trường BHI vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, môi trường BHI trong, không đục và không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các ống nghiệm chứa môi trường BHI trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.2  Môi trường thạch máu

Thành phần: Sử dụng môi trường thương mại.

VÍ DỤ: Có thể dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886) ⁴⁾.

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản theo hướng dẫn của nhà sản xuất, phân phối vào các bình.

Đưa các bình chứa thạch máu vào nồi hấp (5.3) hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 20 min.

Để môi trường thạch máu cơ bản nguội đến khoảng 40 °C thì bổ sung từ 5 % đến 7 % thể tích máu.

Lắc trộn đều máu với môi trường thạch máu cơ bản và phân phối vào các đĩa petri (5.14) khoảng 20 ml/đĩa.

Đặt ít nhất một đĩa môi trường thạch máu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường thạch máu không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các đĩa thạch máu trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.3  Môi trường thạch PLET (polymyxin-lysozym-EDTA-tali (I) axetat)

Thành phần:

Môi trường BHI	3,7 g
EDTA	0,03 g
Tali (I) axetat (C2H3O2TI	0,04 g
Nước cất vừa đủ	100 ml
Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

Hòa tan các thành phần nêu trên và phân phối vào các bình chứa. Đưa các bình chứa môi trường vào nồi hấp (5.3) hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 20 min.

Để nguội, khi nhiệt độ của thạch xuống đến khoảng 50 °C thì bổ sung polymyxin B sulfat và lysozym với tỷ lệ như sau:

Polymyxin B sulfat	3 000 IU/100 ml
Lysozym	30 000 IU /100 ml

Lắc bình để trộn đều thạch với các thành phần bổ sung và phân phối vào các đĩa petri (5.14) khoảng 20 ml/đĩa.

Đặt ít nhất một đĩa môi trường thạch PLET vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường thạch PLET không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Sau đó bảo quản các đĩa thạch PLET trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.4  Môi trường thạch máu bicacbonat

Thành phần:

Môi trường thạch máu cơ bản	4 g
Nước cất vừa đủ	83 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản theo hướng dẫn của nhà sản xuất, đóng vào các bình.

Đưa các bình chứa môi trường thạch máu cơ bản vào nồi hấp (5.3) hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 20 min.

Để nhiệt độ môi trường thạch máu cơ bản giảm xuống khoảng 50 °C thì bổ sung các thành phần sau:

Máu vô trùng	7 ml
Dung dịch natri bicacbonat (NaHCO3) 7 %	10 ml

CHÚ THÍCH: Các thành phần bổ sung nên được duy trì khoảng 50 °C bằng nồi đun cách thủy trước khi bổ sung vào môi trường.

Lắc trộn đều các thành phần trên với thạch máu cơ bản và phân phối vào các đĩa petri (xem 5.14), khoảng 20 ml/đĩa.

Đặt ít nhất một đĩa môi trường thạch máu bicacbonat vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường thạch máu bicacbonat không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Sau đó bảo quản các đĩa môi trường thạch máu bicacbonat trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.5  Môi trường thạch lỏng

Thành phần môi trường thạch lỏng:

Môi trường pepton	10 g
Môi trường BHI	3 g
Natri clorua	5 g
Thạch (Agar)	4 g
Gelatin	80 g
Nước cất	1000 ml

Đun sôi các thành phần trên để tan hoàn toàn trong nước thành dạng dung dịch.

Phân phối dung dịch vào các ống nghiệm (5.13), mỗi ống khoảng 6 ml.

Đưa các ống nghiệm vào nồi hấp (5.3) hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 20 min.

Đặt ít nhất một ống môi trường thạch lỏng vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, môi trường thạch lỏng trong, không đục và không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Sau đó bảo quản các ống nghiệm này trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.6  Môi trường thạch kháng sinh

Thành phần:

Thạch Muller Hinton	3,7 g
Nước cất vừa đủ	100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: Có thể dùng môi trường thạch Muller Hinton của hãng Merck (Cat. No. 110493) 5)

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường thạch kháng sinh theo hướng dẫn của nhà sản xuất, phân phối vào các bình. Đưa các bình chứa thạch kháng sinh vào nồi hấp (5.3) hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 20 min.

Để môi trường thạch kháng sinh nguội đến khoảng 40 °C thì lắc đều và phân phối vào các đĩa petri (5.14), khoảng 20 ml/đĩa.

Đặt ít nhất một đĩa môi trường thạch kháng sinh vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường thạch kháng sinh không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các đĩa thạch kháng sinh trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.7  Môi trường bảo quản và vận chuyển mẫu (Môi trường Cary Blair)

Thành phần:

Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4)	1,1 g
Natri thioglycollat (C2H3NaO2S)	1,5 g
Natri clorua (NaCl)	5,0 g
Canxi clorua (CaCl2)	0,1 g
Nước cất	1000 ml
Chỉnh Ph = 8,4 ± 0,2 ở 25 °C

Có thể sử dụng môi trường thương mại đã pha sẵn hoặc môi trường tự pha chế, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Có thể dùng môi trường Cary Blair chế sẵn của hãng Aptaca (Cat. No. 309/SG); môi trường Cary Blair tự pha chế của hãng Himedia (Cat. No. M202) hoặc của hãng Alpha Biosciences (Cat. No. CO3-125) 6)

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường bảo quản và vận chuyển mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất, phân phối vào các bình. Đưa các bình chứa môi trường vào nồi hấp (5.3) hấp tiệt trùng ở 100 °C trong 15 min.

Để môi trường nguội đến khoảng 40 °C thì lắc đều và phân phối ra ống đựng mẫu khoảng 7 ml/ống có dung tích 9 ml có nắp vặn chặt.

Đặt ít nhất một ống môi trường vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, ống môi trường không đục, không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các ống môi trường trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.8  Môi trường BHI đậm đặc 10X

Thành phần:

Môi trường BHI	37 g
Nước cất vừa đủ	100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: Có thể dùng môi trường BHI của hãng Merck (Cat. No. 110493) 7)

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường BHI theo thành phần như trên.

Lắc đều và phân phối môi trường vào các ống nghiệm (5.13), mỗi ống khoảng 5 ml môi trường BHI đậm đặc 10 X.

Hấp tiệt trùng các ống nghiệm chứa môi trường BHI đậm đặc 10 X ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Đặt ít nhất một ống môi trường BHI đậm đặc 10 X vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, môi trường BHI đậm đặc 10 X trong, không đục và không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các ống nghiệm chứa môi trường BHI đậm đặc 10 X trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Xác định sự mẫn cảm của B. anthracis với penicillin

Vi khuẩn B. anthracis thường mẫn cảm với kháng sinh penicillin. Đây là đặc điểm khác với các loài Bacillus khác.

Cách tiến hành:

- Dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis đã được nuôi cấy (xem 7.2.2) đưa vào ống nghiệm chứa 1,5 ml môi trường BHI vô trùng, nuôi cấy hiếu khí ở 37 °C trong khoảng từ 2 h đến 4 h. Điều chỉnh độ đục của canh khuẩn để đạt được nồng độ vi khuẩn tương đương với độ đục McFarland 0,5.

- Dùng tăm bông vô trùng lấy canh khuẩn B. anthracis có độ đục McFarland 0,5 láng đều lên toàn bộ bề mặt của đĩa petri thạch Mueller Hinton hoặc thạch máu. Đặt khoanh giấy tẩm kháng sinh penicillin G 10 IU lên đĩa thạch và ấn nhẹ để đảm bảo khoanh giấy tẩm kháng sinh tiếp xúc với mặt thạch. Đặt đĩa thạch này vào trong tủ ấm ở 37 °C với điều kiện hiếu khí, trong khoảng từ 18 h đến 24 h.

CHÚ THÍCH: Sử dụng Bacilus cereus là một đối chứng kháng với kháng sinh penicillin và vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 29213 là chủng mẫn cảm với kháng sinh penicillin.

Đọc kết quả: Đo vòng vô khuẩn và đánh giá.

- Dương tính (mẫn cảm với kháng sinh penicillin): Vòng vô khuẩn lớn hơn hoặc bằng 29 mm;

- Âm tính (kháng với kháng sinh penicillin): Vòng vô khuẩn nhỏ hơn 29 mm.

 

Phụ lục D

(Quy định)

Xác định B. anthracis bằng phản ứng ly giải Gamma phage

D.1  Nguyên liệu

D.1.1  Vi khuẩn B. anthracis chủng vắc xin Sterne;

D.1.2  Chủng gamma phage;

D.1.3  Vi khuẩn kiểm tra là B. anthracis nghi ngờ.

D.2  Nhân giống Gamma phage

Quy trình nhân giống Gamma phage gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1:

- Bước 1: B. anthracis chủng vắc xin Sterne được cấy lên đĩa petri thạch máu (4.5), ủ ở 37 °C trong 18 h đến 24 h.

- Bước 2: Chọn khoảng 5 khuẩn lạc B. anthracis trên đĩa petri thạch máu (bước 1) cho vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trường BHI (4.4), ủ ở 37 °C trong khoảng 4 h, đảm bảo canh khuẩn đạt 10⁸ CFU/ml. Bảo quản canh khuẩn B. anthracis ở 4 °C để sử dụng tiếp ở bước 3 và bước 13.

- Bước 3: Nhỏ canh khuẩn B. anthracis (bước 2) lên 03 đĩa petri thạch máu (4.5), mỗi đĩa 100 μl canh khuẩn, láng đều. Ủ các đĩa ủ ở 37 °C trong 30 min đến 60 min.

- Bước 4: Nhỏ tiếp 100 μl dung dịch Gamma phage cần nhân lên. Ủ các đĩa ở 37 °C trong 18 h đến 24 h.

- Bước 5 (thu hoạch phage-lysed): Nhỏ 5 ml môi trường BHI (4.4) lên bề mặt 03 đĩa petri thạch máu (bước 4), dùng que cấy vô trùng gạt nhẹ trên bề mặt thạch. Sau đó dùng pipet chuyển toàn bộ phần dung dịch có trên mặt 03 đĩa petri thạch máu sang ống nghiệm vô trùng. Tiếp tục rửa lần hai 03 đĩa petri thạch máu với các thao tác lặp lại như trên. Ủ 10 ml phage-lysed thu được ở 37 °C trong điều kiện lắc từ 18 h đến 24 h.

- Bước 6: Ly tâm phage-lysed (bước 5) bằng máy ly tâm lạnh (5.25) ở gia tốc 2500 rpm trong 30 min, giữ lại nước trong và bỏ cặn. Nước trong được lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm. Ghi nhãn “Dung dịch phage giai đoạn 1”.

Giai đoạn 2:

- Bước 7: Láng B. anthracis chủng vắc xin Sterne trên 03 đĩa petri thạch máu (4.5) và ủ (thực hiện làm tương tự bước 3).

- Bước 8: Nhỏ tiếp “Dung dịch phage giai đoạn 1” (bước 6) lên 03 đĩa petri thạch máu ở bước 7, mỗi đĩa 100 μl dung dịch phage, láng đều, ủ ở 37 ^oC từ 18 h đến 24 h.

- Bước 9: Lấy 01 ml môi trường BHI đậm đặc 10 X (xem Phụ lục B.8) bổ sung vào 09 ml “Dung dịch phage giai đoạn 1” ở bước 6.

- Bước 10: Thu hoạch phage ở bước 8 bằng dung dịch ở bước 9.

Lấy 5 ml dung dịch thu được ở bước 9 nhỏ lên bề mặt của 03 đĩa petri thạch máu của bước 8;

Dùng que cấy vô trùng gạt nhẹ trên bề mặt thạch rồi dùng pipet hút thu lại sang ống nghiệm;

“Rửa” lại lần 2 bằng cách nhỏ 5 ml dung dịch của bước 9 lên bề mặt 03 đĩa thạch vừa thu phage, láng đều rồi dùng pipet hút thu lại sang ống nghiệm đã có dung dịch phage rửa lần 1.

- Bước 11: Dung dịch phage ở bước 10 được bổ sung thêm 10 ml môi trường BHI, ủ ở 37 °C có lắc trong 18 h đến 24 h;

- Bước 12: Phage-lysed ở bước 11 được ly tâm lạnh (sử dụng máy ly tâm lạnh) ở gia tốc 2500 rpm trong 30 min, giữ lại nước trong và bỏ cặn. Nước trong được lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm. Ghi nhãn “Dung dịch phage giai đoạn 2”.

Giai đoạn 3:

- Bước 13: Lấy 2,5 ml canh khuẩn ở bước 2 cho vào 100 ml môi trường BHI, nuôi cấy có lắc và ủ ở 37 °C cho đến khi canh trùng đục.

- Bước 14: Bổ sung thêm 20 ml dung dịch ở bước 12 và ủ ở 37 °C trong 18 h đến 24 h.

- Bước 15: Kiểm tra vô khuẩn và chuẩn độ

Kiểm tra vô khuẩn: Nhỏ 100 μl dung dịch thu được ở bước 14 lên đĩa petri thạch máu, láng đều, ủ ở 37 °C. Sau 18 h đến 24 h nếu không có khuẩn lạc mọc trên bề mặt môi trường là đạt yêu cầu về vô khuẩn.

Chuẩn độ:

Dung dịch ở bước 14 được pha loãng theo cơ số 10 với dung dịch PBS thành các nồng độ 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4,...;

Chuẩn bị thạch máu được láng với B. anthracis (giống bước 3):

Đếm số lượng PFU: Mỗi nồng độ pha loãng của dung dịch ở bước 14 được đếm số PFU trên bề mặt thạch máu đã có B. anthracis (giống bước 3) bằng cách nhỏ 100 μl nồng độ pha loãng/đĩa thạch máu, láng đều hoặc nhỏ giọt (20 μl/giọt). Ủ đĩa ở 37 °C trong 18 h đến 24 h;

Đọc kết quả: Dung dịch phage (dung dịch ở bước 14) được 10⁸ đến 10⁹ PFU/ml là đạt yêu cầu sử dụng.

Bảo quản dung dịch Gamma phage ở nhiệt độ từ 2 °C đến 4 °C.

D.3  Tiến hành phản ứng ly giải Gamma phage

- Vi khuẩn cần kiểm tra là B. anthracis nghi ngờ (xem 7.2.2), được nuôi cấy trong môi trường BHI để đạt được canh khuẩn có nồng độ 10⁸ CFU/ml;

- Lấy 100 μl canh khuẩn cần kiểm tra láng đều trên bề mặt thạch máu, ủ đĩa ở 37 °C trong 30 min đến 60 min;

- Lấy 100 μl dung dịch Gamma phage nhỏ (hoặc láng) lên bề mặt thạch máu đã cấy vi khuẩn cần kiểm tra, ủ đĩa ở 37 °C. Sau 18 h đến 24 h đọc kết quả.

D.4  Đọc kết quả

Phản ứng dương tính (vi khuẩn kiểm tra là B. anthracis) khi trên bề mặt môi trường có những mảng vô khuẩn (PFU).

 

Phụ lục E

(Quy định)

Xác định độc lực của B. anthracis bằng phương pháp PCR

E.1  Nguyên liệu cho phương pháp PCR

E.1.1  Taq PCR Master Mix Kit;

VÍ DỤ: Kít nhân gen Taq PCR Master Mix của hãng Qiagen (Cat. No. 201443), Kít nhân gen Dream Taq PCR Master Mix (2X) của hãng Thermo Scientific (Cat. No. K1071) 8).

E.1.2  Cặp mồi (primers): xem Bảng 1;

E.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

E.1.4  Dung dịch đệm điện di: có thể dùng dung dịch đệm TAE hoặc TBE;

E.1.5  Chất nhuộm màu ADN;

VÍ DỤ: Chất nhuộm màu SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen (Catalog number: S33102); hoặc chất nhuộm màu Gel Red của hãng Biotium (Catalog number: 41003) ⁸⁾.

CẢNH BÁO: Không sử dụng chất nhuộm màu ethidi bromua vì có thể gây ung thư.

E.1.6  Đệm tải mẫu (Loading dye);

E.1.7  ADN chuẩn (còn được gọi là Ladder, marker), thang 100 bp;

E.1.8  Dung dịch đệm TE.

E.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: là canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi là B. anthracis (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: là ADN của B. anthracis đã được xác định dương tính với pXO1 hoặc pXO2 hoặc dương tính với cả pXO1 và pXO2;

Mẫu đối chứng âm: Là nước tinh khiết không có nuclease.

Tách chiết ADN

Canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi là B. anthracis được tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt hoặc bằng kít thương mại.

- Phương pháp sốc nhiệt: Lấy 200 μl canh khuẩn hoặc lấy từ 1 khuẩn lạc đến 2 khuẩn lạc hòa vào 200 μl nước cất vô trùng. Đem bất hoạt vi khuẩn ở nhiệt độ 100 °C trong 60 min. Sau đó ly tâm ống canh khuẩn đã bất hoạt với gia tốc 8 000 g trong 5 min, bỏ cặn thu nước trong (thu lấy ADN) để tiến hành làm phản ứng PCR.

- Phương pháp tách chiết ADN bằng kít thương mại. Các bước tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

E.3  Chuẩn bị mồi

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: Ly tâm nhanh mồi gốc (đông khô) bằng máy ly tâm (5.5) với gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (E.1.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (E.1.3).

VÍ DỤ: Lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 80 μl nước tinh khiết sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μM.

E.4  Cách tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem E.3). Hỗn hợp phản ứng được pha trong ống eppendorf 1,5 ml và phân phối vào ống 0,2 ml (xem 5.21) với lượng 20 μl/ống.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít nhân gen Dream Taq PCR Master Mix (2X) của hãng Thermo Scientific (Cat. No. K1071) 9), thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng E.1.

Bảng E.1 - Thành phần của phản ứng PCR xác định B. anthracis

Thành phần	Thể tích (μl)
Dream Taq PCR Master Mix (2X)	12,5
Nước không có nuclease	5,5
Mồi xuôi pXO1 (20 μM)	0,5
Mồi ngược pXO1 (20 μM)	0,5
Mồi xuôi pXO2 (20 μM)	0,5
Mồi ngược pXO2 (20 μM)	0,5
Tổng thể tích	20,0

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN của B. anthracis vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: Cho 5 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (xem 5.6) với chu trình nhiệt như nêu trong Bảng E.2.

Bảng E.2 - Chu trình nhiệt xác định Bacillus anthracis

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
95 °C	2 min	1 vòng
95 °C	30 s	35 vòng
55 °C	30 s
72 °C	1 min
72 °C	7 min	1 vòng

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

E.5  Chạy điện di

Chạy điện di sản phẩm PCR (E.4) trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE có bổ sung chất nhuộm màu (E.1.5). Cách pha chế thạch agarose và bổ sung chất nhuộm màu theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Trộn đều 2 μl dung dịch đệm tải mẫu vào 8 μl sản phẩm PCR (E.4), cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Chạy điện di bản thạch trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) ở bộ điện di (5.8), trong thời gian từ 20 min đến 30 min, ở 100 V.

E.6  Đọc kết quả

Mẫu kiểm tra dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có vạch đúng kích cỡ của sản phẩm: với yếu tố pXO1 là 596 bp và với yếu tố pXO2 là 846 bp;

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch;

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Mẫu kiểm tra âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có vạch đúng kích cỡ của sản phẩm: Với yếu tố pXO1 là 596 bp và với yếu tố pXO2 là 846 bp;

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương.

 

Phụ lục F

(Tham khảo)

Xác định B. anthracis bằng phương pháp Realtime PCR sử dụng Sybr Green phát hiện gen rpoB

F.1  Nguyên liệu cho phương pháp Realtime PCR

F.1.1  Realtime Master Mix kit

VÍ DỤ: QuantiTect Sybr Green PCR kit (Cat. No. 204143), Platinum™ Sybr Green qPCR SuperMix-UDG (Cat. No. 11733046). 10)

F.1.2  Cặp mồi (primers): xem Bảng F.1.

Bảng F.1 - Cặp mồi xác định B. anthracis ^[2,6]

Gen đích	Tên mồi	Trình tự từ đầu 5’ tới 3’
rpoB	rpoBF1 primer	CCA CCA ACA GTA GAA AAT GCC
	rpoBR1 primer	AAA TTT CAC CAG TTT CTG GAT CT

F.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

F.1.4  Dung dịch đệm TE.

F.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: Là canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis (xem 7.2.2)

Mẫu đối chứng dương: Là ADN của vi khuẩn đã được xác định là B.anthracis;

Mẫu đối chứng âm: Là nước tinh khiết không có nuclease.

Tách chiết ADN

Canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi là B. anthracis được tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt hoặc bằng kít thương mại.

- Phương pháp sốc nhiệt: Lấy 200 μl canh khuẩn hoặc lấy từ 1 khuẩn lạc đến 2 khuẩn lạc hòa vào 200 μl nước cất vô trùng. Đem bất hoạt vi khuẩn ở nhiệt độ 100 °C trong 60 min. Sau đó ly tâm ống canh khuẩn đã bất hoạt với gia tốc 8000 g trong 5 min, bỏ cặn thu nước trong (thu lấy ADN) để tiến hành làm phản ứng PCR.

- Phương pháp tách chiết ADN bằng kit thương mại. Các bước tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002). 11)

F.3  Chuẩn bị mồi

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: Ly tâm nhanh mồi gốc (đông khô) bằng máy ly tâm (5.5) với gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (F.1.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (F.1.3).

VÍ DỤ: Lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 90 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 10 μM.

F.4  Cách tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem F.3). Hỗn hợp phản ứng được pha trong ống eppendorf 1,5 ml và phân phối vào ống 0,2 ml (xem 5.21) với lượng 20 μl/ống.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Platinum™ Sybr Green qPCR SuperMix-UDG (Cat. No. 11733046) ¹¹⁾, thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng F.2.

Bảng F.2 - Thành phần của phản ứng Realtime PCR xác định B. anthracis

Thành phần	Thể tích (μl)
Platinum™ Sybr Green qPCR SuperMix-UDG	12,5
Nước không có nuclease	6,4
Mồi xuôi 10 μM	0,5
Mồi ngược 10 μM	0,5
Thuốc nhuộm ROX (dye) 50 nM	0,1
Tổng thể tích	20

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN của B. anthracis vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: Cho 5 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng Realtime PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy Realtime PCR (5.7) với chu trình nhiệt như nêu trong Bảng F.3.

Bảng F.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR xác định Bacillus anthracis

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C	2 min	1 vòng
95 °C	2 min	1 vòng
95 °C	15 s	40 vòng
60 °C (“)	30 s
65 °C (“)	5 s	1 vòng
95 °C	5 s
(“) Thời điểm ghi nhận tín hiệu huỳnh quang. CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

F.5  Đọc kết quả

- Đánh giá kết quả của phản ứng Realtime PCR sử dụng Sybr Green được xác định dựa vào vào chu kỳ ngưỡng (Ct) và đường cong nóng chảy (Tm).

- Phản ứng được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct) và Tm đã biết (Tm = 77 °C); Mẫu đối chứng âm không có Ct và Tm.

+ Mẫu kiểm tra dương tính khi kết quả Realtime PCR có Ct < 35 và;

+ Mẫu kiểm tra âm tính khi khi kết quả Realtime PCR không có Ct và Tm;

+ Mẫu nghi ngờ khi kết quả Realtime PCR có 35 < Ct < 40 và Tm = 77 °C;

Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

 

Phụ lục G

(Tham khảo)

Xác định độc lực của B. anthracis bằng phương pháp Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan

G.1  Nguyên liệu cho phương pháp Realtime PCR

G.1.1  Realtime Master Mix kit

VÍ DỤ: QuantiTect Probe PCR kit (Cat. No. 204343), Platinum™ Quantitative PCR SuperMix-UDG (Cat. No. 11730025) 12)

G.1.2  Cặp mồi và mẫu dò (primers và probes): xem Bảng G.1.

Bảng G.1 - Cặp mồi và cặp mẫu dò xác định B. anthracis ^[8,9]

Gen đích	Tên mồi	Trình tự từ đầu 5’ tới 3’
Yếu tố gây chết (Lethal factor)	Lethal factor foward	CACTATCAACACTGGAGCGATTCT
	Lethal factor reverse	AATTATGTCATCTTTCTTTGGCTCAA
	Lethal factor probe	6FAM- AGCTGCAGATTCC-BHQ
capB	capB foward	TAAGCCTGCGTTCTTCGTAAATG
	capB reverse	GTTCCCAAATACGTAATGTTGATGAG
	capB probe	6FAM- TTGCAGCGAATGAT-BHQ
BA-1 chromosome	BA-1 chromosome foward	GTACATCTTCTAGCTGTTGCAA
	BA-1 chromosome reverse	ACGTAGGAAGACCGTTGATTA
	BA-1 chromosome probe	6FAM- CGTTGTTGTGTATTTG-BHQ

G.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

G.1.4  Dung dịch đệm TE.

G.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: Là canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là B. anthracis (xem 7.2.2) hoặc là bệnh phẩm nghi ngờ có B. anthracis;

Mẫu đối chứng dương: là ADN của B. anthracis đã được xác định là dương tính với gen yếu tố gây chết hoặc dương tính với gen capB hoặc dương tính với gen BA-1 chromosome hoặc dương tính với cả 03 gen (yếu tố gây chết, capB và BA-1 chromosome).

Mẫu đối chứng âm: là nước tinh khiết không có nuclease.

Tách chiết ADN

Canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi là B. anthracis được tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt hoặc bằng kít thương mại.

- Phương pháp sốc nhiệt: Lấy 200 μl canh khuẩn hoặc lấy từ 1 khuẩn lạc đến 2 khuẩn lạc hòa vào 200 μl nước cất vô trùng. Đem bất hoạt vi khuẩn ở nhiệt độ 100 °C trong 60 min. Sau đó ly tâm ống canh khuẩn đã bất hoạt với gia tốc 8000 g trong 5 min, bỏ cặn thu nước trong (thu lấy ADN) để tiến hành làm phản ứng PCR.

- Phương pháp tách chiết ADN bằng kít thương mại. Các bước tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Mẫu bệnh phẩm nghi ngờ có B. anthracis được hòa mẫu với nước muối sinh lý (4.13) hoặc dung dịch PBS theo tỷ lệ thể tích 1 : 9 (1 phần bệnh phẩm và 9 phần nước muối sinh lý), đem đập dập hoặc nghiền (5.20). Thu huyễn dịch đem bất hoạt vi khuẩn ở nhiệt độ 100 °C trong 15 min. Ly tâm ống huyễn dịch bệnh phẩm đã bất hoạt bởi nhiệt với gia tốc 8000 g trong 5 min, bỏ cặn thu nước trong. Sau đó đem tách ADN bằng kit thương mại. Các bước tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kit tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) 13).

G.3  Chuẩn bị mồi

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: Mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.5) ở gia tốc 6000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (G.1.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm mồi gốc, mẫu dò gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 10 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (G.1.3).

VÍ DỤ: Lấy 10 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 90 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 10 μM.

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10 μM: Pha loãng mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (G.1.3).

VÍ DỤ: Lấy 10 μl mồi gốc có nồng độ 100 μM và thêm 90 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 10 μM.

G.4  Cách tiến hành

Phản ứng Realtime PCR phát hiện 03 gen của B. anthracis được thực hiện trong 03 ống riêng biệt (mỗi ống sẽ có thành phần PCR phát hiện một gen tương ứng với cặp mồi và mẫu dò sử dụng).

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (xem G.3).

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen QuantiTect Probe PCR kit (Cat. No. 204343) 14), thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng G.2.

Bảng G.2 - Thành phần của phản ứng Realtime PCR xác định B. anthracis

Thành phần	Thể tích (μl)
QuantiTect Probe PCR kít	12,5
Nước không có nuclease	4,05
Mồi xuôi 10 μM	0,6
Mồi ngược 10 μM	0,6
Mẫu dò 10 μM	0,25
Tổng thể tích	18,0

Chuyển 18 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 2 μl mẫu ADN của B. anthracis vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 2 μl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: Cho 2 μl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng Realtime PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng Realtime PCR bằng máy Realtime PCR (5.7) với chu trình nhiệt như nêu trong Bảng G.3.

Bảng G.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR xác định B. anthracis

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C	2 min	1 vòng
95 °C	15 min	1 vòng
94 °C	15 s	45 vòng
60 °C (“)	1 min
(“) Thời điểm ghi nhận tín hiệu huỳnh quang. CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

G.5  Đọc kết quả

Kết quả của phản ứng Realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Ct).

Phản ứng được công nhận khi mẫu đối chứng dương của yếu tố gây chết, mẫu đối chứng dương của capB và mẫu đối chứng dương của BA1 - chromosome (được chuẩn độ trước) phải có các giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct); mẫu đối chứng âm không có Ct.

+ Với yếu tố gây chết:

Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40;

Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct;

Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.

+ Với yếu tố giáp mô (capB):

Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40;

Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct;

Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.

+ Với BA -1 chromosome:

Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40;

Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct;

Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.

- Đánh giá kết quả:

Mẫu kiểm tra dương tính với B. anthracis có độc lực khi kết quả Realtime PCR dương tính với cả 3 gen yếu tố gây chết, capB và BA1 - chromosome.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE, 2018. Mannual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.1.1, Anthrax.

[2] Thông tư số 41/2016/TT-BYT của Bộ Y tế ngày 14 tháng 11 năm 2016 Ban hành Danh mục vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và cấp độ an toàn sinh học phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm.

[3] Cục Y tế dự phòng - Bộ Y tế, 2017. Hướng dẫn lấy mẫu, đóng gói, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm truyền nhiễm, trang 12 - 14.

[4] World Health Organization Regional Office for South-East Asia New Delhi. Manual for Laboratory Diagnosis of Anthrax. http://www.searo.who.int/EN/Section10.

[5] Yuan Qi, Guy Patra, Xudong Liang, Leanne E. Williams, Sharon Rose, Rajendra and Vito G. Del Vecchio, 2001. Utilization of the rpoB gen as a specific chromosomal maker for realtime PCR detection of Bacillus anthracis. Applied and Environmental Microbiology, p. 3720 - 3727.

[6] Agnieszka Kedrak-Jablonska, Sylwia Budniak, Anna Szczawinska, Monika Reksa, Marek Krupa, Krzysztof Szulowski, 2018. Evaluation of realtime PCR base on SYBR Green I fluorescent dye for detection of Bacillus anthracis strains in biological sample. DOI:10.2478/jvetres-2018-0075, p. 549 - 554.

[7] Jason K. Blackburn, Matthew Van Ert, Jocelyn C. Mullins, Ted L. Hadfield, and Martin E. Hugh-Jones, 2014. The necrophagous fly anthrax transmission pathway: empirical and genetic evidence from wildlife epizootics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases DOI:10.1089/vbz2013.1538.

[8] Jason K. Blackburn, Moses Ode Odugbo, Matthew Van Ert, Bob O’Shea, Jocelyn Mullins, Vincent Perrenten, Angaya Maho, Martin Hugh-Jones, Ted Hadfield, 2015. Bacillus anthracis diversity and geographic potential across Nigeria, Camaroon and Chad: Further support of a Novel West African Lineage. PLOS Neglected Tropical Diseases | DOI:10.1371/journal.pntd.0003931.

[9] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. Chương 2: Bệnh truyền nhiễm chung giữa người và động vật - Phần 2: Bệnh nhiệt thán, trang 77 - 90.